Summary
I mulini a volo sono strumenti importanti per confrontare il modo in cui l'età, il sesso, lo stato di accoppiamento, la temperatura o vari altri fattori possono influenzare il comportamento di volodiun insetto. Qui descriviamo i protocolli per legare e misurare la propensione al volo e le prestazioni del verme di mais occidentale in diversi trattamenti.
Abstract
Il verme di mais occidentale, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), è un parassita economicamente importante del mais negli Stati Uniti settentrionali. Alcune popolazioni hanno sviluppato resistenza alle strategie di gestione tra cui il mais transgenico che produce tossine insetticide derivate dal batterio Bacillus thuringiensis (Bt). La conoscenza della dispersione del tiofilo del mais occidentale è di fondamentale importanza per i modelli di evoluzione, diffusione e mitigazione della resistenza. Il comportamento di volo di un insetto, soprattutto su una lunga distanza, è intrinsecamente difficile da osservare e caratterizzare. I mulini a volo forniscono un mezzo per testare direttamente gli impatti dello sviluppo e fisiologici e le conseguenze del volo in laboratorio che non possono essere ottenuti negli studi sul campo. In questo studio, i mulini di volo sono stati utilizzati per misurare la tempistica dell'attività di volo, il numero totale di voli e la distanza, la durata e la velocità dei voli effettuati da vermi della radice femminili durante un periodo di prova di 22 ore. Sedici mulini di volo sono stati alloggiati in una camera ambientale con illuminazione programmabile, temperatura e controllo dell'umidità. Il mulino di volo descritto è di un disegno tipico, dove un braccio di volo è libero di ruotare circa un perno centrale. La rotazione è causata dal volo di un insetto legato a un'estremità del braccio di volo e ogni rotazione viene registrata da un sensore con un timestamp. I dati grezzi vengono compilati da software, che vengono successivamente elaborati per fornire statistiche riepilogative per i parametri di volo di interesse. Il compito più difficile per qualsiasi studio del mulino di volo è l'attaccamento del collegatore all'insetto con un adesivo, e il metodo utilizzato deve essere adattato a ciascuna specie. L'attacco deve essere abbastanza forte da tenere l'insetto in un orientamento rigido e per prevenire il distacco durante il movimento, senza interferire con il movimento naturale dell'ala durante il volo. Il processo di attacco richiede destrezza, finezza e velocità, rendendo le riprese video del processo per rootworms di valore.
Introduction
Il verme di mais occidentale, Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae), è stato identificato come un parassita di mais coltivato nel 19091. Oggi, è il più importante parassita del mais(zea mays L.) nella cintura di mais degli Stati Uniti, con la farina che si nutre di radici di mais causando la maggior parte della perdita di resa associata a questo parassita. Si stima che i costi annuali per la gestione e le perdite di produzione di mais dovuti a rootworm di mais superino i 1 miliardo di dollarie 2. Il verme di radice del mais occidentale è altamente adattabile, e le popolazioni hanno sviluppato resistenza a molteplici strategie di gestione tra cui insetticidi, rotazione delle colture e mais Bttransgenico 3 . La determinazione delle dimensioni spaziali su quali tattiche devono essere applicate per mitigare lo sviluppo locale della resistenza, o un hotspot di resistenza, dipende da una migliore comprensione della dispersione4. Le misure di mitigazione non avranno successo se sono limitate a una scala spaziale troppo piccola intorno a un hotspot di resistenza, perché gli adulti resistenti si disperderanno oltre l'area di mitigazione5. Comprendere il comportamento di volo del tiofilo occidentale è importante per creare piani di gestione della resistenza efficaci per questo parassita.
Dispersione in volo svolge un ruolo importante nella storia della vita del verme di mais occidentale adulto e l'ecologia6, e il comportamento di volo di questo parassita può essere studiato in laboratorio. Diversi metodi possono essere utilizzati per misurare il comportamento di volo in laboratorio. Un actografo, che limita il volo in un piano verticale, può misurare la quantità di tempo in cui un insetto è impegnato in volo. Gli atografi sono stati utilizzati per confrontare la durata del volo e i modelli di periodicità dei maschi e delle femmine della radice del mais occidentale a diverse età, dimensioni del corpo, temperature, suscettibilità agli insetticidi e esposizione agli insetticidi7,8, 9. Le gallerie di volo, che consistono in una camera di monitoraggio e da un flusso d'aria diretto, sono particolarmente utili per esaminare il comportamento di volo degli insetti quando si segue un pennacchio di odore, come i componenti del feromone candidato10 o le sostanze volatili delle piante11. I mulini a volo sono forse il metodo più comune per gli studi di laboratorio sul comportamento di volo degli insetti e possono caratterizzare diversi aspetti della propensione e delle prestazioni di volo. Mulini di volo di laboratorio sono stati impiegati negli studi di radice di mais occidentale per caratterizzare la propensione a fare voli brevi e sostenuti, nonché il controllo ormonale del volo sostenuto12,13.
