Methodenartikel

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

DOI:

10.3791/59123

⸱

22. Januar 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier ist ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung von Zellen in Poly(ethylene glycol) (PEG) Hydrogele funktionalisiert mit einem Fluorogenic Matrix-Metalloproteinase (MMP) präsentiert-abbaubar Peptid. Zelluläre MMP und Stoffwechselaktivität werden direkt von der Hydrogel-Kulturen mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme kurz zusammenfassen oft stärker in Vivo zellulären Reaktionen und Funktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur-Systeme. Messung der Zellfunktion in 3D Culture ist jedoch oft schwieriger. Viele biologische Assays erfordern Entnahme von Zellmaterial, die schwer in 3D Kulturen sein können. Ein Weg, um dieser Herausforderung zu begegnen ist, neue Materialien zu entwickeln, die Messung der Zellfunktion innerhalb des Materials zu ermöglichen. Hier ist eine Methode zur Messung der zellulären Matrix Metalloproteinase (MMP) Tätigkeit in 3D Hydrogele in einem 96-Well-Format präsentiert. In diesem System ist ein Poly(ethylene glycol) (PEG)-Hydrogel mit einem Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor funktionalisiert. MMP Zellaktivität ist proportional zur Fluoreszenzintensität und kann mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen werden. Miniaturisierung des Assays in eine 96-Well-Format reduziert den Zeitaufwand für experimentelle Einrichtung von 50 % und Reagenz Verwendung von 80 % pro Zustand im Vergleich zur vorherigen 24-Well-Version des Tests. Dieser Test ist auch kompatibel mit anderen Messungen der Zellfunktion. Beispielsweise wird ein Stoffwechselaktivität Assay hier demonstriert, die gleichzeitig mit MMP Aktivität Messungen innerhalb der gleichen Hydrogel durchgeführt werden können. Der Test zeigt sich mit menschlichen Melanomzellen gekapselt in einem Spektrum von Zelle Aussaat dichten um die entsprechende Kapselung Dichte des Arbeitsbereichs des Assays bestimmt. Nach 24 Stunden der Zelle Kapselung wurden MMP und metabolische Aktivität anzeigen proportional zur Zelle Dichte Aussaat. Während der Test hier mit einem Fluorogenic abbaubarem Substrat nachgewiesen wird, könnte der Assay und Methodik für eine Vielzahl von Hydrogel-Systemen und anderen fluoreszierenden Sensoren angepasst werden. Ein solcher Test bietet eine praktische, effiziente und leicht zugängliche 3D Kultivierung Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme oft stärker rekapitulieren in Vivo zelluläre Reaktionen als herkömmliche zweidimensionale (2D) Kultur Systeme, siehe mehrere ausgezeichnete Veröffentlichungen1,2,3 . Jedoch Verwendung von 3D Culture Systeme zur Messung der Zellfunktion ist aufgrund der Schwierigkeiten der zellulären Abruf herausfordernd gewesen und probieren Sie weitere Verarbeitung. Diese Schwierigkeit schränkt die Messung vieler zellulärer Funktionen in 3D Culture-Systemen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, neue Techniken sind erforderlich, die einfache Messung der Zellfunktion in 3D-Umgebungen zu ermöglichen. Eine Möglichkeit, dieses Bedarfs ist die Entwicklung von Materialien, die nicht nur 3D Zellkultur zu unterstützen sondern auch Sensoren zur Messung der Zellfunktion. Zum Beispiel haben mehrere Hydrogel Systeme Fluorogenic Protease spaltbaren Moieties zur Visualisierung der Protease-Aktivität in 3D-Umgebungen4,5,6,7aktivieren aufgenommen. Während diese Systeme ursprünglich für mikroskopische Bildgebung genutzt wurden, können diese Systeme auch für die Verwendung in einem globalen Matrix-Metalloproteinase (MMP) Aktivität Assay mit einem standard Platte-Reader ermöglicht einfache Messung einer Zelle-Funktion in eine 3D angepasst werden Umwelt-8.

