Summary
As fábricas de voo são ferramentas importantes para comparar como idade, sexo, status de acasalamento, temperatura ou vários outros fatores podem influenciar o comportamentodevoo de um inseto. Aqui descrevemos protocolos para amarrar e medir a propensão de vôo e desempenho do entoinho de milho ocidental diferentes tratamentos.
Abstract
O bicho-da-raiz ocidental do milho, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), é uma praga economicamente importante do milho nos Estados Unidos do norte. Algumas populações desenvolveram resistência a estratégias de manejo, incluindo milho transgênico que produz toxinas inseticidas derivadas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt). O conhecimento da dispersão ocidental do rootworm do milho é da importância crítica para modelos da evolução, da propagação, e da mitigação da resistência. O comportamento de voo de um inseto, especialmente a longa distância, é inerentemente difícil de observar e caracterizar. As fábricas de voo fornecem um meio de testar diretamente os impactos e consequências do desenvolvimento e do voo em laboratório que não podem ser obtidos em estudos de campo. Neste estudo, as usinas de voo foram usadas para medir o tempo de atividade de voo, o número total de voos e a distância, duração e velocidade dos voos realizados por vermes femininos durante um período de teste de 22 h. Dezesseis fábricas de voo foram alojadas em uma câmara ambiental com iluminação programável, temperatura e controle de umidade. A fábrica de vôo descrita é de um projeto típico, onde um braço de vôo é livre para girar sobre um pivô central. A rotação é causada pelo vôo de um inseto amarrado a uma extremidade do braço de vôo, e cada rotação é gravada por um sensor com um carimbo de tempo. Os dados brutos são compilados por software, que são posteriormente processados para fornecer estatísticas sumárias para parâmetros de interesse de voo. A tarefa mais difícil para qualquer estudo da fábrica de vôo é a apego da corda ao inseto com um adesivo, e o método usado deve ser adaptado a cada espécie. O apego deve ser forte o suficiente para manter o inseto em uma orientação rígida e para evitar o desprendimento durante o movimento, sem interferir com o movimento natural da asa durante o vôo. O processo de apego requer destreza, finesse e velocidade, fazendo imagens de vídeo do processo de enverinhos de valor.
Introduction
O bicho-da-raiz ocidental do milho, Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae), foi identificado como uma praga do milho cultivado em 19091. Hoje, é a praga mais importante do milho(Zea mays L.) no Cinturão de Milho dos EUA, com larvas alimentando-se de raízes de milho causando a maior parte da perda de rendimento associada a esta praga. Os custos anuais para a gestão e as perdas de produção de milho devido ao enlatamento de milho são estimados em mais de US $ 1 bilhão2. O rootworm ocidental do milho é altamente adaptável, e as populações evoluíram a resistência às estratégias múltiplas da gerência que incluem insecticidas, rotação da colheita, e milho transgênico de Bt3. Determinar dimensões espaciais sobre quais táticas devem ser aplicadas para mitigar o desenvolvimento local de resistência, ou um hotspot de resistência, depende de uma melhor compreensão da dispersão4. As medidas de mitigação não serão bem-sucedidas se estiverem restritas a uma escala espacial muito pequena em torno de um hotspot de resistência, porque adultos resistentes se dispersarão além da área de mitigação5. Compreender o comportamento do vôo do rootworm ocidental do milho é importante criar plantas eficazes da gerência da resistência para esta praga.
Dispersão por vôo desempenha um papel importante na história da vida adulto ocidental corn rootworm e ecologia6, eo comportamento de vôo desta praga pode ser estudada em laboratório. Vários métodos podem ser usados para medir o comportamento de voo em laboratório. Um actógrafo, que restringe o vôo em um plano vertical, pode medir a quantidade de tempo que um inseto está envolvido em voo. Actógrafos têm sido usados para comparar a duração de vôo e padrões de periodicidade de machos e fêmeas ocidentais do rootworm do milho em idades diferentes, tamanhos de corpo, temperaturas, susceptibilidade do insecticida, e exposiçãodoinsecticida7,8, 9. Túneis de voo, que consistem em uma câmara de rastreamento e fluxo de ar direcionado, são especialmente úteis para examinar o comportamento de vôo de insetos ao seguir uma pluma de odor, como componentes de feromônio candidato10 ou voláteis de plantas11. As fábricas de voo são talvez o método mais comum para estudos laboratoriais sobre o comportamento de voo de insetos e podem caracterizar vários aspectos da propensão e desempenho de voo. Fábricas de vôo de laboratório têm sido empregadas em estudos de enveral de milho ocidental para caracterizar a propensão para fazer voos curtos e sustentados, bem como o controle hormonal do vôo sustentado12,13.