I mulini a volo forniscono un modo relativamente semplice per studiare il comportamento del volo degli insetti in condizioni di laboratorio, consentendo ai ricercatori di misurare vari parametri di volo, tra cui la periodicità, la velocità, la distanza e la durata. Molti dei mulini di volo utilizzati oggi sono derivati dalle rotatorie di Kennedy et al.14 e Krogh e Weis-Fogh15. I mulini di volo possono essere diversi per forma e dimensioni, ma il principio di base rimane lo stesso. Un insetto è legato e montato su un braccio orizzontale radiale che è libero di ruotare, con attrito minimo, circa un albero verticale. Mentre l'insetto vola in avanti, il suo percorso è limitato al giro in un piano orizzontale, con la distanza percorsa per rotazione dettata dalla lunghezza del braccio. Un sensore viene in genere utilizzato per rilevare ogni rotazione del braccio causata dall'attività di volo dell'insetto. I dati grezzi includono rotazioni per unità di tempo e ora del volo del giorno. I dati vengono inseriti in un computer per la registrazione. I dati provenienti da più mulini di volo sono spesso registrati in parallelo, essenzialmente simultaneamente, con banche di 16 e 32 mulini di volo comuni. I dati grezzi vengono ulteriormente elaborati da un software personalizzato per fornire valori per variabili quali la velocità di volo, il numero totale di voli separati, la distanza e la durata volati e così via.
Ogni specie di insetto è diversa quando si tratta del metodo migliore per il tethering a causa di variabili morfologiche come le dimensioni complessive, le dimensioni e la forma dell'area bersaglio per attaccare il legatore, la morbidezza e la flessibilità dell'insetto, il bisogno e il metodo per anestesizzazione, potenziale per incrostazioni delle ali e / o testa con adesivo fuori luogo o overflow, e molti, molti più dettagli. Nei casi di tethering visualizzato di un insetto plataspitico16 e di un coleottero ambrosia17, le rispettive aree bersaglio per l'attaccamento del tethering sono relativamente grandi e perdonando il posizionamento adesivo impreciso perché la testa e le ali sono un po 'in qualche modo separati dal sito dell'allegato. Questo non è quello di minimizzare la difficoltà di antetempo questi insetti, che è impegnativo per qualsiasi specie. Ma il verme di mais occidentale è un insetto particolarmente impegnativo da legarsi: il pronotum è stretto e corto, rendendo l'attaccamento molto preciso con una minima quantità di adesivo (cera dentale in questo caso) necessario per prevenire interferenze con l'apertura dell'elytra per il volo e con la testa, dove il contatto con gli occhi o le antenne può influenzare il comportamento. Allo stesso tempo, il legame deve essere saldamente attaccato per evitare lo sloggiamento da questo forte volantino. La dimostrazione del tethering degli adulti rootworm è l'offerta più importante in questo documento. Dovrebbe essere di aiuto per gli altri che lavorano con questo o insetti simili dove il metodo visualizzato qui potrebbe essere un'opzione utile.
Questo documento descrive i metodi utilizzati per legare e caratterizzare efficacemente l'attività di volo degli adulti dello rootworm di mais occidentale che sono stati allevati a diverse densità larve. I mulini di volo e i software utilizzati in questo studio (Figura 1) sono stati ricavati da disegni pubblicati su Internet da Jones et al.18 Le tecniche di tethering sono state modificate dalla descrizione in Stebbing et al. 9 Una serie di 16 mulini a volo è stata modificata dalla descrizione in Stebbing et al.9 Una serie di 16 mulini di volo è stata in una camera ambientale, progettata per controllare l'illuminazione, l'umidità e la temperatura (Figura 2). Utilizzando questa o simile configurazione insieme con le seguenti tecniche consente di testare i fattori che possono influenzare la propensione al volo e le prestazioni del verme della radice di mais occidentale, tra cui età, sesso, temperatura, fotoperiodo, e molti altri.
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Protocol
1. Radice di mais posteriore occidentale per i test di volo
NOTA: Se l'età dell'adulto deve essere controllata o conosciuta, gli adulti devono prima essere raccolti sul campo seguiti dall'allevamento della loro prole all'età adulta per i test. Se l'età dello scarabeo o un ambiente di allevamento standardizzato non è preoccupante, allora testare direttamente gli adulti raccolti sul campo può essere possibile, e il protocollo può iniziare con il passo 2.
- Raccogliere almeno 500 adulti radice di mais occidentale da un campo di grano di interesse per garantire abbastanza uova sono ottenuti per l'allevamento di un numero adeguato di adulti. Utilizzare un aspiratore manuale per raccogliere adulti dal campo.
NOTA: Si consiglia di raccogliere gli adulti durante l'abbondanza di picco, intorno alla fine di luglio nella cintura di mais degli Stati Uniti, per garantire la raccolta di entrambi i sessi. La maggior parte degli adulti saranno maschi se raccolti in precedenza, mentre la maggior parte sarà femmine se raccolti in seguito. - Collocare gli adulti maschi e femmine raccolti in una gabbia a rete contenente l'orecchio di mais tritato, il tessuto foglia di mais, l'1,5% di solido agar e un substrato di oviposizione. Una gabbia 18 x 18 x 18 cm (dimensione della maglia 44 x 32, apertura di 650 m) può contenere fino a 500 adulti contemporaneamente.
