Methodenartikel

Montage und Charakterisierung der biomolekularen Memristors bestehend aus Ionenkanal-dotierte Lipidmembranen

DOI:

10.3791/58998

⸱

9. März 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Joint Institute for Biological Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee, 3Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee, 4Department of Biosystems and Agriculture Engineering, University of Kentucky, 5Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Tennessee, 6Computer Science and Mathematics Division, Oak Ridge National Laboratory, 7Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weich, nutzen Niederleistungs-biomolekularen Memristoren ähnlicher Zusammensetzung, Struktur und Mechanismen der Bio-Synapsen umschalten. Hier vorgestellten wird ein Protokoll zu montieren und zu charakterisieren, biomolekulare Memristoren aus isolierenden Lipid Bilayer gebildet zwischen Wassertröpfchen in Öl gewonnen. Die Einbeziehung der Spannung aktiviert Alamethicin Peptide Ergebnisse in Memristive ionische Leitfähigkeit durch die Membran.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit zur synaptische Funktionalitäten in synthetischen Schaltkreiselemente neu unbedingt neuromorphen EDV-Systeme, die darauf abzielen, die kognitiven Kompetenzen des Gehirns mit vergleichbarer Effizienz und Dichte zu emulieren. Bisher haben Silizium-basierte 3-Terminal Transistoren und zwei-Terminal Memristors in neuromorphen Schaltungen, größtenteils aufgrund ihrer Fähigkeit zur Informationsverarbeitung und Speicher Zusammenlegung verbreitet. Doch diese Geräte die Vernetzung und die Komplexität des Gehirns erreichen können, weil sie sind machthungrigen, nicht wichtige synaptische Funktionalitäten zu imitieren, und leiden unter hohen Geräuschpegel und hohe Spannungen zu schalten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir entwickelt und charakterisiert eine biomolekularen Memristor, die Zusammensetzung, Struktur und Schaltverhalten der biologische Synapsen imitiert. Hier beschreiben wir den Prozess der Montage und Charakterisierung biomolekularen Memristoren bestehend aus einem 5 nm dicken Lipid Bilayer zwischen Lipid funktionalisiert Wassertröpfchen in Öl gebildet und mit Spannung aktiviert Alamethicin Peptide dotiert. Während ähnliche Versammlung Protokolle verwendet wurden, um die biophysikalische Eigenschaften von Tröpfchen unterstützt Lipidmembranen und Membrane-springen Ionenkanäle untersuchen, dieser Artikel konzentriert sich auf wesentliche Änderungen der Tröpfchen Bilayer Schnittstellenmethode für konsequente Memristor Performance zu erreichen. Speziell, beschreiben wir die Liposomen-Herstellungsverfahren und die Übernahme der Alamethicin Peptide in Lipid Bilayer Membranen und die entsprechenden Konzentrationen von jeden Bestandteil, sowie deren Auswirkungen auf die Gesamtreaktion der Memristoren. Wir beschreiben auch die Charakterisierung Prozess der biomolekularen Memristors, einschließlich Messung und Analyse von Memristive Strom-Spannungs-Beziehungen über zyklische Voltammetrie sowie kurzfristige Plastizität erhalten und lernen schrittweise als Reaktion auf Spannung Impulsfolgen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es ist allgemein anerkannt, daß biologische Synapsen verantwortlich für die hohe Effizienz und enorme Parallelität des Gehirns aufgrund ihrer Fähigkeit sind zu lernen und verarbeiten Informationen auf höchst anpassungsfähige Arten. Diese koordinierte Funktionalität ergibt sich aus mehreren, sehr komplexen molekularen Mechanismen diesem Laufwerk sowohl kurzfristige als auch langfristige synaptische Plastizität1,2,3,4,5. Neuromorphen-computing-Systeme wollen emulieren synaptische Funktionen auf Ebenen nähert sich die Dichte, Komplexität und Energieeffizienz des Gehirns, die notwendig sind, für die nächste Generation von Gehirn-wie Computer6,7 , 8. synaptische Funktionen mit Hilfe von traditionellen elektronischen Schaltelemente zu reproduzieren ist jedoch praktisch unmöglich9, stattdessen erfordert die Konstruktion und Herstellung der neuen Hardware-Elemente, die auf eingehende Signale anpassen können und erinnern Informationen Geschichten9. Diese Arten von Synapse-inspirierten Hardware sind als Mem-Elements9,10,11 (kurz für Speicherelemente), bekannt, die nach Di Ventra Et Al.9,11, passive, zwei-Terminal-Geräte, deren Widerstand, Kapazität oder Induktivität als Reaktion auf äußere Reize neu konfiguriert werden kann, und die vorherige Staaten11erinnern können. Um Energieverbräuche nähert sich in das Gehirn zu erreichen, sollten diese Elemente ähnliche Materialien und Mechanismen für die synaptische Plastizität12beschäftigen.