As usinas de voo fornecem uma maneira relativamente simples de estudar o comportamento de voo de insetos em condições de laboratório, permitindo que os pesquisadores meçam vários parâmetros de voo, incluindo periodicidade, velocidade, distância e duração. Muitas das fábricas de vôo usadas hoje são derivadas das rotundas de Kennedy et al.14 e Krogh e Weis-Fogh15. As fábricas de voo podem ser diferentes em forma e tamanho, mas o princípio básico permanece o mesmo. Um inseto é amarrado e montado em um braço horizontal radial que esteja livre para girar, com atrito mínimo, sobre um eixo vertical. À medida que o inseto voa para a frente, seu caminho é restrito a circular em um plano horizontal, com a distância percorrida por rotação ditada pelo comprimento do braço. Um sensor é normalmente usado para detectar cada rotação do braço causada pela atividade de vôo do inseto. Os dados brutos incluem rotações por tempo unitário e ocorreu o voo diurno. Os dados são alimentados em um computador para gravação. Os dados de várias fábricas de voo são frequentemente registrados em paralelo, essencialmente simultaneamente, com bancos de 16 e 32 usinas de voo sendo comuns. Os dados brutos são processados por software personalizado para fornecer valores para variáveis como velocidade de voo, número total de voos separados, distância e duração voados e assim por diante.
Cada espécie de inseto é diferente quando se trata do melhor método para amarrar por causa de variáveis morfológicas, como tamanho geral, tamanho e forma da área alvo para anexar a corda, suavidade e flexibilidade do inseto, necessidade e método para anestesia, potencial para sujar as asas e/ou cabeça com adesivo extraviado ou transbordar, e muitos, muitos mais detalhes. Nos casos de amarração visualizada de um bug plataspid16 e um besouro ambrosia17, as respectivas áreas-alvo para fixação de amarração são relativamente grandes e indulgentes de colocação adesiva imprecisa porque a cabeça e as asas são um pouco bem separados do site de anexos. Isso não é para minimizar a dificuldade de amarrar esses insetos, o que é exigente para qualquer espécie. Mas o tome-raiz de milho ocidental é um inseto particularmente desafiador para amarrar: o pronótono é estreito e curto, fazendo apego muito preciso com uma quantidade mínima de adesivo (cera dentária, neste caso) necessária para evitar interferências com a abertura do elytra para o vôo e com a cabeça, onde o contato com os olhos ou antenas pode afetar o comportamento. Ao mesmo tempo, o cabo deve firmemente ser unido para evitar a desalojação por este insecto forte. A demonstração de amarração de adultos do rootworm é a oferta a mais importante neste papel. Deve ser de ajuda para outras pessoas que trabalham com este ou insetos semelhantes, onde o método visualizado aqui poderia ser uma opção útil.
Este artigo descreve métodos usados para efetivamente amarrar e caracterizar a atividade de vôo de adultos ocidentais de enzimlhos de milho que foram criados em diferentes densidades larvais. As fábricas de voo e software utilizado neste estudo (Figura 1) foram derivados de projetos postados na internet por Jones et al.18 Técnicas de amarração foram modificados a partir da descrição em Stebbing et al.9 Uma matriz de 16 usinas de vôo foi alojados em uma câmara ambiental, projetado para controlar a iluminação, umidade e temperatura (Figura 2). Usando esta ou configuração semelhante, juntamente com as seguintes técnicas permite testar fatores que podem influenciar a propensão de vôo e desempenho do enziminho ocidental do milho, incluindo idade, sexo, temperatura, fotoperíodo, e muitos outros.
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Protocol
1. A lombriga ocidental traseira do milho para testes de vôo
NOTA: Se a idade do adulto deve ser controlada ou conhecida, os adultos devem primeiro ser coletados no campo seguido de criar seus descendentes até a idade adulta para testes. Se a idade do besouro ou um ambiente de criação padronizado não é motivo de preocupação, então testar diretamente adultos coletados em campo pode ser possível, e o protocolo pode começar com a etapa 2.
- Colete pelo menos 500 adultos ocidentais do rootworm do milho de um cornfield do interesse assegurar-se de bastante ovos são obtidos para criar números adequados de adultos. Use um aspirador manual para coletar adultos do campo.
