Hier ist ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung von Zellen in Poly(ethylene glycol) (PEG) Hydrogele funktionalisiert mit einem Fluorogenic Matrix-Metalloproteinase (MMP) präsentiert-abbaubar Peptid. Zelluläre MMP und Stoffwechselaktivität werden direkt von der Hydrogel-Kulturen mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen.
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Methodenartikel
Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme kurz zusammenfassen oft stärker in Vivo zellulären Reaktionen und Funktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur-Systeme. Messung der Zellfunktion in 3D Culture ist jedoch oft schwieriger. Viele biologische Assays erfordern Entnahme von Zellmaterial, die schwer in 3D Kulturen sein können. Ein Weg, um dieser Herausforderung zu begegnen ist, neue Materialien zu entwickeln, die Messung der Zellfunktion innerhalb des Materials zu ermöglichen. Hier ist eine Methode zur Messung der zellulären Matrix Metalloproteinase (MMP) Tätigkeit in 3D Hydrogele in einem 96-Well-Format präsentiert. In diesem System ist ein Poly(ethylene glycol) (PEG)-Hydrogel mit einem Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor funktionalisiert. MMP Zellaktivität ist proportional zur Fluoreszenzintensität und kann mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen werden. Miniaturisierung des Assays in eine 96-Well-Format reduziert den Zeitaufwand für experimentelle Einrichtung von 50 % und Reagenz Verwendung von 80 % pro Zustand im Vergleich zur vorherigen 24-Well-Version des Tests. Dieser Test ist auch kompatibel mit anderen Messungen der Zellfunktion. Beispielsweise wird ein Stoffwechselaktivität Assay hier demonstriert, die gleichzeitig mit MMP Aktivität Messungen innerhalb der gleichen Hydrogel durchgeführt werden können. Der Test zeigt sich mit menschlichen Melanomzellen gekapselt in einem Spektrum von Zelle Aussaat dichten um die entsprechende Kapselung Dichte des Arbeitsbereichs des Assays bestimmt. Nach 24 Stunden der Zelle Kapselung wurden MMP und metabolische Aktivität anzeigen proportional zur Zelle Dichte Aussaat. Während der Test hier mit einem Fluorogenic abbaubarem Substrat nachgewiesen wird, könnte der Assay und Methodik für eine Vielzahl von Hydrogel-Systemen und anderen fluoreszierenden Sensoren angepasst werden. Ein solcher Test bietet eine praktische, effiziente und leicht zugängliche 3D Kultivierung Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen.
Einleitung
Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme oft stärker rekapitulieren in Vivo zelluläre Reaktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur Systeme, siehe mehrere ausgezeichnete Veröffentlichungen1,2,3 . Jedoch Verwendung von 3D Culture Systeme zur Messung der Zellfunktion ist aufgrund der Schwierigkeiten der zellulären Abruf herausfordernd gewesen und probieren Sie weitere Verarbeitung. Diese Schwierigkeit schränkt die Messung vieler zellulärer Funktionen in 3D Culture-Systemen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, neue Techniken sind erforderlich, die einfache Mess....
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Protokoll
(1) Hydrogel Komponenten Vorbereitung
- Synthetisieren Sie die fluoreszierenden Protease-abbaubar Peptide wie beschrieben an anderer Stelle8, Nutzung von Fluorescein als fluoreszierende Molekül und Dabcyl als die Durstlöscher. Lösen Sie das Peptid in DMSO zu einer Konzentration von 10 mM und Shop in einem-80 ° C Gefrierschrank in klein (~ 30 µL) Aliquote wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu vermeiden.
Hinweis: Diese Peptide können auch kommerziell erworben werden. Dieses Protokoll erfordert eine C-terminalen Cystein in Peptidsequenz kovalente Einbindung in das Hydrogel-Polymer-Netzwerk zu ermöglichen. - Bereiten Sie 8 Arm 40 kDa....
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Ergebnisse
Der aktuelle Test wurde von einer zuvor entwickelt und zeichnet sich 3D Hydrogel Kultursystem funktionalisiert mit einem Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor8angepasst. Die hier verwendete Fluorogenic MMP-Sensor besteht aus einer Peptidsequenz, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ zeigt die Spaltstelle), die zuvor auf Spaltung von MMP-14 und MMP-1119optimiert wurde. Das Peptid trägt ein fluoreszierendes Molekül (Fluorescein) und einem Quencher-.......
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Diskussion
3D in-vitro-Zellkultur rekapituliert viele wichtige Aspekte der in-vivo-Umgebung. Aber 3D Culture macht auch Beurteilung der Zellfunktion und Signaltechnik, Herausforderung, möglichst viele biologische Assays erfordern zellulären abrufen und eine große Anzahl von Zellen. Daher die Entwicklung eines einfachen 3D Culture-System, das ermöglicht die Messung der Zellfunktion ohne weitere Probe Verarbeitung würde stark erhöhen den Nutzen von 3D Culture-Systeme. Die hier beschriebenen 3D-System kann für eine Vielzahl von unters.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren möchten Ohio Cancer Research (OCR), OH, USA für die Finanzierung dieser Arbeit sowie König Saud University (KSU), Riyadh, KSA für das sponsoring des ersten Autors bestätigen. Molekulargewicht von fluoreszierenden Peptid-Sensor wurde gemessen mit Matrix unterstützt, Laser Desorption-Ionisation, Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie mit Hilfe vom Campus chemische Instrument Center Massenspektrometrie und Proteomics Anlage an der Ohio State University.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1X Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Aktivkohle | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Schwarze 96-Well-Platte mit rundem Boden | Marke-Tech | 89093-600 | |
| Zelladhäsionspeptid (CRGDS) | GenScript USA Inc. | maßgeschneidertes | |
| Kollagenase-Enzym Typ I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965118 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hämozytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-abbaubarer Peptidvernetzer (KCGPQG↓ IWGQCK) | GenScript USA Inc. | maßgeschneidertes | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 UV-Licht | |
| UVP | 95-0006-02 |
Referenzen
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Ph....
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Nachdrucke und Genehmigungen