Bisher worden zwei-Terminal Memristoren13,14,15 überwiegend gebaut mit komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) Technologie, zeichnen sich durch hohe schaltende Spannungen und hohen Geräuschpegel. Diese Technologie skaliert nicht gut wegen hoher Stromverbrauch und geringe Dichte. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurden mehrere organische und Polymere Memristoren vor kurzem gebaut. Diese Geräte weisen jedoch deutlich langsamer Schaltdynamik durch zeitaufwendige Ion Diffusion durch ein leitfähiges Polymer-Matrix16,17. Infolgedessen sind die Mechanismen, mit denen beide CMOS-basierte und organischen Memristive Geräte Synapse-inspirierte Funktionen emulieren, hoch phänomenologische, umfasst nur wenige synaptische Funktionen wie Spike Timing abhängigen Plastizität (STDP) 18, während mit Blick auf andere wichtige Funktionen auch spielen eine entscheidende Rolle bei der Herstellung des Gehirns eines leistungsfähigen und effizienten Computers, z. B. präsynaptischen, kurzfristige Plastizität19.

Vor kurzem führten wir eine neue Klasse von Memristive Geräten12 mit Spannung aktiviert Peptide biomimetische Lipidmembranen gegründet, die imitiert, biomolekulare Zusammensetzung, Membran-Struktur und Ion Kanalumschaltung ausgelöst Mechanismen der biologischen Synapsen20.  Wir beschreiben hier, wie zu montieren und diese zwei-Terminal-Geräte, elektrisch zu verhören mit besonderem Schwerpunkt auf kurzfristige Plastizität für die Umsetzung in Online-Bewertung lernen Anwendungen12. Gerätemontage basiert auf die Tröpfchen Interface Bilayer (DIB)21 -Methode, die in den letzten Jahren weitgehend verwendet worden ist, um die Biophysik des Modells Membranen21 und Membrane-springen Ionen-Kanäle22,23zu studieren, 24, und als Bausteine für die Entwicklung der Reize reagierende Materialien25,26. Wir beschreiben Membranverfahren Montage- und Verhör im Detail für Interessenten in neuromorphen Anwendungen aber wenig Berufserfahrung in Biomaterialien oder Membran Biologie. Das Protokoll enthält auch eine vollständige Beschreibung des Verfahrens Charakterisierung, die ebenso wichtig wie der Montage, die dynamische und rekonfigurierbaren elektrischen Eigenschaften der Vorrichtung27gegeben ist. Die hier beschriebenen Verfahren und Vertreter Ergebnisse sind Grundlagen für eine neue Klasse von Low Cost, Low-Power, weiche Mem-Elemente basierend auf Lipid-Schnittstellen und andere Biomoleküle für Anwendungen im neuromorphen computing, autonome Strukturen und Systeme, auch adaptive Gehirn-Computer-Schnittstellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Allgemeine Anweisungen und Vorsichtsmaßnahmen

  1. Wählen Sie geeignete, unbeschädigte Messung/mischen Glaswaren (Fläschchen, Becher, etc.) und andere Labware (Spatel, Löffel, etc.) für den Einsatz.
  2. Mit Glaswaren sorgfältig durch, um Beschädigungen zu vermeiden, und Latex oder Nitril Handschuhe zur Vermeidung einer Kontamination der Glaswaren/Labware mit Rückständen von Fingerspitzen und zum Schutz Ihrer Haut.
  3. Saubere gewählten Glaswaren/Labware gründlich mit Wasser und Waschmittel-Lösung durch Schrubben mit einer weiche Flaschenbürste bis Sie sauber und alle Rückstände entfernt sind.
  4. Spülen Sie gründlich mit Leitungswasser und dann mit entionisiertem Wasser (DI). Platz am Wäscheständer an der Luft trocknen.
  5. Optional: Spülen Sie die gereinigten Gläser/Labware mit Isopropylalkohol (IPA, 99,5 %) und legen Sie unter Vakuum verdampfen alle verbleibenden IPA um sicherzustellen, dass sie frei von Verunreinigungen (~ 2 h). Entfernen von Vakuumkammer und in sauberer Umgebung.
    Hinweis: Verwenden Sie fusselfrei Tücher zum Abwischen von Glaswaren und Laborartikel. Kaufen Sie und benutzen Sie sterile kleinen Glasfläschchen und Safe-Lock Tubes für Materialien Vorbereitung und Sample-Speicher. Weitere Details über Glaswaren, Reinigung und andere Labor Standard Operating Procedures finden Sie in der Jupiter Science Education Database-28.

2. Vorbereitung des wässrigen Pufferlösung

  1. Latex oder Nitril Handschuhe, wählen Sie eine geeignete und saubere Glasbehälter, 50 mL wässrige Puffer vorzubereiten (500 mM Natriumchlorid (KCl), 10 mM 3-(N-Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS), pH 7,0).
  2. Mit einer Massenbilanz digital, hohe Präzision und einem sauberen Spatel, verzichten Sie 1,86378 g KCl auf sauber mit einem Gewicht von Papier zu und fügen Sie den Glasbehälter.
    Hinweis: Die Beträge von KCl und MOPS sollte variieren je nach der gewünschten Lautstärke und Endkonzentrationen gewünscht.
  3. Wiegen Sie 0,10463 g von MOPS und verleihen Sie den Glasbehälter. Fügen Sie dann 50 mL VE-Wasser zu den Glasbehälter und Vortex gründlich bis KCl und MOPS vollständig gelöst sind.
  4. Lagern Sie die Pufferlösung bei Raumtemperatur und verwenden Sie, wenn nötig.
    Hinweis: Während Pufferlösungen für relativ lange Zeiträume gespeichert werden können, wird empfohlen, frisch zubereitete Pufferlösungen für bessere und gleichmäßigere Ergebnisse zu verwenden.