NOTA: Recomenda-se coletar adultos durante a abundância máxima, por volta do final de julho no Cinturão de Milho dos EUA, para garantir a coleta de ambos os sexos. A maioria dos adultos serão do sexo masculino se coletados mais cedo, enquanto a maioria será do sexo feminino se coletados mais tarde. - Coloque os adultos machos e fêmeas coletados em uma gaiola de malha contendo orelha de milho picada, tecido de folha de milho, 1,5% sólido de ágar e um substrato de ovidão. Uma gaiola de 18 x 18 x 18 cm (tamanho de malha 44 x 32, 650 μm abertura) pode acomodar até 500 adultos ao mesmo tempo.
- Use o milho cultivado no campo como uma fonte de orelha de milho, que será colhida no R3, ou estágio de leite do desenvolvimento do kernel19. O kernel R3 é amarelo do lado de fora, enquanto o fluido interno é branco leitoso devido à acumulação de amido. As orelhas de milho podem ser congeladas e armazenadas por até um ano até que sejam necessários. Para alimentar o verme, retire a casca e pique o milho em seções transversais horizontais com cerca de 3 cm de espessura. Milho picado é a dieta primária para os adultos e deve ser alterado duas vezes por semana.
- Obter folhas de plantas de milho cultivadas em estufa de qualquer idade. A quantidade de tecido da folha variará com o número de adultos na gaiola. Evite usar plantas de campo, pois podem introduzir doenças.
- Para fazer o ágar sólido, misture 15 g de pó de ágar com 1 L de água DI. Aqueça a mistura até ferver. Despeje o líquido em placas de Petri (100 mm x 15 mm), enquanto ele está quente. Coloque uma tampa na placa de Petri uma vez esfriar e colocá-los em armazenamento frio (6 ° C). Agar fornece adultos com uma fonte de umidade e deve ser mudado duas vezes por semana.
- Para preparar um substrato de ovidão, coloque 40 g de solo de campo peneirado (<180 μm) em uma placa de Petri. Umedeça o solo com água desionizada. Certifique-se de que o solo na parte inferior da placa de Petri parece molhado. Marcar a parte superior do solo umedecido com uma ferramenta de agulha. Retire o substrato de oviposição semanalmente e coloque em uma incubadora a 25° C e 60% RH por pelo menos um mês.
- Após a incubação de ovos por um mês, lave o conteúdo do substrato de ovidão através de uma peneira de 250 μm até que todo o solo tenha sido removido. Quantifique os ovos colocando ovos lavados em um cilindro graduado de 10 mL. Há aproximadamente 10.000 ovos por 1 mL.
- Coloque os ovos quantificados em um recipiente de 44 mL e cubra com solo de campo peneirado (<180 μm). Os ovos ocidentais do rootworm do milho submetem-se à diapausa obrigatória com o inverno20. Para quebrar a diapausa, coloque os ovos em armazenamento a frio (6° C) por pelo menos 6 meses.
NOTA: Os ovos podem ser mantidos no armazenamento frio por mais de 5 meses, mas a viabilidade do ovo diminui com tempo. Depois de 12 meses, pode haver pouca ou nenhuma escotilha. - Após um mínimo de 5 meses, retire os ovos do armazenamento a frio e coloque em uma incubadora a 25° C e 60% RH. Neonatos eclodem tão cedo quanto 16 dias após a remoção do armazenamento frio.
- Uma vez que os ovos eclodem, coloque três grãos germinados no fundo de um recipiente de plástico de 44 mL com raízes expostas (ou seja, não cobertas de solo). Use uma escova macia da cerda para transferir 12 neonates à superfície das raizes.
- Adicione 4,5 mL de água DI a 40 mL de solo peneirado (<600 μm). Coloque o solo umedecido sobre os grãos germinados que foram infestados com neonatos e cubra o recipiente com tecido de malha para evitar que as larvas escapem.
- No mesmo dia em que o recipiente de plástico de 44 mL é montado com neonatos, prepare um recipiente de 473 mL com grãos de milho que não germinaram. As larvas do rootworm serão transferidas a este recipiente maior mais tarde. O número de sementes determina a densidade larval desejada por planta. Adicione 120 g de mistura de solo composto por 50% de solo de campo peneirado (<600 μm) e 50% de solo de envasamento umedecido com 20 ml de água desionizada.
- Após 7 dias, transfira todo o conteúdo do recipiente de 44 mL para o contêiner de 473 mL. As larvas serão as segundas estrelas no momento da transferência.
NOTA: Esta transferência para um recipiente maior é necessária para fornecer larvas com massa de raiz suficiente para se alimentar através da pupação. - Observe o surgimento de adultos tipicamente em torno de 26 dias após a escotilha do ovo. Os adultos são pilotos ativos após o surgimento e podem escapar do recipiente de 473 mL ao tentar coletá-los à mão. Em vez disso, use um vácuo com um aspirador para coletar adultos.
