Methodenartikel

In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung

DOI:

10.3791/59054

⸱

15. Februar 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dairy and Functional Foods Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2ProDigest, 3Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Philadelphia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung der Darm Microbiota des Dickdarms in-vitro-, mit einer Reihe von Bioreaktoren, die die physiologischen Bedingungen des Magen-Darm-Trakt zu simulieren.

Zusammenfassung

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Der menschliche Darm Microbiota spielt eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit. Studium der Darm Microbiota mit einem in-Vivo -Modell, ist schwierig, da seine Komplexität und seine vielfältige Verbindung mit Säugetieren Komponenten. Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Darm Microbiota in-vitro-Kultur, die für die Untersuchung der Darm Microbiota Dynamik ermöglicht, ohne den Beitrag des Säugetier-Milieus zu prüfen. Mit in-vitro- Kultivierung Technologie, werden die physiologischen Bedingungen für den Magen-Darm-Trakt simuliert, einschließlich Parameter wie pH-Wert, Temperatur, Anaerobiose und Laufzeit. Die intestinale Fläche des Dickdarms wird simuliert, indem Mucin-beschichtete Träger, eine Schleimhaut Phase erstellen und hinzufügen weitere Dimension. Der Darm Microbiota wird durch impfen mit menschlichen Fäkalien eingeführt. Nach Impfung mit dieser komplexen Mischung von Bakterien, sind bestimmte Mikroben in verschiedenen längs-(aufsteigender, quer- und absteigenden Doppelpunkte) angereichert und transversalen (luminalen und Schleimhaut) Umgebungen von in-vitro-Modell. Es ist entscheidend, kann das System die Steady-State zu erreichen, in dem die Gemeinschaft und die Metaboliten produziert stabil bleiben. Die experimentellen Ergebnisse in dieser Handschrift zeigen wie die beimpften Darm Microbiota Gemeinschaft zu einer stabilen Gemeinschaft im Laufe der Zeit entwickelt. Steady-State erreicht, kann das System um bakterielle Interaktionen und Community-Funktionen zu analysieren oder testen Sie die Auswirkungen der Zusatzstoffe auf den Darm Microbiota, wie Lebensmittel, Lebensmittelbestandteile oder Arzneimittel verwendet werden.

Einleitung

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Der Darm Microbiota ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die in den menschlichen Magen-Darm-Trakt (GIT) befinden.  Diese Gemeinschaft erreicht maximale Konzentration im Dickdarm, die schätzungsweise 1013-1014 Bakterien von 500-1.000 Arten halten das Leben in Symbiose mit dem Doppelpunkt Milieu1,2. Die Zusammensetzung und Funktionsweise der Darm Microbiota ändern räumlich entlang der GIT, bilden bestimmte Gemeinschaften der Region, mit der meisten Vielfalt gefunden nach distal2,3,4,5. Für jede anatomische Region befinden sich separate mikrobielle Gemeinschaften in das Lumen und auf der Schleimhaut-6. Die Lumen-Gemeinschaft hat einen direkteren Zugang zu Nährstoffen Substrate durch den luminalen Fach7zu bewegen. Trotzdem befinden sich einige Bakterien bevorzugt in der Schleimschicht, die Verwendung von Mucin produziert durch den Doppelpunkt-Zellen als Energie Quelle1,5,8. Der Unterschied in Mikroumgebungen zwischen Phasen der luminalen und Schleimhaut führt Divergenz und die Entwicklung der Phase bestimmten Gemeinschaften. Zusammen bieten diese Gemeinschaften Stoffwechselfunktionen wie Nährstoff Stoffwechsel und die Produktion von Vitaminen, und immunologische Funktionen, wie die Verhinderung der Besiedlung von humanpathogenen1,3, 9. Darm Microbiota funktioniert auch funktionell in Konjugation mit dem menschlichen Darm Zellen3.

Als ein wichtiger Bestandteil der menschlichen GIT ist es nicht verwunderlich, dass der Darm Microbiota bekannt ist, auf beiden Host Gesundheit und Krankheit Status3,9,10,11,12beitragen. Eine Verschiebung in der Darm mikrobiellen Population wurde mit mehreren menschlichen Krankheiten, einschließlich GIT Erkrankungen wie Darm Darmerkrankung (IBD) und Darm Darmsyndrom (IBS), sondern auch andere Krankheiten wie Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf-Krankheit und Autismus 3 , 9 , 10 , 11 , 12. Metaboliten aus dem Darm Microbiota hergestellt haben einen globalen Effekt erreichen Orte weit von der Darm-12,-13. Beispielsweise ist die Darm-Gehirn-Achse mit psychischen Störungen wie Angst und Depression14verbunden. Daher studieren der Darm Microbiota ist wichtig, mehrere Forschungsfelder und gilt für viele Krankheiten, auch diejenigen, die nicht oft im Zusammenhang mit der GIT.