MMPs, eine Superfamilie von Zink Proteasen, spielen wichtige Rollen im Normalgewebe Homöostase und bei vielen Krankheiten. MMPs verschlechtern und umgestalten der extrazellulären Matrix (ECM), cleave Oberfläche Zellrezeptoren und Zytokine und aktivieren andere MMPs9,10. MMPs spielen eine kritische Rolle in physiologische Prozesse wie z. B. die Heilung von Wunden und Krankheiten wie Arthritis, Arteriosklerose, Alzheimer und Krebs (siehe Bewertungen in 9,10,11). Bei Krebs sind hohe MMP Ausdruck stark korreliert mit Krebsmetastasen und schlechte Prognose12. Darüber hinaus tragen MMPs zur Tumorprogression fördert Krebs Zelle Invasion und Migration, zelluläre Prozesse, die von Natur aus 3D Phänomene13,14sind. Daher gibt es viel Interesse in der Fähigkeit, die Aktivität der MMP in 3D Culture in vielen Kontexten, einschließlich grundlegende biologische Untersuchungen und Drogen-screening-Tests messen.

PEG-Hydrogele sind weit verbreitet für 3D Zellkultur aufgrund des hohen Wassergehaltes, Widerstand gegen Protein Adsorption und abstimmbaren Natur. PEG-Hydrogele haben mit einer Reihe von Moieties zur direkten Zellfunktion, wie z. B. funktionalisiert worden mit ECM mimetischen Peptiden wie RGD RLD und IKVAV zu erleichtern Zelladhäsion oder direkte Anbindehaltung von Wachstumsfaktoren wie Umwandlung Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 15,16. Vor kurzem haben PEG Hydrogele mit Sensor Peptide funktionalisiert worden, die Messung der Zellfunktion als gut5,8ermöglichen. Insbesondere die Verwendung von einem PEG Hydrogel System funktionalisiert mit einem Fluorogenic MMP abbaubar Peptid aktiviert Messung der Zellaktivität MMP in 3D Kulturen mit einem standard Platte Leser und benötigt keine weitere Bearbeitung. Diese Systeme sind auch kompatibel mit anderen Messungen der Zellfunktion, einschließlich metabolische Aktivität. Hier wird ein Protokoll für die Messung von MMP-Aktivität von Zellen in einer 3D PEG Hydrogel mit einem Fluorogenic MMP abbaubar Peptid funktionalisiert und vorgestellten Ergebnisse demonstrieren die anfänglichen Optimierung Experimente benötigt für den Einsatz dieser kultiviert beschrieben. Assay. Menschlichen Melanomzellen (A375) wurden in die Fluorogenic Hydrogele über einen Bereich der Aussaat dichten um die entsprechende seeding dichten bestimmen, die innerhalb des Arbeitsbereiches des Assays sind gekapselt. Nach 24 Stunden der Kapselung wurden MMP und metabolische Aktivität gemessen unter Verwendung eines standard Mikrotestplatte Lesers. Als nächstes war MMP-Aktivität auf metabolische Aktivität zu bestimmen, die Aussaat dichten innerhalb des linearen Bereichs des Assays normalisiert. Schließlich waren Intra-Platte Koeffizient der Variation Prozentsätze (% CV) zwischen Triplicates entsprechend die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse berechnet. Diese Methode ermöglicht einfaches und schnelles 3D Zellkultur und einfache Messung der Protease-Aktivität mit minimalen Probenverarbeitung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(1) Hydrogel Komponenten Vorbereitung