3. Vorbereitung der Liposomen

Hinweis: Schritt 3.1 gilt nur, wenn Phospholipide als lyophilisierte Pulver erworben werden, und daher können übersprungen werden, wenn die Phospholipide in Chloroform gekauft werden.

  1. 5 mg 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) oder Gehirn Total Lipid-Extrakte (BTLE) Lipide in 1 mL Chloroform in einer 5 mL sterile Glas-Durchstechflasche auflösen.
  2. Während sanft wirbeln, verdunsten Sie das Chloroform unter einen sanften Strom von trockenem Stickstoff bis ein Lipid-Film an der Unterseite der Flasche bleibt.
  3. Legen Sie das Fläschchen mit der Lipid-Film unter Vakuum für 10-12 h, um vollständige Entfernung der restlichen Chloroform zu ermöglichen.
  4. Entfernen Sie das Fläschchen aus der Vakuumkammer und rehydrieren Sie die Lipid-Film durch Zugabe von 10 mL der wässrigen Pufferlösung vorbereitet in Schritt2 eine abschließende Lipidkonzentration von 2 mg/mL zu erreichen.
  5. Einfrieren (-20 °C) und vollständig Auftauen der Lipid-Suspension sechsmal multilamellar Liposomen Montage zu erleichtern.
    Hinweis: Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur, nie in einem beheizten Umfeld Auftauen.
  6. Extrudieren Sie mit Hilfe eines handelsüblichen Extruders, die Liposomen-Lösung durch die komplette Lipid-Aussetzung durch eine 0,1 μm Pore Durchmesser Track-etched Membran zu erzwingen. Extrudieren Sie die Suspension 11mal in unmittelbarer Folge Unilamellar Liposomen mit einem Durchmesser von c.a. 100 nm für richtige Lipid Monolage Bildung benötigt zu erhalten. Speichern der Liposomen-Aussetzung bei 4 °C und innerhalb von 1 Woche der Vorbereitung verwenden. Der Einfachheit halber beziehen sich auf die resultierende Liposomen-Lösung als "A".
    Hinweis: Für die Extrusion von BTLE Liposomen, ist der Forscher ermutigt zum Aufwärmen der Extruder, 45-50 °C höher als der Phasenübergang Temperatur der BTLE Lipide (~ 37 °C)23,29, um einfacher Extrusion zu ermöglichen. Hydratisiert BTLE Liposomen Suspensionen auch direkt (anstelle von Frost-Tau-wechseln und Extrusion) angefertigt werden können indem man das geschlossene Aussetzung Fläschchen in in einem Bad Sonikator bei 55 °C für ca. 15 min.

(4) Rekonstitution von Alamethicin Peptiden

Hinweis: Diese Vorgehensweise beschreibt den Prozess der Alamethicin Rekonstitution in Liposomen, eine Endkonzentration von 1 μM. Diese Konzentration ist ausreichend, ähnlich wie die zuvor veröffentlichten12nA-Ebene Ströme induzieren. Erhöhung der Peptid-Konzentration verringert die Schaltschwelle und erhöhen die Amplituden der Ströme induziert durch die angelegte Spannung29.

  1. Lösen Sie Alamethicin Peptide in Ethanol, eine Endkonzentration von 2,5 mg/mL, Wirbel kurz, gut mischen auf und bewahren Sie Vorratslösung im Gefrierschrank (-20 °C auf).
    Hinweis: Alamethicin Peptide werden in der Regel in Pulverform gekauft.
  2. Mischen Sie in einem 1,5 mL-Safe-Lock-Rohr 99 μl Lösung "A" mit 1 μl der Stammlösung Alamethicin, eine endgültige Alamethicin Konzentration von 13 μM in der Liposomen-Suspension zu erreichen.  Wirbel um gut zu mischen. Die daraus resultierenden Peptid-Liposomen-Lösung als "B" bezeichnet.
  3. Mix-117 μL der Lösung "A" mit 10 μl der Lösung B für eine endgültige Alamethicin Konzentration von 1 mM und dann Wirbel gut mischen. Die resultierende Lösung als "C" bezeichnet.
  4. Speichern der Lösungen " "B "" und " "C "" bei 4 °C und Nutzung nach Bedarf.