- Segregar adultos por sexo e/ou data, se necessário para testes comparativos. O sexo do rootworm ocidental do milho pode ser determinado observando a morfologia do basitarsi protorácico21. Os machos têm basitarsi protorácico largo e quadrado, enquanto os das fêmeas são estreitos e em forma cônica.
- Coloque o besouro em um frasco de plástico de poliestireno transparente de 45 mL e cubra com uma tampa com 6 pequenos buracos (~1 mm de diâmetro).
- Anestesie o besouro. Coloque a extremidade de um tubo ligado a um regulador de tanque CO2 sobre os buracos na tampa e permitir que um fluxo suave de CO2 para entrar no tubo por aproximadamente 10 a 15 s até que o adulto perde o controle sobre a parede do frasco.
NOTA: O inseto anestesiado permanecerá imobilizado por cerca de 1 min. - Coloque o besouro anestesiado, lado ventral para cima, em um fundo de placa de petri de plástico invertido. Coloque cuidadosamente a tampa não invertida da placa de Petri sobre o besouro. Certifique-se de que o tarsi do besouro pressione contra a tampa, permitindo a fácil observação do basitarsi protorácico um microscópio dissecando.
- Se o experimento exige que os besouros sejam acasalados antes do voo, use machos com pelo menos 5 dias de idade para acasalar com as fêmeas recém-emergidas.
NOTA: O uso de machos mais velhos garante que eles são sexualmente maduros após a sua introdução às fêmeas virgens. As fêmeas são sexualmente maduras após o surgimento de adultos, enquanto os machos exigem de 5 a 7 dias de desenvolvimento pós-emergência para atingir a maturidade sexual22,23.
2. Iniciar o programa de software da fábrica de voo antes dos testes de voo
NOTA: Os arquivos do programa da fábrica de voo (.vi extensões de arquivo que são executados em uma plataforma de software comercial, ver Tabela de Materiais) e detalhes para seu uso são fornecidos para download através de links ("rotina de análise de dados" e "Instruções Circular Flight Mill", respectivamente) na seção "Fiação e software da fábrica de voo" no site Jones et al.18. Se os programas não funcionarem mais em versões mais recentes ou futuras da plataforma de software, ou se o usuário quiser adicionar novos recursos, as rotinas fornecidas por Jones et al. 18 podem ser modificadas pelo usuário conforme necessário.
- Abra o programa de software da fábrica de voo(Figura 3).
- Insira as informações a guia de inicialização.
- Defina o horário de início e o horário de término para a duração desejada do teste de voo.
NOTA: Todos os adultos devem ser amarrados e montados em moinhos de vôo por 30 minutos antes do horário de início. Pode levar uma pessoa experiente 30 min a 45 min para amarrar e preparar 16 besouros para testes de vôo (ver Seção 3). - Definir o limite min (min) para 0. Isso garante que qualquer detecção da passagem do braço de vôo será registrada, e é o padrão recomendado por Jones et al. 18.
- Definir o limite máximo (min) para 1. Aqui, 1 min foi usado. Este valor significa que 1 min deve decorrer entre a detecção do sensor do braço de vôo para "chamar" o fim de um vôo.
- Digite um nome para o arquivo.
- Defina o intervalo de registro de dados brutos (min) para 1. Esse valor controla o intervalo sobre o qual os dados brutos serão compilados para relatórios de saída. Aqui, está definido como 1 min. Assim, a saída das revoluções, por exemplo, será registrada por minuto.
NOTA: O intervalo de tempo real entre a digitalização eletrônica da atividade do sensor é muito curto, mas um intervalo de 1 minuto permite a exploração madeireira em uma escala fina o suficiente para a maioria dos fins de pesquisa, enquanto restringe o número de linhas na saída da planilha a um número razoável para examinar de olho.
- Defina o horário de início e o horário de término para a duração desejada do teste de voo.
- De acordo com a aba De informações sobre o assunto, preencha as colunas rotuladas de identificação, dieta, sexo, espécies e comentários como desejado.
- Clique no botão START localizado no lado esquerdo da tela. O programa começará a coletar dados brutos assim que o Horário Atual corresponda ao horário de início.
3. Tether rootworm milho ocidental para fábrica de vôo
- Dobre um fio de aço de calibre 28 de 40 mm de 90° no centro.
NOTA: O fio também pode ser de outro metal, como cobre ou latão. - Pegue uma pequena quantidade de cera dental, ligeiramente maior do que uma cabeça de alfinete, e rolá-lo entre as pontas dos dedos até que uma bola é formada. Certifique-se de que os dedos estão limpos para evitar detritos, sujeira e óleo de incorporação na cera, porque pode impedir que a cera de adere ao inseto.
