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Methodenartikel

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

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DOI:

10.3791/59175

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20. Oktober 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

Zusammenfassung

Der Modellorganismus C. elegans bietet ein ausgezeichnetes System zur Durchführung von In-vivo-Calcium-Bildgebung. Sein transparenter Körper und seine genetische Manipulierbarkeit ermöglichen die gezielte Expression genetisch kodierter Kalziumsensoren. Dieses Protokoll skizziert den Einsatz dieser Sensoren für die In-vivo-Bildgebung der Kalziumdynamik in Zielzellen, insbesondere der Körperwandmuskulatur der Würmer. Durch die Verwendung der Ko-Expression von präsynaptischem Kanalrhodopsin kann die Stimulation der Acetylcholin-Freisetzung aus exzitatorischen motorischen Neuronen mit blauen Lichtimpulsen induziert werden, was zu einer Muskeldepolarisation und reproduzierbaren Veränderungen des zytoplasmatischen Kalziums führt. Ebenen. Zwei Schneckenimmobilisierungstechniken werden mit unterschiedlichen Schwierigkeitsgraden besprochen. Der Vergleich dieser Techniken zeigt, dass beide Ansätze die Physiologie der neuromuskulären Kreuzung erhalten und die reproduzierbare Quantifizierung von Kalziumtransienten ermöglichen. Durch die Kombination von Optogenetik und funktioneller Kalziumbildgebung können Veränderungen der postsynaptischen Kalziumhandhabung und Homöostase in einer Vielzahl mutierter Hintergründe bewertet werden. Die vorgestellten Daten validieren sowohl Immobilisierungstechniken als auch untersucht speziell die Rolle des C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase und des calciumaktivierten BK Kaliumkanals in der Körperwandmuskel-Calciumregulation.

Einleitung

Dieses Papier stellt Methoden zur In-vivo-Calcium-Bildgebung von C. elegans Körperwandmuskeln mit optogenetischer neuronaler Stimulation vor. Die Kombination eines muskelexprimierten genetisch kodierten Kalziumindikators (GECI) mit blauem Licht löste eine neuronale Depolarisation aus und bietet ein System, um die evozierten postsynaptischen Calciumtransienten klar zu beobachten. Dies vermeidet den Einsatz elektrischer Stimulation, was eine nicht-invasive Analyse von Mutanten ermöglicht, die die postsynaptische Kalziumdynamik beeinflussen.

Single-Fluorophor-GECIs, wie GCaMP, verwenden ein einzelnes fluoreszierendes Proteinmolekül, das mit der M13-Domäne der Myosin-Lichtkettenkinase an seinem N-Terminal-Ende und Calmodulin (CaM) am C-Terminus verschmolzen wird. Bei der Kalziumbindung erfährt die CaM-Domäne, die eine hohe Affinität zu Kalzium aufweist, eine Konformationsänderung, die eine nachfolgende Konformationsänderung im fluoreszierenden Protein zur Folge hat, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität1führt. GCaMP Fluoreszenz ist bei 488 nm angeregt, so dass es ungeeignet ist, in Verbindung mit Channelrhodopsin verwendet zu werden, das eine ähnliche Anregungswellenlänge von 473 nm hat. Um Kalziummessungen mit der Stimulation des Kanalrhodopsins zu koppeln, muss daher das grüne fluoreszierende Protein von GCaMP durch ein rotes fluoreszierendes Protein, mRuby (RCaMP), ersetzt werden. Die Verwendung des muskelausgedrückten RCaMP in Kombination mit der cholinergen motorischen Neuronenexpression von Channelrhodopsin ermöglicht Studien an der neuromuskulären Schnittstelle des Wurms (NMJ) bei gleichzeitiger Anwendung von Optogenetik und funktioneller Bildgebung innerhalb desselben Tieres. 2.