Während es allgemein anerkannt ist, dass der Darm Microbiota Studium wichtig ist, ist es ein kompliziertes Unterfangen. Mehreren Tiermodellen stehen zur Verfügung, von kleinen Tieren wie Zebrafisch, Ratten und Mäuse, größeren wie Affen und Schweine15-19. Jedoch die Anwendung dieser Tiere in Bezug auf den menschlichen Darm Microbiota ist nicht einfach, da diese Tiere haben eine einzigartige bakterielle Gemeinschaft, die sich entwickelt hat basierend auf Umwelt und Ernährung, und sie unterscheiden sich anatomisch von Menschen20 , 21. die Verwendung von menschlichen Probanden entfernt die Frage der Relevanz noch stellt eine weitere Reihe von Herausforderungen. Studien am Menschen sind teuer, zeitaufwändig, und ethisch eingeschränkte11. Darüber hinaus beeinflussen Störfaktoren der Darm Microbiota in Studien am Menschen, einschließlich Alter oder Entwicklungsstadium, Umwelt, Ernährung, Medikation und genetische Faktoren2,4,22.  Es gibt auch Beschränkungen was am Menschen getestet werden kann, und welche Art von Proben zu welchen Zeiten4geerntet werden kann.

Ein kritischer Nachteil mit einem in-Vivo -System, um der Darm Microbiota zu studieren ist das Vorhandensein von Säugetieren Komponenten. Der Darm Microbiota und menschlichen Zellen, die miteinander interagieren, und in einer in Vivo festlegen, ist es unmöglich, die beiden zu unterscheiden. Die Metaboliten von Darm Microbiota produziert sind durch den Doppelpunkt-Zellen getroffen, so präzise Messungen berechnet werden können. Daher muss mechanistische Studie auf Endpunkt Messungen11beschränkt. Ein weiterer großer Nachteil für in vivo Studien ist die Unfähigkeit, Proben aus den verschiedenen Regionen von der GIT längs Ernte23. Dies lässt sich nicht für die Beurteilung der Veränderungen, die über Zeit12in Mikroumgebungen des Dickdarms auftreten können.  Viele in Vivo Studien, einschließlich Humanstudien, verlassen sich auf Analyse der Stuhlproben, Änderungen an den Darm Microbiota12zu erkennen. Dies ist zwar informativ, es liefert keine Daten auf den Darm Microbiota über GIT und unterscheidet nicht zwischen der luminalen und Schleimhaut Gemeinschaften5,6,7,8.

Für den Darm Microbiota ist die Anwendung einer in-vitro- Methode erforderlich, um die Dynamik der bakteriellen Gemeinschaft, ohne Einmischung von den Säugetieren Komponenten zu studieren. Mit einer in-vitro- Methode ermöglicht die strenge Kontrolle der Umweltbedingungen10, gleichzeitig von mehreren Parametern testen und die Fähigkeit, probieren Sie längs und in großen Mengen11. Da eine in-vitro-Methode ein mechanisches Gerät und kein Host verwendet, werden keine Überlegungen für Alter, Umwelt, Ernährung oder genetischen Hintergrund benötigt. Diese Systeme können verwendet werden, um entweder den gesamten Darm Microbiota Gemeinschaft testen, nur ausgewählte Organismen oder sogar einzelne Stämme. Wichtig ist, in-vitro-Ergebnisse sind reproduzierbar, behalten noch ein Maß an Vielfalt in vivo Studien11,22vergleichbar.

Je nach der Hypothese in Frage und die gewünschten Ergebnisse ichn-vitro- Studien können auf vielfältige Weise durchgeführt werden.  Sie können einzelne Gefäßsysteme und einfache Methoden, wie Inkubation Proben mit fäkalen Homogenat24 oder Durchführung einzelner Batch Kulturen im Laufe von 24-48 h25nutzen. Sie können auch mit einzelnen Gefäßsysteme und komplexere Methoden, z. B. mit einem Chemostat System herstellen einer stabilen Darm mikrobiellen Gemeinschaft11erreicht werden. Jedoch kann die Verwendung eines einzigen Reaktors Mikrobiota12 vereinfachen da es nur einen Abschnitt des Dickdarms, darstellt, obwohl der Doppelpunkt der auf-, quer- und absteigenden Regionen besteht.