- Utilizzare il mais coltivato nel campo come fonte di orecchio di mais, che sarà prelevato presso la R3, o stadio di latte di sviluppo kernel19. Il kernel R3 è giallo all'esterno, mentre il fluido interno è bianco lattea a causa dell'amido accumulato. Le orecchie di mais possono essere congelate e conservate fino a un anno fino a quando non sono necessarie. Per alimentare il verme, rimuovere la buccia e tritare il mais in sezioni trasversali orizzontali di circa 3 cm di spessore. Il mais tritato è la dieta primaria per gli adulti e dovrebbe essere cambiato due volte a settimana.
- Ottenere foglie da piante di mais coltivate a effetto serra di qualsiasi età. La quantità di tessuto fogliare varierà con il numero di adulti nella gabbia. Evitare di utilizzare piante da campo, in quanto possono introdurre malattie.
- Per fare l'agar solido, mescolare 15 g di polvere di agar con 1 L di acqua DI. Riscaldare il composto fino a ebollizione. Versare il liquido nei piatti Petri (100 mm x 15 mm) mentre è caldo. Mettere un coperchio sul piatto Petri una volta raffreddato e metterli in celle frigorifere (6gradi centigradi). Agar fornisce agli adulti una fonte di umidità e dovrebbe essere cambiato due volte a settimana.
- Per preparare un substrato di oviposizione, mettete 40 g di terreno setacciato (<180 m) in un piatto Petri. Inumidire il terreno con acqua deionizzata. Assicurarsi che il terreno sul fondo della piastra Petri sia bagnato. Segnare la parte superiore del terreno inumidito con uno strumento ago. Rimuovere il substrato di oviposizione settimanalmente e metterlo in un'incubatrice a 25o C e il 60% RH per almeno un mese.
- Dopo aver incubato le uova per un mese, lavare il contenuto del substrato di oviposizione attraverso un setaccio di 250 m fino a quando tutto il terreno non è stato rimosso. Quantificare le uova mettendo le uova lavate in un cilindro graduato da 10 mL. Ci sono circa 10.000 uova per 1 mL.
- Collocare le uova quantificate in un contenitore da 44 mL e coprire con terreno sorseggiato (<180 m). Uova di tiofilo occidentale subiscono diapausa obbligato durante l'inverno20. Per rompere la diapausa, mettere le uova in un deposito freddo (6o C) per almeno 6 mesi.
NOTA: Le uova possono essere conservate in celle frigorifere per più di 5 mesi, ma la vitalità delle uova diminuisce con il tempo. Dopo 12 mesi, potrebbe esserci poco o nessun portello. - Dopo un minimo di 5 mesi, togliere le uova dalla conservazione a freddo e metterle in un'incubatrice a 25o C e al 60% di RH. I neonati si schiudono già 16 giorni dopo la rimozione dalla conservazione a freddo.
- Una volta che le uova si schiudono, mettere tre chicchi germinati sul fondo di un contenitore di plastica da 44 ml con radici esposte (cioè non coperte di terreno). Utilizzare un pennello setole morbide per trasferire 12 neonati sulla superficie delle radici.
- Aggiungere 4,5 mL di acqua DI a 40 mL di terreno setacciato (<600 m). Posizionare il terreno inumidito sui chicchi germinati che sono stati infestati da neonati e coprire il contenitore con tessuto mesh per evitare che le larve fuggano.
- Lo stesso giorno in cui il contenitore di plastica da 44 mL è impostato con neonati, preparare un contenitore da 473 mL con chicchi di mais che non hanno germogliato. Le larve di rootworm saranno trasferite in questo contenitore più grande più tardi. Il numero di chicchi determina la densità larvale desiderata per pianta. Aggiungere 120 g di miscela di terreno composta da un terreno di terreno setacciato del 50% (<600 m) e il 50% di terreno in vaso inumidito con 20 ml di acqua deionizzata.
- Dopo 7 giorni, trasferire tutti i contenuti del contenitore da 44 mL al contenitore da 473 mL. Le larve saranno seconde instars al momento del trasferimento.
NOTA: Questo trasferimento in un contenitore più grande è necessario per fornire alle larve abbastanza massa radicale per l'alimentazione attraverso l'upupazione. - Osservare l'emergere di adulti in genere circa 26 giorni dopo la schiusa dell'uovo. Gli adulti sono volantini attivi all'emergere e possono sfuggire al contenitore da 473 mL quando tentano di raccoglierli a mano. Invece, utilizzare un vuoto con un aspiratore per raccogliere gli adulti.
- Segregare gli adulti per sesso e/o data se necessario per i test comparativi. Sesso di radice di mais occidentale può essere determinato osservando la morfologia dei basitarsi protoracico21. I maschi hanno un'ampia basitarsi protoracica a forma quadrata, mentre quelli delle femmine sono stretti e a forma conica.
- Mettere il coleottero in una fiala di plastica in polistirolo trasparente da 45 ml e coprire con un coperchio con 6 piccoli fori (diametro di 1 mm).