Der Einsatz von Channelrhodopsin umgeht die Notwendigkeit der elektrischen Stimulation, um die neuromuskulären Knoten von C. eleganszu depolarisieren, die nur in sezierten Präparaten erreicht werden können, wodurch diese Technik sowohl einfacher zu verwenden als auch präziser zu machen ist. wenn bestimmte Gewebe gezielt werden. Zum Beispiel, Channelrhodopsin wurde zuvor in C. elegans verwendet, um bestimmte Neuronen reversibel zu aktivieren, was entweder zu einer robusten Aktivierung der exzitatorischen oder hemmenden Neuronen3,4. Der Einsatz einer lichtstimulierten Depolarisation umgeht auch das Problem der neuronalen Schäden durch die direkte elektrische Stimulation. Dies bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen vieler verschiedener Stimulationsprotokolle, einschließlich anhaltender und wiederholter Stimulationen, auf die postsynaptische Kalziumdynamik4zu untersuchen.

Die transparenzliche Natur von C. elegans macht es ideal für die fluoreszierende bildgebende funktionelle Analyse. Jedoch, bei der Stimulierung der exzitatorischen Acetylcholin-Neuronen an der NMJ, Tiere werden erwartet, mit einer sofortigen Muskelkontraktion reagieren4, so dass die Immobilisierung der Würmer entscheidend bei der Visualisierung diskreter Kalziumveränderungen. Traditionell werden pharmakologische Wirkstoffe verwendet, um die Tiere zu lähmen. Ein solches Medikament verwendet wird, ist Levamisol, ein cholinerge Acetylcholin-Rezeptor-Agonist5,6,7. Da Levamisol zur anhaltenden Aktivierung eines Subtyps von exzitatorischen Muskelrezeptoren führt, ist dieses Reagenz für die Untersuchung der Muskelkalziumdynamik ungeeignet. Die Wirkung von Levamisol induziert eine postsynaptische Depolarisation, erhöht das zytosolische Kalzium und schließt Beobachtungen nach präsynaptischer Stimulation aus. Um die Verwendung von lähmenden Medikamenten zu vermeiden, untersuchten wir zwei alternative Methoden, um C. elegansimmobilisieren. Die Tiere wurden entweder verklebt und dann aufgeschnitten, um die Körperwandmuskeln freizulegen, ähnlich der bestehenden C. elegans NMJ Elektrophysiologie-Methode8, oder Nanoperlen wurden verwendet, um intakte Tiere immobilisieren9. Beide Verfahren ermöglichten reproduzierbare Messungen der ruhenden und evozierten Muskelkalziumtransienten, die leicht quantifizierbar waren.

Die Methoden in diesem Papier können verwendet werden, um die grundlegenden zytosolischen Kalziumspiegel und Transienten in postsynaptischen Körperwandmuskelzellen in C. eleganszu messen. Beispiele für Daten, die die beiden verschiedenen Immobilisierungstechniken verwenden, werden genannt. Beide Techniken nutzen die Optogenetik, um die Muskelzellen ohne elektrische Stimulation zu depolarisieren. Diese Beispiele zeigen die Machbarkeit dieser Methode bei der Bewertung von Mutationen, die die postsynaptische Kalziumbehandlung in den Würmern beeinflussen, und weisen auf die Vor- und Nachteile der beiden Immobilisierungsansätze hin.