  1. Synthetisieren Sie die fluoreszierenden Protease-abbaubar Peptide wie beschrieben an anderer Stelle8, Nutzung von Fluorescein als fluoreszierende Molekül und Dabcyl als die Durstlöscher. Lösen Sie das Peptid in DMSO zu einer Konzentration von 10 mM und Shop in einem-80 ° C Gefrierschrank in klein (~ 30 µL) Aliquote wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu vermeiden.
    Hinweis: Diese Peptide können auch kommerziell erworben werden. Dieses Protokoll erfordert eine C-terminalen Cystein in Peptidsequenz kovalente Einbindung in das Hydrogel-Polymer-Netzwerk zu ermöglichen.
  2. Bereiten Sie 8 Arm 40 kDa Poly (Ethylenglycol) Amin (PEG)-Norbornen (NB) als17beschrieben. Ende Gruppe Funktionalisierung von mehr als 90 % mit 1H NMR zu überprüfen. PEG-NB in sterilen Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) 25 % w/V und bei-80 ° C Gefrierschrank in Aliquote (~ 300 µL) auflösen.
    Hinweis: PEG funktionalisiert mit Norbornen kann auch kommerziell erworben werden.
  3. Die Foto-Initiator Lithium Phenyl 2,4,6 Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) zu synthetisieren, wie an anderer Stelle18beschrieben. Runde in sterilem Wasser zu einer Konzentration von 68 mM auflösen und in einem-80 ° C Gefrierschrank in Aliquote (~ 300 µL) zu speichern.
    Hinweis: als Alternative Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) kann als Foto-Initiator verwendet werden. Runde und Irgacure können kommerziell erworben werden.
  4. Auflösen der MMP-abbaubar Peptid-Vernetzer (KCGPQG↓IWGQCK) und die Zelle Adhäsion Peptid (CRGDS) in sterilem Wasser zu einer Konzentration von 200 mM und 100 mM bzw., und speichern sie in einem-80 ° C Gefrierschrank (~ 300 µL und ~ 30 µL) Aliquote, beziehungsweise.

(2) Assay Medien Vorbereitung

  1. Bereiten Sie die Hitze-inaktivierten, Holzkohle abgestreift fetalen bovine Serum (FBS) für die MMP-Assay:
    Hinweis: Proteasen in FBS können eine hoher Hintergrund-Signal mit dem MMP-Assay produzieren; Daher, es wird empfohlen, Hitze zu inaktivieren und Kohle-Streifen der FBS für den Assay-Medien.
    1. 100 mL des FBS zu inaktivieren, durch Erhitzen für 30 min. bei 55 ° C.
      Hinweis: 100 mL FBS war hier für die Aliquotierung und Lagerung bei-20 ° C für eine spätere Verwendung genutzt. Kleinere Mengen können je nach Bedarf verwendet werden.
    2. Eine kleine Menge des FBS (ca. 5 mL) 0,25 % w/V von Aktivkohle und 0,025 % w/V von Dextran hinzu und rühren Sie, bis ein Brei entsteht. Dann fügen Sie ans Ende der FBS zugeben Sie und 30 min. bei 55 ° C.
    3. Zentrifuge auf 1.962 X g für 20 min bei 4 ° C. Dann ist den Überstand auf ein anderes Schiff zu übertragen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 aber bei 37 ° C, gefolgt von Schritt 2.1.3. Den Überstand mit einem 0,45 µm-Filter und dann einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren.
  2. Bereiten Sie Assay Medien mit Media ergänzt mit 1 % Holzkohle FBS, 2 mM L-Glutamin, 10 U/mL Penicillin, 10 µg/mL Streptomycin abgestreift.
    Hinweis: Medien ohne Phenol rot wird empfohlen, weil es weniger Fluoreszenz-Störung hat. Weitere Ergänzungen zu den Assay-Medien wie Insulin, Wachstumsfaktoren, etc.. zugesetzt werden, solange die Absorption und Fluoreszenz-Spektrum-Gipfel überschneiden sich nicht mit dem Sensor (494 nm/521 nm).
  3. Verdünnte bakterielle Kollagenase Enzym Typ I bei 10 bis 1.000 µg/mL in den Assay-Medien als Positivkontrolle.