Um den Darm Microbiota Gemeinschaft zu studieren, die in den verschiedenen Regionen des Dickdarms (der auf-, quer- und absteigenden Regionen) entwickelt, ist eine komplexe, mehrstufige System einsetzbar. In diesen Systemen werden mehrere Schiffe eingerichtet, um die verschiedenen Regionen des Dickdarms, zu imitieren, damit der Darm Microbiota der auf-, quer- und absteigenden Regionen werden unabhängig voneinander angebaut. Diese Schiffe sind verbunden, mit Pumpen Substrate in Reihenfolge von der aufsteigende, die quer zu den absteigenden Dickdarm Regionen bewegen, imitiert den Fluss von Nährstoffen durch die GIT.

Das Ziel dieser Studie war es zu zeigen, wie eine in-vitro-5-Stufen-Kultursystem (siehe Tabelle der Materialien), die Darm Microbiota Gemeinschaft zu pflegen und zu Dynamik der Gemeinschaft in Bezug auf Stabilität und Zusammensetzung verwendet werden kann. In diesem System ein Schiff stellt den Magen und Dünndarm darstellen. Der Doppelpunkt gliedert sich in drei Regionen (aufsteigend, quer, absteigend), mit einem Schiff aus jeder Region26. In diesem Versuchsaufbau wurden zwei komplette Systeme parallel laufen, mit 1 mit Mucin Träger stellt die Schleimhautoberfläche und Unit 2, enthält keine Mucin-Träger. Die Gemeinden, die in der luminalen und Schleimhaut Phasen der einzelnen Regionen entwickelt wurden im Laufe der Zeit mit 16 s rRNA-Gen-Sequenzierung und Analyse der SCFA zueinander und zu den fäkalen Inokulum verglichen. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen die Art der Gemeinschaft, sowohl in Bezug auf Zusammensetzung und Funktionen, die aus dieser Art von in-vitro-System hergestellt werden können.

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Protokoll

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(1) Stoffe und Zubereitungen

Hinweis: Das definierte Medium wird als Pulver gekauft (siehe Tabelle der Materialien). Die Zusammensetzung des Mediums definierten in g/L ist die folgende: Arabinogalaktan (1,2), Pektin (2.0), Xylan (0,5), Glukose (0,4), Hefeextrakt (3.0), spezielle Pepton (1.0), Mucin (2.0), L-Cystein-HCl (0,2).