- Anestesizza lo scarabeo. Posizionare l'estremità di un tubo collegato a un regolatore di serbatoio CO2 sopra i fori nel coperchio e consentire un flusso delicato di CO2 per entrare nel tubo per circa 10 a 15 s fino a quando l'adulto perde la presa sulla parete della fiala.
NOTA: L'insetto anetizzato rimarrà immobilizzato per circa 1 min. - Posizionare il coleottero anestesizzato, lato ventrale verso l'alto, sul fondo di un piatto di petri di plastica invertito. Posizionare con cura il coperchio non invertito del piatto di Petri sopra lo scarabeo. Assicurarsi che i tarsi del coleottero prechino contro il coperchio, consentendo una facile osservazione dei basitarsi protoracici sotto un microscopio sezionato.
- Se l'esperimento richiede che i coleotteri siano accoppiati prima del volo, usa i maschi di almeno 5 giorni per accoppiarsi con le femmine appena emerse.
NOTA: L'uso di maschi più anziani assicura che siano sessualmente maturi dopo la loro introduzione alle femmine vergini. Le femmine sono sessualmente mature all'emersione adulta, mentre i maschi richiedono da 5 a 7 giorni di sviluppo post-emergenza per raggiungere la maturità sessuale22,23.
2. Avviare il programma software del mulino di volo prima del test di volo
NOTA: I file di programma del mulino di volo (.vi estensioni di file che girano in una piattaforma software commerciale, vedere Table of Materials) e i dettagli per il loro utilizzo sono forniti per il download tramite link ("routine di analisi dei dati" e "Istruzioni per il mulino a volo circolare", nella sezione "Cablaggio e software del mulino di volo" sulsito web di Jones et al. Se i programmi non funzionano più nelle versioni più recenti o future della piattaforma software, o se l'utente vuole aggiungere nuove funzionalità, le routine fornite da Jones et al. 18 possono essere modificate dall'utente in base alle esigenze.
- Aprire il programma software flight mill (Figura 3).
- Immettere le informazioni nella scheda Inizializzazione.
- Impostare l'ora di inizio e l'ora di fine per la durata desiderata del test di volo.
NOTA: Tutti gli adulti devono essere legato e montati su mulini di volo entro 30 minuti prima dell'ora di inizio. Può portare una persona esperta da 30 min a 45 min per il collegamento e preparare 16 coleotteri per i test di volo (vedi Sezione 3). - Impostare la soglia di min (min) su 0. Ciò garantisce che qualsiasi rilevamento del passaggio del braccio di volo sarà registrato, ed è l'impostazione predefinita raccomandata da Jones et al. 18.
- Impostare soglia massima (min) su 1. Qui, è stato utilizzato 1 min. Questo valore significa che deve trascorrere 1 min tra il rilevamento del sensore del braccio di volo per "chiamare" la fine di un volo.
- Immettere un nome per il file.
- Impostare Intervallo registro dati non elaborati (min) su 1. Questo valore controlla l'intervallo in cui i dati non elaborati verranno compilati per i report di output. Qui, è impostato su 1 min. Così, l'output delle rivoluzioni, ad esempio, verrà registrato al minuto.
NOTA: l'intervallo di tempo effettivo tra la scansione elettronica dell'attività del sensore è molto breve, ma un intervallo di 1 min consente di registrare su una scala sufficientemente fine per la maggior parte degli scopi di ricerca, limitando il numero di righe nell'output del foglio di calcolo a un numero ragionevole per esaminare a occhio.
- Impostare l'ora di inizio e l'ora di fine per la durata desiderata del test di volo.
- Nella scheda Informazioni sull'oggetto, compilare le colonne etichettate ID, dieta, sesso, specie e commenti come desiderato.
- Fare clic sul pulsante START situato sul lato sinistro del display dello schermo. Il programma inizierà a raccogliere dati non elaborati una volta che l'ora corrente corrisponderà all'ora di inizio.
3. Tether western corn rootworm to flight mill
- Piegare un filo d'acciaio di 28 metri di lunghezza di 40 mm di 90 gradi al centro.
NOTA: Il filo può anche essere di un altro metallo come rame o ottone. - Prendi una piccola quantità di cera dentale, leggermente più grande di una testa di spillo, e rotolala tra la punta delle dita fino a formare una palla. Assicurarsi che le dita siano pulite per evitare che detriti, sporcizia e olio si incorporino nella cera, perché potrebbe impedire alla cera di aderire all'insetto.
- Spingere un'estremità dei 40 mm il filo piegato al centro della palla di cera.
- Anestesizzare l'adulto di prova con CO2 come descritto sopra (vedere 1.11.1 e 1.11.2).
- Posizionare l'adulto anestesizzato su una superficie piana e posizionare il suo lato dorsale verso l'alto. Se lo scarabeo non giace completamente piatto sulla superficie, riposizionare le gambe in modo che lo faccia. È importante che lo scarabeo si trovi il più piatto possibile sulla superficie per garantire il corretto posizionamento del filo.
- Brevemente (< 1 s) riscaldare la cera dentale sul filo con un accendino butano. Se la cera viene riscaldata troppo a lungo, la cera fusa scenderà dal filo. Non riutilizzare la cera se è caduta dal filo, in quanto non aderisce efficacemente alla cuticola dell'insetto.