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Protokoll

1. Mikroskop-Setup

  1. Verwenden Sie ein zusammengesetztes Mikroskop mit Fluoreszenzfähigkeiten. Für diese Studie wurden Daten auf einem aufrechten Mikroskop(Materialtabelle) gesammelt, das zur Anregung mit LEDs ausgestattet war.
  2. Um Fluoreszenzänderungen in den Körperwandmuskeln richtig zu visualisieren, verwenden Sie ein zielweises hohe Vergrößerung.
    1. Für sezierte Präparate verwenden Sie ein 60x NA 1.0 Wasserimmerziel (Materialtabelle).
    2. Für Präparate mit Nanoperlen verwenden Sie ein 60x NA 1.4 Öl Immersion objektiv (Tabelle der Materialien). Diese Vergrößerung sorgt für eine ausreichende Auflösung der Muskeln auf den Kamerasensor.
  3. Verwenden Sie eine hochempfindliche Kamera, die am Mikroskop befestigt ist, um Bilder mit einer hohen Bildrate zu erfassen, um schnelle Veränderungen des Kalziumspiegels zu verfolgen. Für diese Studie, Bild mit einem sCMOS-System (Tabelle der Materialien) in der Lage, Vollbild-Bildgebung bei 100 Hz, wie Anstiegszeiten für die Ca2+ Signale können so schnell wie Dutzende von Millisekunden sein.
  4. Steuerung der Kameraaufnahme und LED-Fluoreszenzanregung mit einer Micro-Manager-Software, die in ImageJ10 gemäß den Anweisungen des Herstellers läuft (Materialtabelle).
  5. Verwenden Sie ein Open-Source-E-Mail-Plugin, das ein externes Open-Source-Mikrocontroller-Board (Tabelle der Materialien )verbindet, um die externen Timing-Impulse zu verwalten, um die Fluoreszenzerregung zu steuern.
    HINWEIS: Digitale Outs sind von den digitalen Pins 8 bis 13 verfügbar, die die Ausgangsbits 0 bis 5 bereitstellen. Diese können als Basiswerte von 1, 10, 100 usw. adressiert werden. Die Einstellungen für serielle Ports sind in Tabelle 1 angegeben und auf der Micro-Manager-Website (Materialtabelle )verfügbar. Firmware für das Mikrocontroller-Board ist ebenfalls auf dieser Website verfügbar.
  6. Um die Timing-Logik zu steuern, aktivieren Sie das Micromanager-Erfassungsprotokoll in der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Dies initiiert gleichzeitig eine voreingestellte Kamerarahmendauer und die Anzahl der zu aktivierenden Frames sowie den logischen Verschluss und die voreingestellte Gelbe LED für die Fluoreszenzerregung. In diesem Fall wird der gelbe LED-Vollzustandsschalter über den Mikrocontroller-Bit 1-Ausgang durch Pin 9 gesteuert. Die Kamera rahmen TTL (Rückplatte aus 3 Stecker) löst einen Stimulator aus. Dies genau mal die Aktivierung der Blaulicht-LED zur Aktivierung von Channelrhodopsin zu einem festgelegten Zeitpunkt nach Aktivierung der Bildsequenz.
  7. Um Channelrhodopsin mit blauem Licht zu stimulieren und RCaMP-Änderungen aufzuzeichnen, verwenden Sie zwei LEDs. Aktivieren Sie Channelrhodopsin mit einer LED mit einer Spitzenemissionswellenlänge von 470 nm und einem Bandpassfilter (455 bis 490 nm) und erregen Sie RCaMP mit einer LED mit einer Peak-Emissionswellenlänge von 594 nm und einem Bandpassfilter (570 bis 600 nm).
  8. Um kanalrhodopsin gleichzeitig zu aktivieren und Veränderungen der RCaMP-Fluoreszenzwerte zu erfassen, beleuchten Sie beide LEDs und übertragen Sie das Licht mit einem dichroitischen Strahlkombinator auf denselben optischen Pfad.
  9. Steuern Sie das Timing der LED-Beleuchtung mit Festkörperschaltern(Materialtabelle), die durch TTL-Signale gesteuert werden (maximale Einschaltzeit, 1 ms, Abschaltzeit 0,3 ms: 0 bis 90 % Einschalt- und Ausschaltzeit von < 100 s).
  10. Stellen Sie die LED-Intensität mit den stromgesteuerten linearen Netzteilen mit geringem Rauschen ein (Tabelle der Materialien).
  11. Um das genaue Timing der Blaulicht-LED zu gewährleisten, aktivieren Sie sie direkt per TTL-Impuls vom Stimulator aus an das Festkörperrelais. Programmieren Sie das Blaulichtstimulationsprotokoll in einen Stimulator (Tabelle der Materialien), der als präziser Timer vom Beginn der Bildaufnahme bis zur blauen LED-Beleuchtung fungiert. Schalten Sie in diesem Experiment die Blaulichtstimulation nach 2 s nur rCaMP-Fluoreszenz ein und verwenden Sie einen Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen mit 50 ms Interpulsintervallen, um Channelrhodopsin zu aktivieren.
    HINWEIS: Die Verzögerung vor blaulichten Impulsen, die Dauer der Blaulichtimpulse, die Zeit zwischen den Impulsen und die Anzahl der Impulse im Zug können an dieser Stelle eingestellt werden und sollten die spezifischen Parameter von experimentellem Interesse widerspiegeln.