- Empurre uma extremidade dos 40 mm o fio dobrado para o centro da bola de cera.
- Anestesie o adulto de teste com CO2, conforme descrito acima (ver 1.11.1 e 1.11.2).
- Coloque o adulto anestesiado em uma superfície plana e posicione seu lado dorsal para cima. Se o besouro não se encontra completamente liso na superfície, reposicione os pés de modo que faça. É importante que o besouro se deite tão liso como possível na superfície para assegurar o posicionamento correto do fio.
- Brevemente (< 1 s) aquecer a cera dentária no fio com um isqueiro butano. Se a cera é aquecida por muito tempo, a cera derretida vai cair fora do fio. Não reutilize a cera se ela tiver caído do fio, pois não aderirá efetivamente à cutícula do inseto.
- Coloque cuidadosamente a extremidade do fio de aço com a cera dentária derretida na superfície dorsal do pronotum, enquanto aponta a outra extremidade do fio, (ou seja, a extremidade sem cera dentária), ao longo da linha média do abdômen. Alternativamente, aponte a extremidade do fio sem a cera dental para a cabeça se desejado. Nesse caso, um besouro voador vai empurrar o braço de vôo em vez de puxá-lo. Certifique-se de que a cera derretida não entrar no elytra ou suas suturas, pois pode impedir ou dificultar o vôo.
- Coloque a extremidade livre do fio na abertura do tubo de metal oco do braço da fábrica de vôo. Certifique-se de que o fio se encaixa apertado o suficiente para manter no lugar por atrito. O besouro amarrado pode ser posicionado para voar no sentido horário ou no sentido anti-horário.
- Imediatamente após a montagem de um besouro, rasgar um pequeno pedaço (~ 1 cm de papel de seda de um tecido maior. Ofereça a parte do tecido ao besouro amarrado que pendura do moinho de vôo para o contato tarsal; a maioria dos besouros vai agarrar o tecido e mantê-lo contra a gravidade até liberá-lo no início de sua primeira atividade de vôo. Isso reduzirá consideravelmente o comportamento inicial de fuga ou pouso.
NOTA: A presença humana na sala de testes de voo deve ser limitada à anexação e remoção de adultos das usinas de voo. O período de teste geralmente não começa até que pelo menos 30 min tenham decorrido desde o anexo (ver Nota abaixo de 2.2.1), e os seres humanos não devem estar presentes na sala de vôo durante este tempo ou durante o período de teste em si. - Remova todos os adultos testados após a conclusão de um teste de fábrica de voo. Retire a conta de cera que liga a corda ao pronotum descascando delicadamente o fio longe do pronotum. A cera se separará facilmente sem danificar a cutícula, tornando o inseto disponível para mais experimentação, se desejar.
4. Salve os dados coletados do programa da fábrica de voo.
- O programa pode ser definido para manual ou auto. Se o programa estiver definido como manual, o usuário deve terminar o programa clicando no botão STOP. Se o programa for definido como AUTO,o programa deixará de coletar dados brutos assim que o Tempo Atual correspondesse ao Tempo Final.
- Clique na SAÍDA após o término do período de testes de voo.
- Certifique-se de que um arquivo TDMS seja salvo o nome do arquivo inserido durante a inicialização do programa (passo 2.2).
- Clique no arquivo TDMS e salve o documento como planilha (.xlsx).
5. Recuperar parâmetros de voo da planilha salva (.xlsx)
NOTA: Uma planilha pode ser projetada personalizada para manipular a saída de dados brutos do software da fábrica de voo. Aqui, o programa de software foi o mesmo descrito por Jones et al. 18, mas uma rotina adicional foi adicionada para reconhecer e resumir o voo ininterrupto mais longo por um inseto individual durante o período de teste.
- Para cada indivíduo que se envolveu em atividade de voo, a planilha incluirá as seguintes informações: número de voo, revoluções totais, horário de início, horário de término e duração do voo em minutos.
- Para calcular a distância total voada durante o período de teste, soma a coluna rotulada de "Rotações Totais" e multiplique-a pela distância voada por revolução. A distância por revolução depende do comprimento do braço de vôo do pivô central para o inseto em anexo. Por exemplo, se essa distância for de 15,9 cm, cada revolução é equivalente a um metro voado. O número total de revoluções também pode ser encontrado na aba 'Test Stats'.
- Para calcular a duração total voada durante o período de teste, soma a coluna rotulada como "Duração de Voo (min)".