  1. Bereiten Sie die definierten Mediums
    1. Füllen Sie eine 4-L-Flasche mit 2 L doppelt destilliertem, entionisiertem Wasser.
    2. Das Wasser fügen Sie 29,2 g definierten mittleren Pulver hinzu und mischen Sie Einheit vollständig homogenisiert.
    3. Fügen Sie ein Magnetrührer und Schrauben Sie lose den Deckel.
    4. Autoklaven bei 121 ° C für 30 Minuten.
    5. Nach dem Abkühlen speichern Sie das vorbereitete definierte Medium im Kühlschrank bei 4 ° C unter ständigen rühren (Magnetrührer).
  2. Vorbereiten von Pankreassaft
    1. Autoklaven 2L destilliertem, entionisiertem Wasser in einem 5L-Behälter mit Rührwerk Bar hinzugefügt, bei 121 ° C für 30 Minuten.
    2. Nach dem Autoklavieren lassen Sie das Wasser auf Zimmertemperatur abkühlen.
    3. 12,5 g Nahco33, 6 g Galle und 0,9 g Pankreatin hinzufügen. Setzen Sie auf Magnetrührer zu mischen.
      Hinweis: Der Pankreassaft sollte alle 2-3 Tage frisch zubereitet und gekühlt mit Agitation dahinter gemacht.
  3. Phosphatpuffer
    1. Setzen Sie eine 1 L-Flasche mit einem Magnetrührer Bar auf einen Magnetrührer. Fügen Sie 0,5 L destilliertem, entionisiertem Wasser hinzu und aktivieren Sie Unruhe.
    2. Fügen Sie dann 6,8 g KH2PO4, 8,8 g K2HPO4und 0,1 g Natrium Thioglykolat. Top mit Wasser zu einem Endvolumen von 1 L.
    3. Nachdem die Komponenten vollständig aufgelöst haben, anpassen des pH-Werts 7,0 mit NaOH.
    4. Gießen Sie den Puffer in einen 2 L Behälter mit Schraubdeckel Deckel und Autoklaven bei 121 ° C für 30 min. Achten Sie darauf, die der Deckel aufgeschraubt ist locker und nicht fest geschlossen.
    5. Nach dem Entfernen aus dem Autoklaven, lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Speichern Sie den Puffer bei Raumtemperatur bis zu 2 Wochen.
  4. Bereiten Sie Mucin-Agar-Träger
    1. Autoklaven Kunststoff Mucin Träger (siehe Tabelle der Materialien), Zange, Kunststoffgitter (Röhrenform) und Kabelbinder bei 131 ° C für 30 Minuten.
    2. Autoklaven mit 300 mL doppelt destilliert, de-ionisiertes Wasser bei 131 ° C für 30 min. Store bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung.
    3. Ein Schrank mit Laminar-Flow Biosafety füllen Sie sterile Petrischalen mit den Kunststoff Mucin-Trägern mit sterilen Pinzette aus.
      Hinweis: Die Mucin-Träger sind hohle Kunststoff Kreise, die mit Mucin Agar gefüllt sind. Einmal gefüllt, kann der Deckel an der Spitze platziert werden und diese beiseite stellen.
    4. Fügen Sie 3 g bakterielle Agar und 15 g von porcinen Mucin um Mucin Agar vorzubereiten hinzu, 300 mL autoklaviert Wasser.
    5. Kochen Sie in einer Dampfhaube diese Lösung, dann von der Wärmequelle zu entfernen Sie und abkühlen lassen für 1 min. Kochen und Kühlung für insgesamt 3 Mal zu wiederholen.
    6. Sobald das Glasgefäß mit der Mucin-Agar-Lösung kühl genug zum Anfassen ist, verschieben Sie sie in die Biosicherheit Schrank mit Laminar-Flow.
    7. Übergießen Sie in der Biosicherheit Schrank mit Laminar-Flow der flüssigen Mucin-Agar die Kunststoff Mucin-Träger, die in der Petrischale gelegt wurden. Stellen Sie sicher, dass alle Träger mit Mucin Agar vollständig gefüllt sind.
    8. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Petrischale und unter Laminar-Flow abkühlen lassen.
    9. Die Mucin-Träger zusammensetzen, nehmen das autoklaviert Kunststoff Geflecht und Mucin-Träger mit der erstarrten Mucin-Agar aus der Petrischale mit sterilen Pinzette einfügen.
    10. Verwenden Sie Kabelbinder, um die Enden des Netzes zu schließen. Auf diese Weise die net-Funktionen enthalten die Mucin-Träger mit Mucin Agar gefüllt. Bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.