2. C. elegans Probenvorbereitung und Datenerfassung

  1. Um präsynaptische Neuronen optisch zu stimulieren, erhalten Tiere, die Kanalrhodopsin in exzitatorischen cholinergen Neuronen exprimieren, angetrieben mit der Unc-17-Promotorregion, und RCaMP, ausgedrückt in allen Körperwandmuskeln, die mit dem Myo-3-Promotor angetrieben werden Region2.
    HINWEIS: Es wird nur die Verwendung von Tieren mit integrierten Transgenen und robusten Fluoreszenzgehalten empfohlen, da die variable Expression in den entsprechenden Zelltypen die Zuverlässigkeit der Datenerfassung beeinträchtigen kann.
  2. Machen Sie einen Arbeitsbestand vonAll-Trans-Retinal durch Verdünnung der Netzhautpulver ( Tabelle derMaterialien) in Ethanol, um eine endgültige Konzentration von 100 mM zu schaffen und lagern bei -20 °C. Dieser Arbeitsbestand wird für etwa ein Jahr stabil bleiben.
  3. Erstellen Sie einen Bestand von OP50 E. coli, der in LB-Medien angebaut wird, ergänzt durchAll-Trans-Retinal aus dem Arbeitsbestand in Schritt 2.2, bei einer Endkonzentration von 80 m. Das für den OP50+Retinal-Bestand verwendete Volumen hängt von der Anzahl der für das Experiment erforderlichen Platten ab.
  4. Samennematoden-Wachstumsmedienplatten (NGM) mit ca. 300 l op50+retinalen Vorrat und lassen Platten bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht trocknen.
  5. Wachsen C. elegans Stämme bis zum gewünschten Alter im Dunkeln auf OP50 + retinale NGM Platten bei 20 °C. Verwenden Sie für dieses Experiment erwachsene Würmer.
    1. Für das Experiment mit der sezierten Zubereitung, verwenden Sie nur gravid erwachsene Würmer als Durchführung der Sezieren an jüngeren, kleineren Tieren ist extrem anspruchsvoll. Lassen Sie die Tiere für eine effektive Kanalrhodopsin-Aktivierung mindestens 3 Tage auf den OP50-Retinalen Platten.
  6. Wenn Sie das sezierte Präparat8,11 (Abbildung 1A) verwenden, führen Sie Sezierungen bei schwachem Licht durch.
    1. Legen Sie die Tiere in eine Sezierensteller mit einer silikonbeschichteten Deckslipbasis, die mit einer 1 mM Ca2+ extrazellulären Lösung bestehend aus 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM Glukose, 5 mM Saccharose und 15 mM HEPES (pH 7.3) gefüllt ist. , -340 Osm).
    2. Kleben Sie Tiere mit dem flüssigen topischen Hautkleber mit blauer Färbung entlang der Dorsalseite des Wurms und machen Sie einen seitlichen Cuticle-Schnitt entlang der Leim-Wurm-Schnittstelle mit Glasnadeln.
    3. Verwenden Sie eine Mundpipette, um die innere Eingeweide aus der Wurmhöhle zu löschen.
    4. Kleben Sie die Nagelhautklappe des Tieres herunter, um die ventralen medialen Körperwandmuskeln für die Bildgebung freizulegen.
  7. Bei Verwendung des Nanoperlenpräparats (Abbildung 1B)
    1. Machen Sie eine geschmolzene 5% Agarose-Lösung mit ddH2O bis zu einem Endvolumen von 100 ml.
    2. Mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen geschmolzener Agarose-Lösung auf eine Glasrutsche legen und sofort eine zweite Glasrutsche über die Oberseite legen, senkrecht zur ersten, mit sanftem Druck, um ein gleichmäßiges Agarose-Pad zu schaffen. Entfernen Sie die obere Folie vor der Verwendung.
    3. Fügen Sie etwa 4 L Polystyrol-Nanoperlen (Tabelle der Materialien) in die Mitte des Agarose-Pads.
    4. Wählen Sie bei schwachem Licht 4-6 C. Elegane in die Nanobead-Lösung, um sicherzustellen, dass die Tiere nicht übereinander liegen, und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlappen auf die Oberseite.
  8. Legen Sie die vorbereitete Rutsche oder Sezierschale auf das Mikroskop, und finden und konzentrieren Sie sich auf einen Wurm mit 10-facher Vergrößerung und trüber heller Feldbeleuchtung.
  9. Wechseln Sie zu 60x Vergrößerung und RCaMP Fluoreszenzerregung, um einen ventromedialen Körperwandmuskel zu identifizieren, der vor der Vulva und in der richtigen Fokalebene ist.
    HINWEIS: Muskeln, die der Vulva voranstehen, werden ausgewählt, da sie Muskeln reflektieren, die häufig in elektrophysiologischen Experimenten stimuliert werden.
  10. Ändern Sie den Bildweg vom Okular zur Kamera, indem Sie den Umschalter herausziehen und innerhalb der Datenerfassungssoftware (Tabelle der Materialien )auf Live klicken.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsweg für blaues Licht an dieser Stelle ausgeschaltet ist, um sicherzustellen, dass das Channelrhodopsin vor der Aufnahme von Bildern nicht aktiviert wird.
  11. Fokussieren Sie das Bild innerhalb der Datenerfassungssoftware mit dem Mikroskop Feinfokus.
  12. Sobald der Muskel klar im Fokus ist, schalten Sie das Live-Bild aus, indem Sie auf die Live-Taste klicken.
  13. Klicken Sie auf die ROI-Schaltfläche in der Datenerfassungssoftware, und erstellen Sie eine Box um den Muskel, auf den sie fokussiert sind.
  14. Schalten Sie am Stimulator den zuvor in Schritt 1.10 programmierten Blaulichtstimulationsweg ein.
  15. Klicken Sie in der Bildverarbeitungssoftware auf Übernehmen, um das Bild über die CMOS-Kamera zu erfassen. Stellen Sie dazu die Belichtungszeit mit 1.000 Frames und 2x Binning auf 10 s ein.

3. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Datendatei in der Bildverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien) und skizzieren Sie mit dem Polygon-Toolden Interessensmuskel. Das ist der ROI.
  2. Gehen Sie zu Bild | Stapel | Plotten Sie das Z-Achsenprofil und exportieren Sie die resultierenden Datenpunkte in die Tabellenkalkulationssoftware (Tabelle der Materialien). Diese Funktion zeichnet den Mittelwert der ROI-Auswahl im Vergleich zum Zeitpunkt.
  3. Verschieben Sie den Mitdemkraft-ROI des Muskels, der mit dem Polygon-Werkzeug außerhalb des Tieres erstellt wurde, um eine Fluoreszenzmessung im Hintergrund mithilfe der in 3.2 beschriebenen Schritte zu erhalten. Exportieren Sie die resultierenden Daten in die Tabellenarbeitsmappe.
  4. Subtrahieren Sie in der Tabellenarbeitsmappe die Hintergrundfluoreszenzwerte von den Muskelfluoreszenzwerten zu jedem Zeitpunkt. Dadurch wird das im Hintergrund subtrahierte Fluoreszenzsignal zur Verfügung.
  5. Durchschnitt der im Hintergrund subtrahierten Fluoreszenz für die ersten 2 s Datenpunkte. Dadurch wird die Basisfluoreszenzmessung F.
  6. Verwenden Sie die Basisfluoreszenzmessung, um den normalisierten Fluoreszenzpegel zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Verwenden Sie dazu die Gleichung (F/F)+1. F steht für (F(t)-F), wobei F(t) die Fluoreszenzmessung zu einem bestimmten Zeitpunkt und F der Basiswert ist. Die +1 wird als y-Achsenversatz hinzugefügt.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.6 für jedes gesammelte Muskelbild. Die Verwendung einzelner oder mehrerer Muskelzellen pro Bild liegt im Ermessen des Forschers. Das n des Experiments kann durch durchführung einer Leistungsanalyse bestimmt werden.
  8. Verwenden Sie die verarbeiteten Daten aus den Schritten 3.2-3.6, um eine Spur der Fluoreszenzwerte in der Graphik-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien) zu erstellen.
  9. Messen Sie anhand dieser Spur die Kinetik des Kalziumtransienten, wie z. B. Anstieg auf Spitzenzeit und halbzerfallszeit, mit den Indizierungswerkzeugen gemäß den Anweisungen des Herstellers.