- Para determinar a distância e a duração do voo ininterrupto mais longo, acesse a aba 'Estatísticas de Teste' e olhe para a coluna com o rótulo "Voo Mais Longo #'.
- A velocidade do voo pode ser calculada dividindo a distância voada por duração do voo. Para insetos, a velocidade é comumente expressa em m/s ou km/h.
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Representative Results
A figura 4 mostra exemplos representativos de saídas esperadas após os testes de voo. Os dados de voo foram obtidos a partir de trabalhos experimentais realizados no Departamento de Entomologia da Iowa State University. Adultos de seis dias de idade, acasalados com encravadas pelo milho ocidental, foram amarrados a fábricas de voo e colocados em uma câmara ambiental controlada situada às 14:10 L:D, 60% RH e 25°C. Os besouros foram deixados nas usinas de voo por 22 horas consecutivas a partir de 30 min antes do início do amanhecer simulado, e sua atividade de vôo foi registrada(Figura 4). O amanhecer e o crepúsculo foram simulados por uma mudança programada e gradual na intensidade da luz de full-off para full-on ao amanhecer (ou vice-versa ao entardecer) durante um período de 30 minutos. A primeira guia na planilha resultante resume os adultos individuais que foram testados, utilizando informações inseridas a partir do passo 2.3. As guias subsequentes incluem dados de voo para cada indivíduo. As duas últimas guias são rotuladas como "RAW DATA" e "Estatísticas de Teste". 'DADOS BRUTOs' inclui o tempo de atividade de voo para todos os indivíduos. 'Estatísticas de teste' indica o voo ininterrupto mais longo para cada besouro, e resumos da duração do voo ininterrupto mais longo em minutos, o tempo total gasto em voo durante o período de teste em minutos e o número total de revoluções durante o período de teste. Os carimbos de tempo para o início e o fim de cada voo independente permitem análises da periodicidade de voo.
Para o besouro fêmea amarrado à fábrica de vôo #2(Figura 4B),a planilha exibe o número de voos, revoluções totais por voo, início e tempo final de cada voo e a duração de cada voo. Esta fêmea acoplou em diversos vôos independentes, a maioria de que eram muito curtos. No entanto, em voo #5 a fêmea viajou 1.258 m (o que equivale ao número de revoluções neste caso, porque a distância por revolução foi de 1 m) durante um período de 37,8 min de vôo ininterrupto. O besouro fêmea amarrado à fábrica de vôo #1(Figura 4C)não se envolveu em voo durante o período de teste, então uma planilha em branco é exibida.
Como exemplo, os resultados são apresentados a partir de uma simples comparação de características de voo entre dois grupos de larva de milho ocidental fêmea. Os adultos foram coletados em campos de milho comerciais de dois locais em Iowa e autorizados a oviposit no laboratório. Os ovos foram coletados, e a prole criada como descrito na etapa 1 do protocolo em uma densidade pós-neonato (etapa 1.9) de 12 larvas por 36 mudas. As fêmeas adultas resultantes foram amarradas e testadas como descrito nos passos 2 e 3. A tabela 1 mostra um resumo dos parâmetros de voo dos dados brutos recuperados do software da fábrica de voo, conforme descrito nos Passos 4 e 5. Os parâmetros totais de voo referem-se à soma de todos os voos de um indivíduo durante o período de teste de 22 h, enquanto os parâmetros de voo mais longos referem-se ao voo ininterrupto mais longo durante o teste.