- Posizionare con attenzione l'estremità del filo d'acciaio con la cera dentale fusa sulla superficie dorsale del pronotum, indicando l'altra estremità del filo (cioè l'estremità senza cera dentale), lungo la linea mediana dell'addome. In alternativa, puntare l'estremità del filo senza la cera dentale verso la testa, se lo si desidera. In tal caso, uno scarabeo volante spingerà il braccio di volo invece di tirarlo. Assicurarsi che la cera fusa non entri nell'eliseo o nelle sue suture, in quanto può prevenire o ostacolare il volo.
- Posizionare l'estremità libera del filo nell'apertura del tubo metallico cavo del braccio del mulino di volo. Assicurarsi che il filo si adatti abbastanza stretta da resistere in posizione per attrito. Lo scarabeo legato può essere posizionato per volare in senso orario o antiorario.
- Subito dopo aver montato uno scarabeo, strappa un piccolo pezzo di carta velina da un tessuto più grande. Offrire il pezzo di tessuto allo scarabeo legato appeso al mulino di volo per il contatto tarsale; la maggior parte dei coleotteri afferrerà il tessuto e lo terrà contro la gravità fino a quando non lo rilasciano all'inizio della loro prima attività di volo. Questo ridurrà notevolmente il comportamento iniziale di fuga o di atterraggio di volo.
NOTA: La presenza umana nella sala prove di volo dovrebbe essere limitata al fissaggio e alla rimozione degli adulti dai mulini di volo. Il periodo di prova di solito non inizia fino a quando non sono trascorsi almeno 30 minuti dal momento dell'attaccamento (vedere Nota in meno di 2.2.1), e gli esseri umani non dovrebbero essere presenti nella sala di volo durante questo periodo o durante il periodo di prova stesso. - Rimuovere tutti gli adulti sottoposti a test di volo dopo il completamento di un test del mulino di volo. Rimuovere il tallone di cera che collega il cavo al pronotum sbucciando delicatamente il filo lontano dal pronotum. La cera si separerà facilmente senza danneggiare la cuticola, rendendo l'insetto disponibile per ulteriori esperimenti, se lo si desidera.
4. Salvare i dati raccolti dal programma di mulino di volo.
- Il programma può essere impostato su MANUAL o AUTO. Se il programma è impostato su manuale, l'utente deve terminare il programma facendo clic sul pulsante STOP. Se il programma è impostato su AUTO, la raccolta di dati non elaborati verrà interrotta una volta che l'ora corrente corrisponde all'ora di fine.
- Fare clic su EXIT al termine del periodo di test di volo.
- Assicurarsi che un file TDMS venga salvato con il nome del file immesso durante l'inizializzazione del programma (passaggio 2.2).
- Fare clic sul file TDMS e salvare il documento come foglio di calcolo (xlsx).
5. Recuperare i parametri di volo dal foglio di calcolo salvato (.xlsx)
NOTA: Un foglio di calcolo può essere progettato su misura per manipolare l'output di dati grezzi dal software del mulino di volo. Qui, il programma software era lo stesso descritto da Jones et al. 18, ma è stata aggiunta una routine aggiuntiva per riconoscere e riassumere il più lungo volo ininterrotto da parte di un singolo insetto durante il periodo di prova.
- Per ogni persona che ha partecipato all'attività di volo, il foglio di calcolo includerà le seguenti informazioni: numero di volo, rivoluzioni totali, ora di inizio, ora di fine e durata del volo in minuti.
- Per calcolare la distanza totale percorsa durante il periodo di prova, sommare la colonna denominata 'Total Revs' e moltiplicarla per la distanza percorsa per rivoluzione. La distanza per rivoluzione dipende dalla lunghezza del braccio di volo dal perno centrale all'insetto attaccato. Ad esempio, se questa distanza è di 15,9 cm, ogni rivoluzione equivale a un metro volato. Il numero totale di rivoluzioni può essere trovato anche nella scheda 'Statistiche test'.
- Per calcolare la durata totale volate durante il periodo di prova, sommare la colonna denominata 'Durata volo (min)'.
- Per determinare la distanza e la durata del volo ininterrotto più lungo, vai alla scheda "Statistiche di prova" e cerca sotto la colonna "Volo più lungo".
- La velocità di volo può essere calcolata dividendo la distanza percorsa per durata del volo. Per gli insetti, la velocità è comunemente espressa in m/s o km/h.
