Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein experimentelles Protokoll zur Bewertung der morphologischen Eigenschaften und des Funktionellen Status von Bandsynapsen bei normalen Mäusen. Das vorliegende Modell eignet sich auch für lärminduzierte und altersbedingte Cochlea-Synaptopathie-eingeschränkte Modelle. Die korrelativen Ergebnisse früherer Mausstudien werden ebenfalls diskutiert.

Abstract

Cochlea-Innenhaarzellen (IHCs) übertragen akustische Signale über Bandsynapsen an Spiralganglionneuronen (SGNs). Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass Haarzellsynapsen die ersten Ziele bei sensorineuralem Hörverlust (SNHL) sein können. Solche Studien haben das Konzept der Cochlea "Synaptopathie" vorgeschlagen, die sich auf Veränderungen der Bandsynapse Zahl, Struktur oder Funktion, die in abnormale synaptische Übertragung zwischen IHCs und SGNs führen bezieht. Während Cochlea-Synaptopathie irreversibel ist, wirkt sie sich nicht auf die Hörschwelle aus. In lärminduzierten Versuchsmodellen wird eine eingeschränkte Schädigung von IHC-Synapsen in ausgewählten Frequenzregionen eingesetzt, um die Umweltfaktoren zu identifizieren, die speziell Synaptopathie verursachen, sowie die physiologischen Folgen der Störung dieses Innenohrs. bahn. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Morphologie und Funktion der Cochlea-Synaptik bei erwachsenen Mäusen vor. In diesem Protokoll wird die Cochlea-Lokalisierung bestimmter Frequenzregionen mittels Ortsfrequenzkarten in Verbindung mit Cochleogramm-Daten durchgeführt, woraufhin die morphologischen Eigenschaften von Bandsynapsen mittels synaptischer Immunostaining. Der Funktionelle Status von Bandsynapsen wird dann auf der Grundlage der Amplituden der auditiven Brainstem Response (ABR) Welle I bestimmt. Der vorliegende Bericht zeigt, dass dieser Ansatz genutzt werden kann, um unser Verständnis der Pathogenese und Mechanismen der synaptischen Dysfunktion in der Cochlea zu vertiefen, die bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen helfen können.

Introduction

Frequenzen im Bereich von ca. 20bis220.000 Hz können vom Menschen als akustische Reize wahrgenommen werden. Das menschliche Gehör ist normalerweise am empfindlichsten in der Nähe von 1.000 Hz, wobei der durchschnittliche Schalldruckpegel bei jungen Erwachsenen bei 20 Pa liegt (d. h. 0 Dezibel Schalldruckpegel [dB SPL]). Unter bestimmten pathologischen Bedingungen ist der Hörverlust auf bestimmte Frequenzen beschränkt. Beispielsweise kann in den frühen Stadien des lärminduzierten Hörverlusts (NIHL) eine "Notch" (d. h. eine Höhe des Hörschwellenwerts) im Audiogramm bei 4 kHz¹beobachtet werden. Entlang der Cochlea-Partition des Säugetiers erzeugen....

Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NRC/ILAR Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage) durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Capital Medical University, Peking, China, genehmigt.

1. Tierauswahl

1. Für alle Experimente verwenden Sie erwachsene C57BL/6J männliche Mäuse (8 Wochen alt) als Tiermodell.
   HINWEIS: C57BL/6J-Mäuse, die eine Spleißvariante des Cdh23 tragen, zeigen eine beschleunigte Seneszenz im Hörsystem, die sich als 40%iger Verlust von Bandsynapsen an der Basaldrehung der Cochlea und einen Verlust von 10% in d....

Results

ABR-Hörtests wurden an 10 C57BL/6J-Mäusen (8 Wochen alt) unter Anästhesie durchgeführt. ABRs wurden mit Tonburstreizen bei 4, 8, 16, 32 und 48 kHz ausgelöst. Die Hörschwelle jedes Tieres wurde visuell durch die Unterscheidung von mindestens einer klaren Wellenform im ABR festgestellt. Alle Mäuse wiesen ABR-Schwellenwerte als Reaktion auf Tonausbrüche auf, die je nach Frequenz des Stimulus zwischen 25 und 70 dB SPL lagen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hörschwelle mit 16 kHz am niedrigsten war (A.......

Discussion

Da die Cochlea-Synaptopathie erstmals bei erwachsenen Mäusen mit einer temporären Schwellenverschiebung (TTS) charakterisiert wurde, die durch 8-u201216 kHz Oktavbandrauschen bei 100 dB SPL für 2 h³¹induziert wurde, haben Forscher die Auswirkungen der Synaptopathie in verschiedenen Säugetiere, einschließlich Affen und Menschen^32,33. Neben der Lärmexposition wurden mehrere andere Erkrankungen mit cochlea-Synaptopathie in Verbindung gebracht.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaminhydrochlorid	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
Xylazinhydrochlorid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-1251	10 mg/kg
TDT-Physiologiegerät	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig Software	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
Electric Pad	Pet Fun	11072931136
Dumont Pinzette 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0203-3-PO
Dumont Pinzette 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0209-5-PO
Stereo-Dissektionsmikroskop	Nikon Corp., Tokio, Japan	SMZ1270
Ziegenserum	ZSGB-BIO, Peking, China	ZLI-9021
Anti-Glutamatrezeptor 2, extrazellulär, Klon 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, USA	MAB397	Maus
Gereinigte Maus Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	Maus
Alexa Fluor 568 Anti-Maus-IgG1-Antikörper	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21124	Ziege
Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgG2a-Antikörper	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21131
Eindeckmedium mit DAPI	ZSGB-BIO, Peking, China	ZLI-9557
Konfokale Fluoreszenzmikroskopie	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland	TCS SP8 II
Image Pro Plus Software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	Version 6.0
Professionelles diagnostisches Taschen-Otoskop	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai, China	HS-OT10
Nadelelektrode	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, China	1029	20 mm, 28 G
Nahfeld Referent	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	CF1