5. Vorbereitung des Agarose-gel

  1. Mit einer Massenbilanz digital, hohe Präzision und einem sauberen Spatel, ein sauberes Papier mit einem Gewicht von 0,5 g Agarose Pulver hinzufügen.
  2. Übertragung der Agarose 50 mL VE-Wasser hinzufügen und wog Agarose, ein sauberes Glas 100 mL-Becherglas.
    Hinweis: Dies wird eine 1 % (wt/Vol) Agarose-Gel-Lösung ergeben.
  3. Legen Sie ein sauberes rühren Magnet in das Glasgefäß und stellen Sie den Becher auf eine mitreißende Heizplatte.
  4. Bringen Sie unter Rühren die Mischung zum Kochen, bis Agarose komplett aufgelöst ist.
  5. Entfernen Sie das Becherglas von der Heizplatte auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Bei 4 °C lagern und bei Bedarf zu verwenden.
  6. Vor erneutem Gebrauch wieder schmelzen Sie die Agarose durch Erhitzen mit einer Heizplatte oder in der Mikrowelle.

6. Herstellung des Ölbehälters

Hinweis: Das unten beschriebene Verfahren ist nur eine von vielen Möglichkeiten, einem Ölbehälter gefertigt werden kann. Der Leser wird ermutigt, entwerfen und fertigen ein Reservoir anhand der zur Verfügung stehenden Materialien, Bearbeitung von Fähigkeiten und Bedürfnissen.

  1. Schneiden Sie mit einer Bandsäge, ein 12 x 12 x 12 mm Acryl Würfel aus einer größeren 12 mm Dicke Acrylglasplatte.
  2. Fräsen Sie ein Loch mit 12 mm Durchmesser bis zu einer Tiefe von 8 bis 12 mm in das Acryl Rohr (Abbildung 1a).

7. Vorbereitung der Elektroden

  1. Mit einer Schere, Schnitt zwei Stücke (75 mm) von silbernen Drähten (125 μm Durchmesser).
  2. Mit einer offenen Flamme Feuerzeug, Schmelzen Sie ein Ende jedes Silberdraht, Form kleine kugelförmige Kugeln (rund 250 μm Durchmesser).
  3. Tauchen Sie die Kugelköpfe in Bleichmittel für 1-2 h, eine Silber-Silberchlorid (Ag/AgCl) Beschichtung zu schaffen. Eine dunkelgraue Farbe zeigt an, dass die Ag/AgCl-Beschichtung (Abbildung 2a) gebildet hat.
  4. Beide Drähte aus Bleichmittel entfernen, Nachspülen mit VE-Wasser und beiseite legen Sie auf einem sauberen fusselfreien Tuch.
  5. Tauchen Sie die Kugelköpfe in geschmolzenem Agarosegel erstelle ich eine dünne Schicht. Diese Gel-Beschichtung hilft, um die wässrigen Tröpfchen auf die Drähte unter Öl zu verankern.
  6. Mit einem Glasschneider, gespalten Sie eine 10 cm lange, 1/0,58 OD/ID mm Borosilikatglas Kapillare in zwei 5 cm Kapillaren.
  7. Einfügen Sie eines der Glaskapillaren in einen Elektrodenhalter (Abb. 2 b, c), und dann eines der Ag/AgCl-Draht in das Glas Kapillare (Abb. 2d). Füttern Sie den anderen Ag/AgCl-Draht in das zweite Glas Kapillare.
  8. Montieren Sie die zweite Glas-Kapillare zu einer Mikropipette Glashalter (Abbildung 2e, f).

8. Aufbau des Experiments

  1. Platzieren Sie einen 1 mm dick, 25 x 75 mm-Objektträger auf der Bühne von einem inversen Mikroskop (Abb. 1a).
  2. Tropfen Sie ein paar Hexadecan Öl auf die Mitte der Glas-Folie, und platzieren Sie den Ölbehälter direkt auf das Öl auf den Objektträger.
    Hinweis: Hinzufügen von Öl zwischen dem Glas Folie und Öl-Reservoir dient zum Abgleichen der Brechungsindex des Substrates, klarere und schärfere Bilder liefern.
  3. Der Ölbehälter vollständig mit Hexadecan Öl auffüllen. Stellen Sie sicher, dass das Reservoir über das Objektiv sitzt.
    Hinweis: Andere hydrophob Öle können auch verwendet werden.
  4. Den Elektrodenhalter an der Headstage eines aktuellen Verstärkers anschließen. Die Headstage muss auf einem Mikromanipulator (Abbildung 1a), Elektrodenlänge zu minimieren und elektrisches Rauschen montiert werden.
  5. Befestigen Sie die Glas Mikropipette Halterung mit dem zweiten Ag/AgCl-Draht auf ein anderes Mikromanipulator (Abbildung 1a).
  6. Mithilfe der Manipulatoren, Position, die die Elektroden so, dass die Agarose Tipps der Ag/AgCl Drähte beschichtet vollständig in den Ölbehälter an eine ähnliche vertikale Ebene untergetaucht sind.
  7. Richten Sie die beiden Elektroden und trennen Sie diese durch ein paar Millimeter (Abbildung 1a, b).
    Hinweis: Nach dem Hinzufügen der Tröpfchen (in Schritt 13beschrieben), müssen die Drähte eingelegt werden ganz nach unten bis die Elektrodenspitzen unten des Ölbehälters berühren. Diese Schritt wird sichergestellt, dass die Drähte nicht schwingen und somit unnötige Schwankungen in den gemessenen Strom minimiert.