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Representative Results
La figura 4 mostra esempi rappresentativi di output previsti dopo i test di volo. I dati di volo sono stati ottenuti da un lavoro sperimentale condotto presso il Dipartimento di Entomologia dell'Iowa State University. Gli adulti della radice di mais occidentale, vecchia di sei giorni, accoppiata, è stata legato a mulini di volo e collocata in una camera ambientale controllata impostata a 14:10 L:D, 60 % RH e 25o C. I coleotteri sono stati lasciati sui mulini di volo per 22 ore consecutive a partire da 30 minuti prima dell'inizio dell'alba simulata, e la loro attività di volo è stata registrata (Figura 4). L'alba e il crepuscolo sono stati simulati da un graduale cambiamento programmato e graduale dell'intensità della luce da full-off a full-on all'alba (o viceversa al crepuscolo) per un periodo di 30 minuti. La prima scheda del foglio di calcolo risultante riepiloga i singoli adulti testati, utilizzando le informazioni immesse dal passaggio 2.3. Le schede successive includono i dati di volo per ogni individuo. Le ultime due schede sono etichettate come "RAW DATA" e "Test Stats". "RAW DATA" include il tempo di attività di volo per tutti gli individui. 'Statistiche di prova' indica il volo ininterrotto più lungo per ogni coleottero, e i riepiloghi della durata del volo ininterrotto più lungo in minuti, il tempo totale trascorso in volo durante il periodo di prova in minuti e il numero totale di rivoluzioni durante il periodo di prova. Gli indicatori di data e ora per l'inizio e la fine di ogni volo indipendente consentono l'analisi della periodicità di volo.
Per lo scarabeo femminile legato al mulino di volo #2(Figura 4B), il foglio di calcolo mostra il numero di voli, le rivoluzioni totali per volo, l'ora di inizio e di fine di ogni volo e la durata di ogni volo. Questa donna impegnata in diversi voli indipendenti, la maggior parte dei quali erano molto brevi. Tuttavia, in volo #5 la femmina ha viaggiato 1.258 m (che corrisponde al numero di rivoluzioni in questo caso, perché la distanza per rivoluzione era di 1 m) su un periodo di 37,8 min di volo ininterrotto. Il coleottero femmina legato al mulino di volo #1 (Figura 4C) non si è impegnato in volo durante il periodo di prova, quindi viene visualizzato un foglio di calcolo vuoto.
Ad esempio, i risultati sono presentati da un semplice confronto delle caratteristiche di volo tra due gruppi di tiofili occidentali femminili. Gli adulti sono stati raccolti in campi di grano commerciali da due località dell'Iowa e hanno permesso di oviposit in laboratorio. Le uova sono state raccolte, e la prole allevata come descritto nel passaggio 1 del protocollo ad una densità post-neonata (passaggio 1.9) di 12 larve per 36 piantine. Le femmine adulte risultanti sono state leterate e testate come descritto nei passaggi 2 e 3. La tabella 1 mostra un riepilogo dei parametri di volo dai dati grezzi recuperati dal software del mulino di volo, come descritto nei passaggi 4 e 5. I parametri di volo totali si riferiscono alla somma di tutti i voli di un individuo durante il periodo di prova di 22 ore, mentre i parametri di volo più lunghi si riferiscono al volo ininterrotto più lungo durante la prova.
Figura 1. Mulini di volo per insetti utilizzati per esperimenti con tethered. (A) Intero mulino per il volo degli insetti e (B) porzione di lavoro del mulino di volo. (A) La parte di lavoro del mulino di volo è cerchiata, (B) (1) 1 m braccio di volo tubo ipodermico, (2, 3) respingere magneti ad anello ferrite, (4) sensore effetto Hall digitale, (5) piccolo magnete anello di nichel utilizzato per attivare il sensore, e (6) tubo a parete sottile ipodermico ("perno centrale") che separa i magneti repellenti (2,3). Mulini di volo leggermente modificati dal design originale di Jones et al.18 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Componenti della camera ambientale del mulino di volo. (A) Le caratteristiche della camera esterna includono (1) controller Intellus, (2) pannello di controllo e (3) disconnessione dell'alimentazione principale. (B) Le caratteristiche della camera interna includono (1) refrigeratori di unità (dietro il pannello del soffitto), (2) moduli LED, (3) unità di scaffalatura e (4) umidificatore a pan. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Un'interfaccia del programma software flight mill. (A) La prima scheda, denominata "Inizializzazione", richiede informazioni, tra cui l'ora di inizio e di fine e il nome del file. (B) La seconda scheda, denominata "Informazioni sul soggetto", non richiede l'immissione di informazioni, ma viene utilizzata per distinguere più persone valutate in un unico test di volo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Dati di volo rappresentativi da coleotteri di rootworm occidentali di 6 giorni. (A) La prima scheda dell'output riassume le informazioni su sette persone che hanno fatto il test di volo in un determinato giorno. (B) Dati di volo per la donna sul mulino di volo #2 (FM-2), che ha partecipato a più voli indipendenti durante il periodo di prova di 22 ore. (C) La femmina posta sul mulino di volo #1 (FM-1) non ha effettuato il volo durante il periodo di prova di 22 ore, risultando in un foglio di calcolo vuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| posizione | |||
| Ames | Nashua | ||
| Dimensione del campione1 | 23 | 31 | |
| Distanza totale di volo (m) | 387,83 x 146,21 | 949,10 - 267,73 | |
| Durata totale del volo (min) | 14,34 - 5,06 | 37,01 - 10,51 | |
| Velocità di volo totale (m/s) | 0,42 x 0,04 | 0,44 x 0,06 | |
| Distanza di volo più lunga (m) | 184,48 - 81,82 | 590,13 - 186,01 | |
| Durata del volo più lunga (min) | 6,27 x 2,26 | 22,15 x 7,67 | |
| Velocità di volo più lunga (m/s) | 0,46 - 0,04 | 0,44 x 0,03 | |
| 1 Volato almeno 1 minuto | |||
Tabella 1. Prestazioni meschine (SE) sui mulini di volo di tiofilo occidentale femminile da due località dell'Iowa. Il volo più lungo si riferisce al più lungo volo ininterrotto (cioè continuo) eseguito da ogni individuo durante il periodo di prova.