3. Hydrogel Vorbereitung und Zelle Kapselung

  1. Bereiten Sie die Hydrogel-Vorläufer-Lösung.
    1. Fügen Sie die Reagenzien zu einem 1,5 mL-Tube in der folgenden Reihenfolge, aufschütteln nach Zugabe der einzelnen Komponenten: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM Vernetzer MMP abbaubar Peptid, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM Runde und 0,25 mM Fluorogenic MMP abbaubar Peptid.
      Hinweis: Tabelle 1 zeigt, Hydrogel Vorläufer Lösung Inhalt, Lager Konzentrationen, arbeiten Konzentrationen Volumen Berechnungsformeln und die geforderten Mengen zu 120 µL Hydrogel-Vorläufer-Lösung, die ausreicht, um durchzuführen benötigt eine Experimentieren Sie mit 10 Hydrogele. Um für den Verlust der Hydrogel-Lösung durch Pipettieren zu berücksichtigen, das Gesamtvolumen von 20 %. Die kommerzielle Peptide werden oft in einem sauren Wasserstoff-Chlorid-Lösung geliefert. Daher wird NaOH hinzugefügt, um eine endgültige pH von 7 zu erreichen. pH-Wert der Endlösung sollte vom Benutzer bestätigt werden.
    2. Die Hydrogel-Vorläufer-Lösung in mehreren 1,5 mL Röhrchen unterteilen eine Röhre pro Zustand getestet.
      Hinweis: Mehrere Kontrolle Bedingungen in denen Hydrogele, ohne den Zusatz von Zellen bereit sind werden vorgeschlagen. Für eine Negativkontrolle kann um unspezifische Verschlechterung des Sensors Fluorogenic berücksichtigen eine Hydrogel Bedingung inkubiert werden, mit der Fahrzeugsteuerung oder die experimentelle Medien allein gibt es keine Behandlungsbedingungen. Für eine positive Kontrolle und Kalibrierung zwischen Experimente können Hydrogele mit einer Protease, die bekanntermaßen Fluorogenic Sensor cleave inkubiert werden. Zum Beispiel wurden zwei Konzentrationen von bakteriellen Collagenase hier verwendet.
  2. Zellen in Hydrogele zu Kapseln.
    1. Bereiten Sie eine einzelne Zelle Federung je nach Zelltyp verwendet wird. Zum Beispiel Waschen Sie einen 10 cm Teller der A375 Melanomzellen mit 10 mL PBS. Trypsinize Zellen unter Verwendung von 0,05 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 3 min. Anzahl Zellen mit einer Hemocytometer Zelle Summe Anzahl bestimmen.
    2. Zentrifugieren Sie die Zelle-Lösung bei 314 X g für 3 min, aspirieren Sie Nährmedien, dann wieder auszusetzen Sie Zellen mit PBS-Puffer auf ca. drei Mal die höchste erforderliche Aussaatdichte für das Experiment. Beispielsweise war eine Zellsuspension mit einer Dichte von 21 x 106 Zellen hier verwendet, um eine endgültige gekapselte Dichte von 7 x 106 Zellen/mL zu erreichen.
    3. Zählen Sie die Zellen erneut, um eine genaue Zellkonzentration sicherzustellen.
    4. Jedes Rohr Hydrogel-Vorläufer-Lösung entsprechend der erforderlichen Aussaatdichte (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 x 106 Zellen/mL in diesem Beispiel) suspendierten Zellen und PBS hinzufügen. Bedingungen mit keine Zellen anstelle von suspendierten Zellen PBS hinzufügen.
      Hinweis: Alle Bedingungen sollte das gleiche letzte Hydrogel Vorläufer Lösung Volumen um das Verhältnis zwischen der Hydrogel-Komponenten sicherzustellen und PBS ist konstant. Tun Sie nicht Vortex-Rohre, die Zellen in ihnen, pipette kräftig nach oben und unten ohne Luftblasen zu schaffen, um die Vorläufer-Lösung zu mischen.
    5. 10 µL der Hydrogel-Vorläufer-Lösung in eine sterile schwarze Runde unten 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Spitze in der Mitte jedes gut zentriert ist, unter Verzicht auf zu verzichten.
    6. Polymerisieren Sie Hydrogel-Vorläufer-Lösung durch die Aufdeckung der Platte, ultra violett (UV) Licht am 4 mW/cm2 für 3 min.
      Hinweis: Die UV-Lampe (UVL-56 Handheld-UV-Lampe, UVP, Upland, CA) produziert einer langwelligen UV UV-A Licht (365 nm), das hat keinen Einfluss auf die zelluläre Lebensfähigkeit.
    7. Alle Vertiefungen mit Ausnahme der Positivkontrolle Bedingungen ohne eingekapselte Zellen 150 µL Assays Medien hinzufügen. Die Positivkontrollen fügen Sie 150 µL Enzymlösung Kollagenase hinzu.
    8. Die äußere Vertiefungen der Platte zur Verringerung der Verdunstung während der Inkubation fügen Sie 150 µL PBS hinzu.