(9) ordnungsgemäße Erdung um elektrisches Rauschen zu reduzieren

  1. Erstellen einer Boden-Bus Gewinde einer Schraube in die Anti-Vibrations-Tabelle, auf die das Mikroskop (Abb. 3a) gelegt werden.
    Hinweis: Verwenden ein Anti-Vibrationstisch ist erforderlich, um Schwingungen aus der Umgebung zu minimieren, die zu unerwünschte Schwankungen der gemessene Strom führen können.
  2. Mit einem leitfähigen Draht, verbinden Sie die Schraube mit einer Erdung (Abbildung 3a), und schließen Sie dann den Mikroskoptisch an den Boden Bus.
  3. Platzieren Sie einen Faradayschen Käfig über den Versuchsaufbau zur Reduzierung von Lärm und dann elektrisch verbinden Sie es mit dem Boden Bus (Abb. 3 b).
    Hinweis: Es wird immer empfohlen, unnötige Erdschleifen zu vermeiden da sie zu einer Zunahme der Messung Geräuschpegel führen können.

10. Feedback-gesteuerte Heizung

  1. Maschine einen Aluminium Heizung Schale in dem Ölbehälter29behaglich passen kann.
  2. Stellen Sie sicher, lassen Sie eine Öffnung an der Unterseite der Schale, durch die Shell über den inversen Mikroskop betrachten zu können.
  3. Legen Sie ein 30 x 30 mm resistiven Polyimid flexible Heizelement unterhalb der Alu-Schale.
  4. Legen Sie eine isolierende Polydimethylsiloxan (PDMS) Wafer unter die Heizung zur Reduzierung von Wärmeverlusten in der Richtung nach unten und zum Schutz des Mikroskoptisch.
  5. Legen Sie ein Thermoelement in der Ölphase. Nach sicherstellen, dass das Thermoelement nicht entweder Ag/AgCl Draht berührt, anschließen Sie die Thermoelement Drähte an einem Thermoelement Daten Ankaufskommission und Rekord Temperatur mit Individualsoftware Programmierung.
    Hinweis: Schreiben Sie eine On-Off, proportionale integrative (PI) Feedback Temperaturregelung um Heizung und passive Kühlung der Temperatur des Öls auf einen gewünschten Wert zu aktivieren. Codes können Leser auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden.

11. Aufbau der Software und Ausrüstung

  1. Bereiten Sie die Datenerfassungs-Software durch Einschalten/Computer, Mikroskop, Funktionsgenerator, Stromverstärker und geräuscharme Datenerfassungssysteme.
    Hinweis: Während alle aktuellen Sensorik verwendet werden kann, sind die folgenden Anweisungen speziell für die in Tabelle Materialienaufgeführt. Shlyonsky Et Al.30steht für Forscher, die ihre eigenen Stromverstärker bauen wollen.
  2. Auf der Vorderseite der Patch-Clamp Stromverstärker, stellen Sie die Frontplatte Anzeige und Quelle-Messung Modus wählt, VHOLD/IHOLD und V-CLAMP, beziehungsweise.
  3. Setzen Sie auf der Vorderseite den Lowpass Bessel Filter 1kHz und Output Gain auf 0,5.
    Hinweis: Auswahl einer niedrigen Ausgangspegel ermöglicht Aufnahme größere höhere aktuelle Amplituden, während Erhöhung des Verstärkung Opfer Messbereichs für Messrauschen verringern.
  4. Legen Sie die Konfiguration , ganze Zelle β = 1. Dieser Wert kann später auf 0,1 bis Aufzeichnung der größere Amplitude Ströme geschaltet werden.
  5. Legen Sie alle anderen Kontrolle Zifferblätter auf Null oder in einer neutralen Position.
  6. Initialisieren Sie die Software durch Doppelklick auf das Symbol auf dem Desktop.
  7. Klicken Sie auf Konfiguration | Digitizer , öffnen Sie das Dialogfeld " Digitizer ", und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " ändern ".
  8. Wählen Sie im Wandel Digitizer -Dialog den entsprechenden Digitizer aus Digitizer Typenliste.
  9. Klicken Sie auf die Scan -Taste, um den Digitizer zu erkennen.
  10. Klicken Sie auf "OK" um die Änderung Digitizer -Dialogfeld zu schließen, und klicken Sie dann auf "OK" , um das Dialogfeld " Digitizer " zu beenden.
  11. Klicken Sie auf ConAbbildung | Labortisch.
  12. Im Register Input Signale der Laborbanksoll den Skalierungsfaktor 0,0005 V/PA.
    Hinweis: Dieser Wert muss aktualisiert werden, wenn der Gewinn oder β-Werte geändert werden.

12. die Pipette Offset

Hinweis: Die unten beschriebene Verfahren gilt nur für Stromverstärker in Tabelle Materialienerwähnt.