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Discussion
Caratterizzare il comportamento di volo del rootworm di mais occidentale è importante per elaborare piani efficaci di gestione della resistenza. Il comportamento di volo di questo parassita è stato studiato in laboratorio utilizzando vari metodi tra cui actografi, gallerie di volo e mulini di volo. I mulini a volo, come descritto e illustrato in questo documento, consentono agli insetti di effettuare voli ininterrotti in modo che i ricercatori possano quantificare i parametri di volo come distanza, durata, periodicità e velocità dei singoli voli, per un intero periodo di prova.
Il passo più impegnativo nel protocollo per la sperimentazione del mulino di volo con il verme di mais occidentale, come per la maggior parte delle specie di insetti, è applicare correttamente un tether all'adulto (Fase 3). Questo può essere un compito difficile a causa della piccola quantità di superficie disponibile sul pronoto per l'attaccamento del filo, così come la grande quantità di cere naturali sulla superficie cuticola. Il compito è reso più difficile dal tempo limitato a disposizione per applicare il tether prima che l'insetto inizi a muoversi mentre emerge dall'anestesizzazione CO2. È importante che il tether sia allineato correttamente e aderisca al pronotum dello scarabeo per tutto il periodo di prova. Se il tether è disallineato, lo scarabeo può avere difficoltà a impegnarsi in volo mentre si trova sul mulino di volo, con conseguente distanza, durata e velocità, in vari modalità artisticamente inferiori. Lo scarabeo può sfuggire durante il periodo di prova se la cera dentale non aderisce al filo abbastanza fortemente al pronotum. Pertanto, è importante avere mani pulite e stabili, un buon senso per riscaldare la cera a una temperatura praticabile e la fiducia mentre si celano i coleotteri, tutti raggiungibili con una pratica adeguata.
È necessario prendere una decisione su ciò che costituisce un evento di volo indipendente in modo che sia possibile impostare il valore Soglia massima (Passaggio 2.2.3). Un individuo non può effettuare voli, un volo o decine di voli durante un periodo di prova, a seconda della sua attività di stop-and-go, ma anche sul valore di Soglia massima assegnato. Il valore predefinito riportato da Jones et al.18 è 5 s. In questo studio del tiofilo occidentale, la soglia massima è stata impostata a 1 min. L'impostazione più appropriata è una chiamata di giudizio basata sulle specie di insetti e sugli obiettivi del ricercatore. Ci sono compromessi. Un insetto che smette di volare ma continua a circolare per una o più rivoluzioni a causa dello slancio avrà quelle rivoluzioni erroneamente conteggiate come parte del volo precedente quando il valore è impostato su 1 min. Se il valore è impostato su 5 s, la maggior parte delle rivoluzioni extra non di volo non verrà conteggiata e la registrazione di tale volo verrà terminata correttamente. D'altra parte, a volte un insetto rallenta notevolmente il suo volo nel tentativo di controllarne la direzione, di atterrare o per altri motivi, poi riprende a volare a velocità più elevata senza aver mai interrotto il volo attivo. Tale comportamento sui mulini di volo è comune ed è stato osservato nel verme dello radice di mais occidentale; viene spesso registrato come due voli separati quando la soglia massima è impostata su 5 s, ma verrebbe correttamente registrata come volo ininterrotto quando la soglia è di 1 min. Sotto la soglia di 1 min, tuttavia, il volo di un insetto che smette veramente di volare e riprende il volo entro 1 min verrebbe erroneamente registrato come non essersi fermato.
Una soglia minima di volo (ad esempio, almeno un volo di almeno un minuto) può essere utilizzata per escludere da ulteriori analisi tutti gli adulti che potrebbero essere stati danneggiati durante la manipolazione o che sono stati altrimenti in cattive condizioni di salute. Il compromesso di proteggere contro tali falsi zeri (o falsi voli molto brevi) è la possibilità di escludere veri zeri (o veri voli molto brevi), cioè individui sani ma non motivati a volare. Il ricercatore deve decidere come gestire gli zeri (o voli molto brevi) in base agli obiettivi dell'esperimento, nonché quale tipo di errore è più probabile e che è meno desiderabile quando si tratta di interpretare i risultati. Inoltre, un problema comune si verifica quando la posizione del braccio di volo che sostiene uno scarabeo inattivo sembra essere direttamente sopra, o molto vicino, il sensore, dove piccoli movimenti del braccio causati da movimenti non di volo dell'insetto o lievi correnti d'aria nel camera può essere falsamente registrata come rivoluzioni. Per evitare che questo artefatto metodologico gonfichi la frequenza di durate di volo più brevi, si raccomanda di escludere tutti i voli della durata di 1 min dalle analisi. Questo tipo di lettura artifactuali, se continua per un tempo più lungo, può anche provocare una velocità non sensicalmente elevata (ad esempio, > 2 m/s) per un "volo" registrato; una volta rilevati, tali dati di "volo" devono essere cancellati per tale individuo.