Figura 1. Fábricas de vôo de insetos usadas para experimentos amarrados. (A) Fábrica inteira de voo de insetos e (B) parte de trabalho da fábrica de voo. (A) A porção de trabalho da fábrica de voo é circulada, (B) (1) 1 m braço de vôo tubo hipodérmico, (2, 3) repelindo ímãs anel ferrite, (4) sensor de efeito Hall digital, (5) pequeno ímã anel de níquel usado para acionar o sensor, e (6) tubo de parede fina hipodérmica ("pino central") que separa os ímãs repelentes (2,3). As siderúrgicas modificaram ligeiramente a partir do design original de Jones et al.18 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Componentes da câmara ambiental da fábrica de vôo. (A) As características exteriores da câmara incluem (1) controlador intellus, (2) painel de controle, e (3) desconexão principal do poder. (B) As características da câmara interior incluem (1) refrigeradores da unidade (atrás do painel do teto), (2) módulos de LED, (3) unidades de arquivamento, e (4) umidificador pan-tipo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3. Uma interface do programa de software da fábrica de voo. (A) A primeira guia, rotulada como "Inicialização", requer informações, incluindo horários de início e fim, e o nome do arquivo. (B) A segunda guia, rotulada como "Informações do Assunto", não requer nenhuma informação a ser inserida, mas é usada para diferenciar entre vários indivíduos avaliados em um único teste de voo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4. Dados representativos do vôo dos besouros ocidentais fêmeas 6-day-old do rootworm do milho. (A) A primeira guia da saída resume as informações sobre sete indivíduos de voo testados em um determinado dia. (B) Dados de voo para a fêmea na fábrica de voo #2 (FM#2), que se envolveu em vários voos independentes durante o período de teste de 22 horas. (C) A fêmea colocada na fábrica de voo #1 (FM#1) não se envolveu em voo durante o período de teste de 22 horas, resultando em uma planilha em branco. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Localização | |||
| Ames | Nashua | ||
| Tamanhoda amostra 1 | 23 | 31 | |
| Distância total de voo (m) | 387,83 ± 146,21 | 949,10 ± 267,73 | |
| Duração total do voo (min) | 14,34 ± 5,06 | 37,01 ± 10,51 | |
| Velocidade total de voo (m/s) | 0,42 ± 0,04 | 0,44 ± 0,06 | |
| Maior distância de voo (m) | 184,48 ± 81,82 | 590,13 ± 186,01 | |
| Maior duração de voo (min) | 6,27 ± 2,26 | 22,15 ± 7,67 | |
| Maior velocidade de voo (m/s) | 0,46 ± 0,04 | 0,44 ± 0,03 | |
| 1 Voou pelo menos 1 minuto | |||
Tabela 1. Desempenho médio (± SE) em moinhos de vôo do rootworm ocidental fêmea do milho de duas posições em Iowa. O voo mais longo refere-se ao voo mais longo e ininterrupto (ou seja, contínuo) realizado por cada indivíduo durante o período de teste.
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Discussion
Caracterizar o comportamento ocidental do vôo do rootworm do milho é importante para conceber plantas eficazes da gerência da resistência. O comportamento de voo desta praga tem sido estudado em laboratório usando vários métodos, incluindo actógrafos, túneis de voo e usinas de voo. As usinas de voo, conforme descrito e ilustrado neste artigo, permitem que os insetos façam voos ininterruptos para que os pesquisadores possam quantificar parâmetros de voo, como distância, duração, periodicidade e velocidade de voos individuais, durante todo um período de teste.
O passo mais desafiador no protocolo para a experimentação do moinho de vôo com o bicho-da-raiz ocidental de milho, como é para a maioria das espécies de insetos, é aplicar corretamente uma corda ao adulto (Passo 3). Esta pode ser uma tarefa difícil devido à pequena quantidade de área de superfície disponível no pronotum para o acessório do fio, assim como a quantidade copiosa de ceras naturais na superfície da cutícula. A tarefa é dificultada pelo tempo limitado disponível para aplicar a corda antes que o inseto comece a agitar enquanto emerge da anestesia do CO2. É importante que o cabo está alinhado corretamente e adere ao pronotum do besouro durante todo o período de teste. Se o cabo é desalinhado, o besouro pode ter uma dificuldade acoplar no vôo quando no moinho de vôo, tendo por resultado a distância, a duração, e a velocidade artifactually mais baixas. O besouro pode escapar durante o período de teste se a cera dental não aderisse o fio fortemente o suficiente para o pronotum. Conseqüentemente, é importante ter mãos limpas, constantes, um bom sentido para aquecer a cera a uma temperatura praticável, e a confiança ao amarrar besouros, que são atingíveis com prática adequada.
Uma decisão deve ser tomada sobre o que constitui um evento de voo independente para que o valor do Limite Máximo possa ser definido (Passo 2.2.3). Um indivíduo pode não fazer voos, um voo ou dezenas de voos durante um período de teste, dependendo de sua atividade stop-and-go, mas também no valor máximo do limite atribuído. O valor padrão relatado por Jones et al.18 é de 5 s. Neste estudo do rootworm ocidental do milho, o ponto inicial máximo foi ajustado em 1 min. O cenário mais adequado é uma chamada de julgamento baseada nas espécies de insetos e nos objetivos do pesquisador. Há compensações. Um inseto que para de voar, mas continua a circular para uma ou mais revoluções por causa do impulso terá essas revoluções incorretamente contados como parte do vôo anterior, quando o valor é definido como 1 min. Se o valor for fixado em 5 s, a maioria das revoluções extra não aéreas não serão contadas e a exploração madeireira desse voo será corretamente encerrada. Por outro lado, às vezes um inseto retarda seu vôo substancialmente em um esforço para controlar sua direção, pousar ou, por outras razões, então recomeça a voar em velocidade mais alta sem nunca ter parado o vôo ativo. Tal comportamento em moinhos de vôo é comum e foi observado no rootworm ocidental do milho; muitas vezes seria registrado como dois voos separados quando o limite máximo é fixado para 5 s, mas seria corretamente registrado como um voo ininterrupto quando o limite é de 1 min. o limiar de 1 min, no entanto, o vôo de um inseto que realmente pára de voar, em seguida, retoma o vôo dentro de 1 min seria incorretamente registrado como não ter parado.