  1. 200 einzahlen mit einer Mikropipette nL der wässrigen Lipid-Lösung "A" auf die Enden der einzelnen Ag/AgCl-Draht unter Öl.
  2. Bringen Sie die Tröpfchen in Kontakt zu, und drücken Sie die ZAP -Taste auf der Frontplatte des Verstärkers, die Tropfen in einem Band umfasst beide Elektroden verschmelzen. Dies sollte induzieren eine Kurzschluss-Reaktion.
  3. Set Quelle-Messung-Modus-Wahlrad auf Spur.
  4. Ändern Sie die Frontplatte Display Zifferblatt in VSpur.
  5. Drehen Sie die PIPETTER ausgeglichen wählen (im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn) bis Meter mal gelesen 0 mV und ist stabil.
  6. Rückkehr der Quelle-Messung-Modus-Wahlrad zur V-CLAMP und die Frontplatte zeigt Zifferblatt v halten/ihalten.

13. Bildung von Lipid Bilayer

  1. Lassen Sie die Tropfen, die zuvor durch Verschieben der Elektroden vertikal aus der Ölphase abgelagert wurden. Dies bewirkt, dass die Tropfen von den Elektroden in das Öl fallen. Wieder tauchen Sie und positionieren Sie die Elektroden in Öl.
  2. Verwenden Sie die Mikropipette, Kaution 200 nL Lipid-Lösung "A" auf jeder der Drähte.
  3. Warten Sie ca. 3-5 min, um spontane Lipid Monolage Montage an jedem Wasser/Öl-Schnittstelle auftreten zu ermöglichen.
    Hinweis: wie die Lipid Monolage Formen, die Wasser/Lipid/Öl-Schnittstelle Oberflächenspannung abnimmt, die die Tröpfchen durchhängen, wenn das umgebende Öl ausreichend weniger dichten21verursachen können.
  4. Niedriger die Elektroden (Tröpfchen) bis zum Ende beiden Elektroden kaum berühren den Boden des Ölbehälters (Abbildung 1 b) und verschieben Sie sie horizontal, um die Tropfen in Kontakt zu bringen.
    Hinweis: Die Lipid-Bilayer wird spontan durch den Ausschluss überschüssigen Öl zwischen den sich berührenden Tröpfchen dünn. In der Regel tritt dieser Prozess innerhalb von 1 min.