Anche se gli studi sul mulino di volo hanno fornito importanti informazioni sul comportamento di volo del bacchenello di mais occidentale, come con qualsiasi specie ci sono complicazioni nel correlare il volo legato al volo naturale nel campo24. Un insetto su un mulino di volo è sospeso, che fornisce supporto verticale per il suo peso. Pertanto, l'energia spesa per fornire ascensore durante il volo naturale non può essere investita da insetti tethered sui mulini di volo25. D'altra parte, un insetto legato deve fornire più spinta che in volo libero per superare l'attrito al perno, il peso aggiunto del braccio di volo e la resistenza aerodinamica dal braccio di volo25,26. Il volo naturale dello radice del mais occidentale a volte si verifica anche ad altitudini superiori al suo strato limite di volo27, dove la distanza percorsa durante il volo può essere fortemente influenzata da velocità del vento che sono molto maggiori della velocità di volo senza aiuto dell'insetto 28. I mulini a volo impongono un volo unidirezionale, in modo che la distanza percorsa possa sovrastimare lo spostamento totale nel campo in cui la pista di volo potrebbe essere tortuosa. Fornire il contatto tarsale con un piccolo pezzo di tessuto dopo il montaggio dell'insetto sul mulino di volo (passaggio 3.9) riduce il volo di fuga iniziale e l'attività di volo associata a un tentativo di atterrare. Tuttavia, una volta che lo scarabeo lascia cadere il tessuto durante un esperimento, si verifica lo stesso problema di incapacità di terminare il volo all'atterraggio. Sistemi di actografo alternativi sono stati utilizzati in esperimenti di volo di laboratorio con tithered8,9 o untethered7 radice di mais occidentale. Mentre alleviano il problema della terminazione del volo consentendo il contatto tarsale spontaneo, il compromesso è l'incapacità di misurare la distanza o la velocità del volo. Nonostante queste limitazioni, il mulino di volo è molto utile come strumento comparativo per esaminare come una varietà di fattori di sviluppo, biotici e abiotici influenzi la propensione di un insetto a impegnarsi in volo e come il comportamento di volo stesso sia influenzato. Se combinate con altre prove, come quella fornita da esperimenti di mark-capture29, trap data30, e le stime del flusso genico31, le intuizioni uniche ottenute dagli esperimenti del flight mill contribuiscono a un comprensione della dispersione del radice del mais occidentale nel campo e delle sue conseguenze a livello di popolazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
L'assistente di E.Y.Y. è stata sostenuta dalla National Science Foundation I/UCRC, il Center for Arthropod Management Technologies, sotto Grant No. IIP-1338775 e partner del settore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butane multi-purpose lighter | BIC | UXMPFD2DC | To soften wax when tethering |
| Clear polystyrene plastic vial (45-ml) | Freund Container and Supply | AS112 | To hold beetle while anesthetizing |
| Dehydrated culture media, agar powder | Fisher Scientific | S14153 | To make agar for holding moisture for adults |
| Delrin rod (1" diameter, 3.75" long) | Many suppliers: can use cheapest on the internet. | For post of flight mill | |
| Dental wax | DenTek | 47701000335 | Adheres wire tether to prothorax |
| Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull) | Magnet Shop | 63B06929118 | Opposing - to generate the float. |
| Hall effect sensor | Optikinc | OHN3120U | Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers. |
| Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall) | Small Parts, Inc. | HTX-22T-12 | Used for flight mill arms and main axis rod. |
| Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm) | Percival Scientific | I-41VL | |
| LabVIEW Full Development System software, system-design platform | National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html) | LabVIEW 2018 (Full Edition) | Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill. LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems. |
| Mesh cage (18 x 18 x 18 cm) | MegaView Science Co. Ltd. | BugDorm-4M1515 | mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture |
| Needle tool | BLICK | 34920-1063 | For scoring soil surface for egg laying in laboratory |
| Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick) | K&J Magnetics | R311 | Used to trigger the digital hall effect sensor. |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | S33580A | |
| Plastic container (44-ml) | Dart | 150PC | For initial rearing of young larvae |
| Plastic container (473-ml) | Placon | 22885 | For rearing of older larvae |
| Round brush (size 2) | Simply Simmons | 10472906 | For transferring freshly hatched neonates to surface of roots |
| Sieve (250-µm) | Fisher Scientific | 08-418-05 | To separate eggs from soil |
| Steel wire (28-gauge) | The Hillman Group | 38902350282 | |
| Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length) | United States Plastic Corporation | 47503 | To accept the rotating arm. |
| Vacuum | Gast Manufacturing, Inc. | 1531-107B-G288X | For aspirating adults in laboratory |
| White poly chiffon fabric | Hobby Lobby | 194811 | To prevent escape of larvae from rearing container |
References
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