2. einrichten, Impfung und Betrieb des Systems

  1. Einrichten des Systems der Kultivierung
    Hinweis:     der Twin-Simulator des menschlichen intestinalen mikrobiellen Ökosystems wurde für diese Studie verwendet.
    1. 10 mit Rührer Bars auf magnetische Rührwerke Bioreaktoren und schalten Sie Agitation ein.
      Hinweis: Jede Einheit besteht aus 5 Bioreaktoren, also 2 Einheiten 10 Bioreaktoren benötigen.
    2. Miteinander verbunden Sie sind 5 Bioreaktoren mit Silikon Schläuche nacheinander durch die peristaltischen Pumpe (Abbildung 1). Verwenden Sie den Pumpen quer der flüssige Inhalt aus einem Bioreaktor zur nächsten.
    3. Beschriften Sie die Bioreaktoren in der folgenden Reihenfolge: Magen, Dünndarm, aufsteigenden Kolon, Colon transversum, absteigender Dickdarm um die Reihenfolge des Magen-Darm-Trakt darzustellen.
      Hinweis: Die Bioreaktoren können alle identisch sein, oder die Magen und Dünndarm Bioreaktoren können kleinere auf den Doppelpunkt-Bioreaktoren verglichen werden, da sie weniger Volumen halten. Einrichten von Bioreaktoren auf diese Weise bedeutet, dass die aufsteigenden Dickdarm-Region Nährstoffe aus dem Dünndarm erhält, Colon transversum Region Nährstoffe aus der aufsteigenden Dickdarm-Region erhält und die absteigenden Dickdarm-Region erhält Nährstoffe aus der Transversale Region. Auf diese Weise wird das System die sequentielle Bewegung der Nährstoffe durch den Magen-Darm-Trakt imitiert.
    4. Legen Sie die definierten Mediums und Pankreassaft im Kühlschrank bei 4 ° C mit ständiger Bewegung mit magnetischen Rührer. Mit Silikon-Schläuche, schließen Sie definierten Mediums an den Magen Bioreaktor über eine peristaltische Pumpe an und verbinden Sie den Bauchspeichel in den Dünndarm über eine peristaltische Pumpe.
    5. Ein Urinbeutel Entwässerung erstarrenden Agent hinzufügen. Verbinden Sie den absteigenden Dickdarm mit Entwässerung Urinbeutel durch die peristaltischen Pumpe. Entsorgen Sie die erstarrten als Bioabfall während des Experiments.
    6. Mit Silikonschlauch, verbinden Sie den Wassermantel eines jeden Schiffes in Ordnung, und schließen Sie jedes Ende an das zirkulierende Wasserbad. Füllen Sie das zirkulierende Wasserbad mit destilliertem Wasser (dieser Betrag variiert je nach Art der zirkulierenden Wasserbad verwendet) und auf 37 ° C.
    7. Mit Silikon Schlauch verbinden Sie die Säure und der Base auf den Deckel eines jeden Schiffes durch peristaltische Pumpen. Die empfohlenen Konzentrationen sind 0,5 M HCl und 0,5 M NaOH.
    8. Die pH-Sonden für jedes Schiff über den dafür vorgesehenen Anschluss in den Deckel einsetzen. Dieser Anschluss dient zum halten die pH-Sonde und Schraube in den Deckel (Abbildung 1). Den pH-Wert für die einzelnen Regionen wie folgt festgelegt: Magen, pH = 2; Dünndarm, pH = 6,7-6,9; Aufsteigender Dickdarm, pH = 5,6-5,9; Colon transversum, pH = 6,15-6,4; Absteigenden Dickdarm, pH = 6,6-6,9.
      Hinweis: In der Anfangsphase wird die Gemeinschaft anhand der Unterschied in der Region pH Werten unterscheiden. Jedoch sobald die Fütterungen Zyklen beginnen, werden die Gemeinden weiter basierend auf Unterschiede in den Nährstoffeintrag Reifen.
    9. Eine Stickstoff-Linie mit Silikon Schlauch auf den Deckel eines jeden Schiffes über den dafür vorgesehenen Anschluss zu verbinden. Die Stickstoff-Linie sollte in der folgenden Reihenfolge fließen: Magen, Dünndarm, Colon transversum, absteigender Dickdarm aufsteigender Dickdarm. Stellen Sie sicher, dass jede Einheit verfügt über eine eigene bündig um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
      Hinweis: Stickstoff wird verwendet, um entfernte Sauerstoff aus dem System und unterhält Anaerobiose während des Experiments.
    10. Legen Sie ein Metall Probenröhrchen durch den Deckel jeder Bioreaktor mit dem dafür vorgesehenen Anschluss. Das Metallrohr erstreckt sich nach unten in den Bioreaktor und wird verwendet, um flüssige Proben zu sammeln.
    11. Ein kleines Stück Silikon Schlauch am oberen Ende des Probenröhrchens fügen und verbinden ein Luer-Lock, um die Verwendung einer Spritze bei der Probenahme zu ermöglichen.
  2. Inokulation des Systems