14 elektrische Charakterisierung der biomolekularen Memristor

  1. Lipid Bilayer Bildung
    1. Aufzeichnen die Lipid Bilayer Formation, das entspricht einer Zunahme der elektrischen Kapazität zwischen Tröpfchen gelten Sie ein 10 Hz, 10 mV dreieckige Wellenform Spannung mit einem Funktionsgenerator (Abbildung 4) verbunden mit dem externen Eingang der Patch-Clamp Verstärker.
      Hinweis: Aufgrund der kapazitiven die Lipidmembran sollte die resultierende aktuelle Antwort eine quadratische Wellenform (Abbildung 4). Bei der Lipid Bilayer Bildung, Schritt 11,6, sollte der Forscher sehen eine Wachstum in der aktuellen Spitze-Spitze-Amplitude und beachten Sie auch eine optische Veränderung zwischen angeschlossenen Tröpfchen (Abbildung 4).
  2. Strom-Spannungs-Messungen
    Hinweis: Der biomolekularen Memristor ist als einen Widerstand und einen Kondensator parallel12,21modelliert. Daher kann die aktuelle Antwort des Geräts resistive und kapazitive Komponenten abhängig von der Frequenz der angelegten Spannung enthalten. Die Memristive Natur des Geräts zu studieren und zu den eingeklemmten hysteretische Strom-Spannungs-Beziehung12können kapazitive Strom aus der Gesamtstrom subtrahieren erforderlich. Das Protokoll unten beschreibt dieses Verfahren.
    1. Mit einem Funktionsgenerator, gelten Sie eine Spannung Wellenform (Dreiecks- oder sinusförmigen) für eine Alamethicin-freie Lipidmembran montiert mit Tropfen der Lösung "A".
    2. Notieren Sie die induzierte aktuelle Antwort über mehrere Frequenzen.
      Hinweis: Kapazitive Ströme werden bei Frequenzen unterhalb von 10 mHz minimiert.
    3. Notieren Sie die Größe der Grenzflächen Lipid Bilayer durch entweder Messung des Durchmessers der Lipidmembran auf Computer oder durch Aufnahme der Peak to Peak aktuelle Amplitude aus 10 Hz, 10 mV Dreieckswelle. Die aktuelle Amplitude ist proportional zu der Membran-Kapazität, die ist wiederum proportional zur Fläche der Membran.
    4. Entfernen Sie die Tröpfchen, die keine Alamethicin enthalten.
    5. Fügen Sie neue wässrige Tröpfchen, die mit "C"-Lösung und bilden ein Lipid Bilayer.
    6. Verwenden Sie die Mikromanipulatoren Kontakt zwischen Tröpfchen anpassen, so dass die Bilayer einen ähnlichen Bereich (Durchmesser oder Rechtecksignal aktuelle Amplitude) als eine früher gebildet hat.
    7. Wiederholen Sie 14.2.1 und 14.2.2.
    8. Subtrahieren Sie aktuellen im Schritt 14.2.2 aus aktuellen in Schritt 14.2.7. aufgezeichnet.
    9. Plot des induzierten Stroms versus angelegte Spannung für jede Frequenz und Wellenform, die "eingeklemmten Hysterese" Memristive Antwort zu erhalten.
  3. Puls-Experimente
    1. Mit einem benutzerdefinierten Programmiersoftware und analoge Spannungsquelle, erzeugen Sie Spannungspulse mit spezifischen hohen und niedrigen Amplituden, pünktlich und Ausschaltzeit.
      Hinweis: Dies ist nicht erforderlich, wenn die Spannungsimpulse mit einem kommerziellen Funktionsgenerator generiert werden konnte.
    2. Notieren Sie die aktuelle Reaktion auf angewandte Impulse.
    3. Aufgrund der kapazitiven der Memristor werden kapazitive Spitzen aufgezeichnet. Entfernen Sie Stacheln durch Anwenden eines Tiefpass-Filters mit entsprechenden Durchlassbereich.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1 zeigt den Versuchsaufbau zu montieren und zu charakterisieren, der biomolekularen Memristor verwendet. Senken die freien Enden der Elektroden an der Unterseite des Ölbehälters, wie in Abbildung 1 b, fand hilfreich zur Minimierung von Schwingungen der Elektroden und Tröpfchen, die in Variationen in gemessenen Strom und Bilayer Bereich, insbesondere in Fällen führen kann wo das Heizöl konvektive Strömung im Öl erzeugen kann. Abbild...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Montage und Charakterisierung von biomolekularen Memristoren basierend auf Ionen-Kanal-dotierte synthetische Biomembranen zwischen zwei Wassertröpfchen in Öl gebildet. Das weiche Materie, zwei-Terminal Gerät konzipiert und studierte bis: 1) besiegten Einschränkungen, die mit Solid-State-Technologie verbunden sind, wie z. B. hohe Rauschen, hohen Energieverbrauch und hohe Spannungen, Wechsel (2) genauer Zusammensetzung, imitieren strukturieren Wechsel Mechanismen der biologischen...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Handschrift hat von UT-Battelle, LLC, unter Vertragsnr. verfasst worden DE-AC0500OR22725 mit dem US-Department of Energy. Behält sich die Regierung der Vereinigten Staaten und der Verlag durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung, räumt ein, dass die US-Regierung eine nichtausschließliche eingezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz behält zu veröffentlichen oder zu reproduzieren das veröffentlichte Formular der Diese Handschrift, oder andere zu tun, für die Zwecke der US-Regierung zu ermöglichen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finanziell unterstützt wurde von der National Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Forschung für G.J.T., C.D.S, A.B und C.P.C wurde teilweise vom Labor gerichtet Research and Development Program des Oak Ridge National Laboratory, verwaltet von UT-Battelle, LLC, für das US-Department of Energy gesponsert. Ein Teil dieser Forschung wurde in der Mitte für Anwendungspotential Materialwissenschaften durchgeführt, die eine Damhirschkuh Büro der Wissenschaft Benutzer Anlage ist.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-Diphytanoid-sn-glycero-3-phosphocholin (DPhPC)Avanti Polare Lipide850356P/850356CErhältlich als lyophilisiertes Pulver (P) oder in Chloroform (C) 
Agarose Sigma-AldrichA9539
Agarose (0,5 g Agarose Tabletten)BenchmarkA2501Sie können entweder die Pulverform oder die Tabletten verwenden 
Alamethicin AG ScientificA-1286
AnalysenwaageMettler ToledoME204TE/00
Axopatch 200B Verstärker MolecularDevices-BK
Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep-/FunktionsgeneratorDigi-KeyBK4017B-ND
Kapillaren aus BorosilikatglasWorld Precision Instruments1B100F-4
Brain Total Lipid Extracts (Porcine)Avanti Polar Lipids131101
DigiData 1440A SystemMolecular Devices-
Extruder-Set mit Halter/Heizblock Avanti Polar Lipids610000Dazu gehören ein Mini-Extruder, 2 Spritzen, 100 PC-Membranen, 100 Filterhalterungen und 1 Halter/Heizblock
Gefrierschrank (-20 &Grad; c)VWR InternationalSCUCBI0420AD
GlaswarenVWRInternational-Hexadecan
, 99%Sigma-Aldrich544-76-3
IsopropylalkoholVWR InternationalBDH1133-4LP
Mikroelektrodenhalter World Precision InstrumentsMEH1S
MOPSSigma-AldrichM1254
Stickstoff (N2) GasAirgasUN1066
Parafilm M Allzweck-LaborfilmParafilmPM999
Puderfreie weiche Nitril-Untersuchungshandschuhe VWR InternationalCA89-38-272
Vorgereinigtes Mikroskop Sildes Fisher Wissenschaftlich 22-267-013
Kälteschrank (4 &Grad; C)VWR InternationalSCUCFS-0504G
SilberdrahtGoodFellow147-346-94Je nach Anwendung können unterschiedliche Durchmesser verwendet werden.
Natriumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP3911
RührplatteThermo Scientific
VWR Leichte TissuewischerVWR International82003-820
VWR Scientific 50D UltraschallreinigerVWR International13089
SP131325