(4) MMP und Stoffwechselaktivität Messung

  1. Messung der Fluoreszenz sofort nach Kapselung zu etablieren eine Baseline-Fluoreszenz-Messung und Einheitlichkeit in Hydrogel Polymerisation zu gewährleisten. Lesen Sie die Platte mit einem Fluoreszenz-Mikrotestplatte Scannen Leser unter Verwendung einer undurchsichtigen 96-Well-Platte-Protokoll mit einer Fläche Einstellung bei 494 nm/521 nm (Anregung/Emission). Dies wird die 0 h zu lesen sein.
  2. Inkubieren Sie Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 18 h.
  3. Fügen Sie Stoffwechselaktivität Reagenz (Resazurin) am 01:10 (V/V) für jedes gut.
  4. Inkubieren Sie Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für weitere 6 h.
    Hinweis: Diese Inkubationszeit variieren je nach Zelltyp.
  5. Fluoreszenz bei 24 h Post-Kapselung zu messen. Lesen Sie die Platte mit einem Fluoreszenz-Mikrotestplatte Scannen Leser unter Verwendung einer undurchsichtigen 96-Well-Platte-Protokoll mit einer Fläche bei 494 nm/521 nm (Anregung/Emission) für MMP-Aktivität und 560 nm/590 nm (Anregung/Emission) für die Stoffwechselaktivität.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der aktuelle Test wurde von einer zuvor entwickelt und zeichnet sich 3D Hydrogel Kultursystem funktionalisiert mit einem Fluorogenic MMP spaltbaren Sensor8angepasst. Die hier verwendete Fluorogenic MMP-Sensor besteht aus einer Peptidsequenz, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ zeigt die Spaltstelle), die zuvor auf Spaltung von MMP-14 und MMP-1119optimiert wurde. Das Peptid trägt ein fluoreszierendes Molekül (Fluorescein) und einem Quencher-...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D in-vitro-Zellkultur rekapituliert viele wichtige Aspekte der in-vivo-Umgebung. Aber 3D Culture macht auch Beurteilung der Zellfunktion und Signaltechnik, Herausforderung, möglichst viele biologische Assays erfordern zellulären abrufen und eine große Anzahl von Zellen. Daher die Entwicklung eines einfachen 3D Culture-System, das ermöglicht die Messung der Zellfunktion ohne weitere Probe Verarbeitung würde stark erhöhen den Nutzen von 3D Culture-Systeme. Die hier beschriebenen 3D-System kann für eine Vielzahl von unters...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten Ohio Cancer Research (OCR), OH, USA für die Finanzierung dieser Arbeit sowie König Saud University (KSU), Riyadh, KSA für das sponsoring des ersten Autors bestätigen. Molekulargewicht von fluoreszierenden Peptid-Sensor wurde gemessen mit Matrix unterstützt, Laser Desorption-Ionisation, Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie mit Hilfe vom Campus chemische Instrument Center Massenspektrometrie und Proteomics Anlage an der Ohio State University.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1X Phosphatgepufferte KochsalzlösungFisher Scientific10-010-049
Aktivkohle Sigma-AldrichC3345
Schwarze 96-Well-Platte mit rundem BodenMarke-Tech89093-600
Zelladhäsionspeptid (CRGDS)GenScript USA Inc.maßgeschneidertes
Kollagenase-Enzym Typ I Life Technologies17100-017
DextranSigma-AldrichD4876
DMEMInvitrogen11965118
Fötales Rinderserum (FBS)Seradigm1500-500
Fluoreszenz-Mikroplatten-ReaderBioTekCytation 3
HämozytometerHausser Scientific Co.3200
L-GlutaminLife Technologies25030-081
MMP-abbaubarer Peptidvernetzer (KCGPQG↓ IWGQCK)GenScript USA Inc.maßgeschneidertes
NaOHFisher ScientificS318500
Penicillin /StreptomycinLife Technologies15140-122
Resazurin (Alamar Blue)Life TechnologiesDAL1100 UV-Licht
UVP95-0006-02
mit hohem Glukosegehalt

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

3D HydrogeleMatrix Metalloproteinase Aktivit tAssay zur metabolischen Aktivit tFluoreszenzsensorMikroplattenleseger tHydrogel Vorl uferl sungZellverkapselungUV PolymerisationFluoreszenzintensit tA375 Melanomzellen

Verwandte Artikel