    1. Füllen Sie die Doppelpunkt-Regionen mit dem definierten Medium verwenden die folgenden Bände: 500 mL in den aufsteigenden Dickdarm, 800 mL in das Colon transversum und 600 mL im absteigenden Dickdarm.
    2. Der Doppelpunkt-Regionen in einer Menge proportional zum Volumen des Reaktors Mucin Agar Träger hinzufügen. Für dieses Experiment wurden 60 Fluggesellschaften pro Reaktor verwendet.
    3. Jedes überschüssige definierte Medium mit das Probenröhrchen und eine Spritze, da die Träger hinzufügen das Niveau der Flüssigkeit im Bioreaktor erhöht zu entfernen.
    4. Schalten Sie die pH-Sonden zur Einstellung des pH-Wertes in jedem Reaktor mit dem Computer.
    5. Schalten Sie den Stickstoff-Flush für 20 Minuten.
      Hinweis: Die fäkale Homogenat verwendet für die Impfung ist als 10 % Kot im 10 % Glycerin Lösung homogenisiert gekauft (siehe Tabelle der Materialien). Die Kotprobe wird zufällig aus einem Pool von Spendern mit den folgenden Kriterien ausgewählt: ein Amerikaner verbrauchen eine typische westliche Diät (nicht Vegan oder vegetarisch), zwischen 21-45 Jahre alt, Antibiotika frei für mindestens 1 Jahr, mit einer durchschnittliche Body-Mass-Index (18,5-24,9) . Für dieses Protokoll ist nur ein einzelner Spender verwendet. Dies kann jedoch aufgrund von experimentellen Design verändert werden.
    6. Tauen Sie vor der Inokulation die fäkale Homogenat nach den Richtlinien des Herstellers.
    7. Impfen Sie jedem Doppelpunkt Reaktor durch Zugabe von fäkale Homogenat in einen Betrag in Höhe von 5 % des Reaktorvolumens durch den Probenport, mit einer 60 mL Spritze (25 mL für den aufsteigenden Dickdarm, 40 mL für das Colon transversum, 30 mL für den absteigenden Dickdarm).
    8. Wachsen Sie die Kulturen in den Bioreaktoren über Nacht mit Kontrolle des pH-Werts.
    9. Nach der Übernachtung Wachstum Ernte Proben der luminalen Flüssigkeit aus jeder Region Doppelpunkt wie nachfolgend in Abschnitt 3. Nach der Probenahme abgeschlossen ist, aktivieren Sie das Computerprogramm füttern beginnen.
  3. Tägliche Fütterung Zyklen
    Hinweis:     die tägliche Fütterungen Zyklen sind Computer automatisiert.
    1. Dreimal täglich 140 mL des Mediums definierten in den Magen Bioreaktor Pumpen und durfte für 1 h inkubieren.
    2. Pumpen Sie nach 1 h Inkubation den Inhalt des Magens in den Dünndarm. Zum gleichen Zeitpunkt Pumpe 60 mL Pankreassaft in den Dünndarm.
    3. Schalten Sie im Dünndarm ein pH-Einstellung auf pH 6,7-6,9 und Mischung für 90 min inkubieren. Während der Inkubation schalten Sie den Stickstoff-Flush für jedes System für eine Gesamtmenge von 10 min.
    4. Nach 90 min Inkubation die Pumpen aus dem Dünndarm zu den aufsteigenden Dickdarm, der aufsteigende Dickdarm das Colon transversum, das Colon transversum den absteigenden Dickdarm und den absteigenden Dickdarm mit dem Müll schalten Sie gleichzeitig ein.
  4. Experimentelle timeline
    Hinweis:     die in-vitro-System verwendet hier für ca. 8 Wochen lang in kontinuierlich betrieben wird. Unten ist eine empfohlene experimentelle Timeline, dies kann jedoch je nach Bedarf und Ziel des Experiments geändert werden.
    1. Richten Sie System folgende Schritte in Schritt 2.1 aufgeführt.
    2. Proben aus über Nacht Wachstum nach unten Protokoll zu ernten. Beginnen Sie die täglichen Zyklen, Fütterung dreimal täglich nach der oben genannten Protokolls.
    3. Führen Sie das Experiment für eine Gesamtmenge von 2 Wochen, um die Bakterien zu stabilisieren.
      Hinweis: Betrieb des Systems bedeutet, dass der pH-Wert gehalten, die tägliche Fütterungen Zyklen drei Mal am Tag folgen und die Schleimhaut Träger 2-3 Mal jede verändert sind Woche.
    4. Führen Sie nach der Stabilisierung das Experiment für 2 Wochen als Kontrolle Periode.
    5. Nach Ablauf der Kontrolle nutzen Sie das System testen Sie verschiedene Komponenten oder Variablen, bekannt als der Behandlungsdauer.
    6. Mit Ablauf der Behandlung hinzufügen von Komponenten oder Variablen zu stoppen und die Bedingungen zur Normalität zurückkehren. Dies wird als der Wash-Out-Zeit und wird verwendet, um festzustellen, ob Änderungen an der Community dauerhaft sind.