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Ergebnisse

Diese Technik bewertete Veränderungen bei Mutanten, von denen angenommen wird, dass sie die Kalziumhandhabung oder Muskeldepolarisation beeinflussen. Die Grundfluoreszenzspiegel und fluoreszierenden Transienten wurden visualisiert und ruhende zytosolische Kalzium- und Calciumkinetik innerhalb des Muskels wurden ausgewertet. Es ist wichtig, dass die Tiere mindestens drei Tage lang auf All-Trans-Retina angebaut wurden, um die erfolgreiche Integration der Netzhaut zu gewährleisten und so ans...

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Diskussion

GECIs sind ein leistungsfähiges Werkzeug in c. elegans Neurobiologie. Frühere Arbeiten haben Kalzium-Bildgebungstechniken verwendet, um eine Vielzahl von Funktionen in Neuronen und Muskelzellen zu untersuchen, einschließlich sensorischer und Verhaltensreaktionen, mit verschiedenen Methoden der Stimulation. Einige Studien haben chemische Reize verwendet, um Kalziumtransienten in sensorischen ASH-Neuronen22,23 auszulösen oder Kalziumwellen in den Rachenmus...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Alexander Gottschalk für ZX1659, den RCaMP und Channelrhodopsin mit Wurmstamm, Dr. Hongkyun Kim für den Slo-1(eg142) Wurmstamm und das National Bioresource Project for the sca-1(tm5339) Wurmstamm.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
all-trans retinalSigma-AldrichR2500Notwendig für die Anregung des Kanals Rhodopsin
Amber LEDRCaMP Beleuchtung
Arduino UNOMouser782-A000066Steuert die Fluoreszenzbeleuchtung
Blaue LED-Kanalrhodopsinbeleuchtung
BX51WI Mikroskop OlympusFestes Verbundmikroskop
Stromgesteuertes, rauscharmes lineares NetzteilAmetekSorensonSteuert die LED-Intensität
Igor ProWavemetricsWavemetrics.comGrafiksoftware
ImageJNIHimagej.nih.govBildverarbeitungssoftware
LUMFLN 60x Wasser NA 1.4OlympusWasserimmersionsobjektiv für Präparierung für Präparierung
Master-8 StimulatorA.M.P.IMaster-Timer für Bildaufnahme und LED-Beleuchtung
Micro-Managermicro-manager.orgSteuert Kameraerfassung und LED-Anregung
Microsoft ExcelMicrosoftTabellenkalkulationssoftware
pco.edge 4.2 CMOS-Kamerapco.4.2Hochgeschwindigkeitskamera
PlanApo N 60x Öl NA 1.4OlympusÖl-Immersionsobjektiv für die Herstellung von Nanokügelchen
Polybead-MikrosphärenPolysciences, Inc.00876-15Immobilisierung
von Schnecken SensataTechnologies Crydom CMX100D6Steuert das Timing der LED-Beleuchtung
Transgener Stamm, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		Richmond LabSY1627Exzitatorisches neuronales Channelrhodopsin und Körperwandmuskel RCaMP exprimierende Wurmlinie mit SERCA-mutiertem Allel
Transgener Stamm, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		Richmond LabExzitatorisches neuronales Kanalrhodopsin und Körperwandmuskel RCaMP, das eine Wurmlinie mit Kalzium-aktiviertem BK-Kaliumkanal-mutiertem Allel exprimiert
Transgener Stamm, [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		Gottschalk LabZX1659Exzitatorisches neuronales Kanalrhodopsin und Körperwandmuskel RCaMP exprimierende Wurmlinie
Für Halbleiterschalter zur

Referenzen

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
  3. Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  4. Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
  5. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
  6. Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  7. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
  8. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
  9. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
  10. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
  11. Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
  12. Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
  13. Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
  14. Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
  15. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  16. Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
  17. Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
  18. Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
  19. Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
  20. Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
  21. Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
  22. Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
  23. Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
  24. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
  25. Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
  26. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
  27. Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
  28. Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).

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