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
  2. Squire, L. R. Memory systems of the brain: a brief history and current perspective. Neurobiology of learning and memory. 82 (3), 171-177 (2004).
  3. Benfenati, F. Synaptic plasticity and the neurobiology of learning and memory. Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 78 (1Suppl), 58-66 (2007).
  4. Marx, G., Gilon, C. The molecular basis of memory. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 633-642 (2012).
  5. Izquierdo, I., Medina, J. H. Memory formation: the sequence of biochemical events in the hippocampus and its connection to activity in other brain structures. Neurobiology of learning and memory. 68 (3), 285-316 (1997).
  6. Merolla, P. A. A million spiking-neuron integrated circuit with a scalable communication network and interface. Science. 345 (6197), 668-673 (2014).
  7. Benjamin, B. V. Neurogrid: A mixed-analog-digital multichip system for large-scale neural simulations. Proceedings of the IEEE. 102 (5), 699-716 (2014).
  8. Furber, S. Large-scale neuromorphic computing systems. Journal of neural engineering. 13 (5), 051001(2016).
  9. Di Ventra, M., Pershin, Y. V. The parallel approach. Nature Physics. 9 (4), 200-202 (2013).
  10. Chua, L. Memristor-the missing circuit element. IEEE Transactions on circuit theory. 18 (5), 507-519 (1971).
  11. Di Ventra, M., Pershin, Y. V., Chua, L. O. Circuit elements with memory: memristors, memcapacitors, and meminductors. Proceedings of the IEEE. 97 (10), 1717-1724 (2009).
  12. Najem, J. S. Memristive Ion Channel-Doped Biomembranes as Synaptic Mimics. ACS Nano. , (2018).
  13. Strukov, D. B., Snider, G. S., Stewart, D. R., Williams, R. S. The missing memristor found. Nature. 453 (7191), 80-83 (2008).
  14. Prezioso, M. Training and operation of an integrated neuromorphic network based on metal-oxide memristors. Nature. 521 (75550), 61-64 (2015).
  15. Prodromakis, T., Toumazou, C., Chua, L. Two centuries of memristors. Nature Materials. 11 (6), 478(2012).
  16. Berzina, T. Optimization of an organic memristor as an adaptive memory element. Journal of Applied Physics. 105 (12), 124515(2009).
  17. van de Burgt, Y., Melianas, A., Keene, S. T., Malliaras, G., Salleo, A. Organic electronics for neuromorphic computing. Nature Electronics. 1, (2018).
  18. Dan, Y., Poo, M. M. Spike timing-dependent plasticity: from synapse to perception. Physiological reviews. 86 (3), 1033-1048 (2006).
  19. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Reviews of Physiology. 64 (1), 355-405 (2002).
  20. Shepherd, J. D., Huganir, R. L. The cell biology of synaptic plasticity: AMPA receptor trafficking. Annual Review of Cell Developmental Biology. 23, 613-643 (2007).
  21. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  22. Najem, J. S. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726(2015).
  23. Taylor, G. J. Capacitive Detection of Low-Enthalpy, Higher-Order Phase Transitions in Synthetic and Natural Composition Lipid Membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  24. Taylor, G. Electrophysiological interrogation of asymmetric droplet interface bilayers reveals surface-bound alamethicin induces lipid flip-flop. Biochimica et biophysica acta (BBA)-Biomembranes. , (2018).
  25. Sarles, S. A., Garrison, K. L., Young, T. T., Leo, D. J. Formation and Encapsulation of Biomolecular Arrays for Developing Arrays of Membrane-Based Artificial Hair Cell Sensors. Proceedings of the Asme Conference on Smart Materials, Adaptive Structures and Intelligent Systems (Smasis 2011), Vol 2. , 663-671 (2011).
  26. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. Smart Materials & Structures. 20 (9), (2011).
  27. Sarles, S. A. Physical encapsulation of interface bilayers. , Virginia Tech. (2010).
  28. JoVE Science Education Datatbase. Organic Chemistry II. Cleaning Glassware. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  29. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using Escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2014).
  30. Shlyonsky, V., Dupuis, F., Gall, D. The OpenPicoAmp: an open-source planar lipid bilayer amplifier for hands-on learning of neuroscience. Plos One. 9 (9), e108097(2014).
  31. Najem, J. S. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  32. Bayley, H. Droplet interface bilayers. Molecular Biosystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  33. Nguyen, M., Srijanto, B., Retterer, S., Collier, C. P., Sarles, S. A. Hydrodynamic trapping for rapid assembly and in situ electrical characterization of droplet interface bilayer arrays. Lab on a Chip. 16, 3576-3588 (2016).
  34. A Soft-Matter Biomolecular Memristor Synapse for Neuromorphic Systems. Weiss, R., Najem, J. S., Hasan, M. S., Schuman, C. D., Belianinov, A., Collier, C. P., Sarles, S. A., Rose, G. S. IEEE Biomedical Circuits and Systems Conference (BioCAS), 1984 Mar 30-31, Cleveland, Ohio, , (2018).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Bildung von Lipid DoppelschichtenAlamethicin PeptideDroplet Interface BilayerCyclovoltammetrieStrom Spannungs Beziehungkurzzeitige Plastizit tLiposomenherstellungMembranwiderstandIonentransport

Verwandte Artikel