3. Ernte Proben aus dem System

Hinweis: Während des Experiments Proben geerntet werden können von der luminalen oder Schleimhaut Phase jeder Region zu jeder Zeit, nach den folgenden Richtlinien.

  1. Ernte der luminalen Proben
    1. Ernten Sie luminalen Flüssigkeitsproben durch die Probenöffnung, die in der Mitte der Flüssigkeit Kultur erweitert. Zunächst die Luer Lock auf den Probenport mit 70 % Ethanol oder kleine Alkoholtupfer reinigen und trocknen lassen.
    2. Sicherstellen Sie, dass alle Luft aus einem 30 mL Spritze entfernt ist und mit dem Probe-Anschluss verbinden. 3-bis 5-Mal rauf und runter zu ziehen, zu gewährleisten, richtige Mischung der einzelnen Behälter. Danach zeichnen Sie insgesamt 30 mL der Kultur.
    3. Aliquot der luminalen Proben wie in sterilen Falcon Tuben und Shop auf Eis benötigt. Nach Abschluss der Probenahme übertragen Sie diese auf-80 ° C Gefrierschrank.
    4. Für die SCFA Analyse wird bei 4 ° C, 5.000 X g für 10 min. 15 mL der luminalen Probe gesponnen. Der Überstand ist Spritze mit einem PES-0,2 μM-Filter gefiltert. Speichern des gefilterten Überstands bei-80 ° C.
      1. Für DNA-Analysen, Spin 1 mL der luminalen Flüssigkeit bei 4 ° C 5.000 X g für 10 min. überstand verwerfen und speichern das Pellet bei-80 ° C.
      2. Als Backup speichern Sie 10 mL luminalen Flüssigkeit bei-80 ° C für die meisten Experimente.
  2. Ernte der Schleimhaut Proben
    Hinweis:     Schleimhaut Träger alle 2-3 Tage zu ändern.
    1. Entfernen Sie und bringen Sie die vorbereiteten Mucin-Träger aus dem Kühlschrank.
    2. Schalten Sie den Stickstoff-Flush und öffnen Sie den Deckel des Reaktors schnell. 50 % der Mucin Träger entfernen und neue hinzufügen.
    3. Dichtung Deckel schnell und halten Sie den Stickstoff bündig auf für weitere 20 Minuten.
    4. Für DNA-Extraktion, aliquoten 0,25-0,5 g Agar in eine 2 mL-Tube und bei-80 ° C bis benötigt gelagert.

4. DNA-Extraktion, Sequenzierung und Analyse

Hinweis: DNA ist mit CTAB DNA-Extraktions-Verfahren mit physischen Homogenisierung in einem Dunstabzugshaube29extrahiert. Nach Extraktion wird einem Spektrophotometer verwendet, um die Menge an DNA in jeder Probe zu quantifizieren.

  1. Bereiten Sie CTAB Puffer
    1. 4,2 g K2HPO4 und 4,09 g NaCl in 200 mL deionisiertes, destilliertes Wasser, dann Autoklaven bei 121 ° C für 30 min auflösen.
    2. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen.
    3. 10 g Hexadecyltrimethylammonium Bromid (CTAB) und Hitze bis 60 ° C unter Rühren zugeben.
    4. Nachdem alle CTAB aufgelöst ist, entfernen Sie die Lösung auf Raumtemperatur von Heizen und kühlen.
  2. PEG-6000 Lösung vorbereiten
    1. 300 g Polyethylenglykol 6000 und 93,5 g NaCl in 1 L destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen.
    2. Nachdem alle Partikel werden aufgelöst, Autoklaven die Lösung bei 121 ° C für 30 min.
    3. Nach dem Autoklavieren kühlen Sie die Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur.
  3. DNA-Extraktion durchführen
    1. Fügen Sie 500 μL CTAB Puffer und 500 μl Phenol-Chloroform-Isoamyl Alkohol 2 mL Probenröhrchen und Wirbel zu homogenisieren hinzu.
    2. Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Probenröhrchens auf eine 0,1 mm physischen Homogenisieren Rohr (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Homogenisieren der Rohre für 20 s bei der höchsten Einstellung zweimal, mit 20 s Pause dazwischen, mit einem physischen Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien).
    4. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Rohre bei 3.000 X g für 5 Minuten.
    5. 300 μl des Überstands auf ein sauberes, 1,7 mL Röhrchen übertragen und die ursprüngliche Röhre 500 μL CTAB Puffer hinzufügen.
    6. Dieses Rohr wieder mit den Methoden in Schritten 4.3.2-4.3.3 und Zentrifuge bei 3.000 X g für 5 min zu homogenisieren.
    7. Übertragen Sie nach Zentrifugation eine weitere 300 μl des Überstandes auf die neue Röhre enthält jetzt 600 μL.
    8. Die Röhrchen mit 600 μl des Überstands fügen Sie insgesamt 600 μl Chloroform Isoamyl Alkohol hinzu.
    9. Invertieren Sie die Rohre zu mischen, und dann kurz zentrifugieren. Übertragen Sie 500 μL der oberen Phase auf eine saubere 1,7 mL-Tube. Nur die obere Phase zu gewährleisten.
    10. Als nächstes fügen Sie 1000 μL der Peg-6000 Lösung, invertieren Sie die Rohre zu mischen, und dann auf 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    11. Nach der Inkubation Zentrifugieren der Rohre bei 18.200 X g, 4 ° C für 10 Minuten.
    12. Verwerfen Sie den Überstand und reinigen Sie die Pellets mit Eis kalt 70 % Ethanol.
    13. Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei 18.200 X g, 4 ° C für 10 min. Überstands verwerfen und das Pellet in das Biosafety-Kabinett unter Laminar-Flow trocknen lassen.
    14. Nachdem die Pellets trocken ist, fügen Sie 75 μl RNAse frei, freie DNAse, steriles Wasser jedes Rohr.
    15. Quantifizieren Sie die resuspendierte DNA von einem Spektrophotometer zu und dann schicken Sie es für die 16 s rRNA-Gensequenzierung.

5. kurze Kette Fettsäuren (SCFA) Erkennung und Analyse

  1. Tauen Sie die gefrorenen Proben bei 40° C für 30 min und extrahieren Sie kurzkettigen Fettsäuren mit Diethylether im Verhältnis 2:1 (V: V) zu.
  2. Übertragen Sie die organische Phase zu einer GC/MS (siehe Tabelle der Materialien), ausgestattet mit einer Spalte, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm (siehe Tabelle der Materialien) wo 10 µL injiziert.
  3. Stellen Sie Port Einspritztemperatur und erste Säulentemperatur auf 260 ° C und 125 ° C bzw.. Halten Sie die Anfangstemperatur für 1 min, und dann erhöhen Sie diesen Wert auf 250 ° C, mit einer Spalte Durchflussmenge von 1 mL/min mehr als 11,5 min..
    Hinweis: Die MS-Temperatur für die Ionenquelle ist 220° C und 250° C für die Schnittstelle.
  4. Quantifizieren Sie die Menge an jeder SCFA mit Standardkurven und 2-Methylhexanoic Säure als interner Standard.

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Ergebnisse

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Das obige Protokoll beschreibt einrichten, Impfung und Ausführung einer 5-stufigen in-vitro-System um den Darm Microbiota des Dickdarms zu studieren. Zur Generierung der Daten dargestellt, nach DNA-Extraktion, 16 s rRNA Marker-gen DNA-Sequenzierung des Rayons V1V2 erfolgte mittels des hohen Durchsatzes Sequenzierung (z. B., MiSeq Illumina Plattform) durch das Mikrobiom-Zentrum an der Kinderklinik der Philadelphia-27. QIIME (Quantitative Einblicke in mikrob...

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Diskussion

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In-vitro-Kultivierung Systeme wurden entwickelt, um den Darm Microbiota des Dickdarms zu studieren. Sie verwenden Apparate entwickelt, um die physiologischen Bedingungen die Magen-Darm-Trakt, fördert das Wachstum einer Reifen Darm mikrobiellen Gemeinschaft für jeden Bereich des Dickdarms33zu simulieren. Während der Begriff logisch und nachvollziehbar ist, erfordert der tatsächlichen Ablauf des in-vitro-Kultivierung Systeme, der Darm Microbiota zu studieren Präzision und ein Verständnis dessen, was...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt. Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Publikation ist ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.

Danksagungen

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Frau Audrey Thomas-Gahring ist bekannt für ihre GC/MS arbeiten. Wir möchten auch Massimo Marzorati danken für das Manuskript zu bearbeiten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
TWINSHIMEProdigestNA
Definiertes Medium (Adult M-SHIME Wachstumsmedium mit Stärke)ProdigestNA
Masterflex SchlauchCole ParmerNA
Urin DrainagebeutelBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
StuhlprobeOpenbiomeNA
SpritzenBecton DicksonNA
Definiertes MediumProdigestNA
OxgallBedge Becton DicksonNA
PankreatinSigma-AldrichNA
GlaswarenAce GlassNA
SchweinemuzinSigma-AldrichNA
Bakteriologischer AgarSigma-AldrichNA
SterilisationsbeutelVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirkonium 0,1 mm Bead Beater TubeBenchmark ScientificNA
RNAsefrei, DNAse frei, steriles WasserRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzu
Stabilwax-DA Säule, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 & Mikro; mRestekNA
Kunststoff-MuzinträgerProdigestNA
NA

Referenzen

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