Um limite mínimo de voo (por exemplo, pelo menos um voo de pelo menos um minuto) pode ser usado para excluir de análises adicionais quaisquer adultos que possam ter sido danificados durante o manuseio ou que estavam com problemas de saúde. O trade-off de proteger contra tais falsos-zeros (ou falsos voos muito curtos) é a possibilidade de excluir verdadeiros zeros (ou verdadeiros voos muito curtos), ou seja, indivíduos que eram saudáveis, mas não estavam motivados a voar. O pesquisador deve decidir como lidar com zeros (ou voos muito curtos) com base nos objetivos do experimento, bem como qual tipo de erro é mais provável e que é menos desejável quando se trata de interpretar os resultados. Além disso, ocorre um problema comum quando a posição do braço de vôo que suporta um besouro inativo passa a ser diretamente sobre, ou muito perto, do sensor, onde pequenos movimentos do braço causados por movimentos não-vôo do inseto ou correntes de ar ligeiras no câmara pode ser falsamente registrada como revoluções. Para evitar que este artefato metodológico inflacione a frequência de durações de voo mais curtas, recomenda-se excluir todos os voos com duração de 1 min de análises. Este tipo de leitura artifactual, se continuar por mais tempo, também pode resultar em uma velocidade sem sentido de alta velocidade (por exemplo, > 2 m/s) para um "voo" gravado; quando detectados, esses dados de "voo" devem ser excluídos para esse indivíduo.
Embora os estudos do moinho de vôo forneçam introspecções importantes no comportamento ocidental do vôo do rootworm do milho, como com toda a espécie há umas complicações em relacionar o vôo amarrado ao vôo natural no campo24. Um inseto em uma fábrica de vôo é suspenso, o que fornece suporte vertical para seu peso. Assim, a energia gasta para fornecer o elevador durante o vôo natural não pode ser investida por insetos amarrados em moinhos de vôo25. Por outro lado, um inseto amarrado deve fornecer mais impulso do que no vôo livre para superar o atrito no pivô, o peso adicional do braço de vôo, e arrasto aerodinâmico do braço de vôo25,26. O vôo natural do rootworm ocidental do milho igualmente ocorre às vezes nas alturas acima de sua camada 27 do limite do vôo, onde a distância coberta durante o vôo pode fortemente ser influenciada pelas velocidades do vento que são muito maiores do que a velocidade de vôo unaided do inseto27,onde a distância coberta durante o vôo pode fortemente ser influenciada pelas velocidades do vento que são muito maiores do que a velocidade de vôo unaided do inseto 28. As siderúrgicas impõem um voo unidirecional, para que a distância voada possa superestimar o deslocamento total no campo onde a trajetória de voo pode ser sinuosa. Fornecer contato tarsal com um pequeno pedaço de tecido após a montagem do inseto na fábrica de vôo (passo 3.9) reduz o voo de fuga inicial, bem como a atividade de vôo associada a uma tentativa de pousar. No entanto, uma vez que o besouro deixa cair o tecido durante um experimento, o mesmo problema de incapacidade de encerrar o vôo por pouso é encontrado. Sistemas de actógrafo alternativos têm sido usados em experimentos de vôo de laboratório com amarrado8,9 ou untethered 7 rootworm milho ocidental. Enquanto eles aliviam o problema da rescisão do voo, permitindo o contato tarsal espontâneo, o trade-off é a incapacidade de medir a distância ou velocidade de voo. Apesar dessas limitações, a fábrica de voo é muito útil como uma ferramenta comparativa para examinar como uma variedade de fatores de desenvolvimento, biótico e biótico influenciam a propensão de um inseto para se envolver em voo e como o comportamento de voo em si é afetado. Quando combinado com outras evidências, como a fornecida por experimentos de captura de marca29,dados de armadilha30e estimativas do fluxo gênico31, os insights exclusivos obtidos a partir de experimentos de fábricas de voo contribuem para uma holística compreensão da dispersão ocidental do rootworm do milho no campo e em suas conseqüências do população-nível.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
A assistente de pós-graduação da E.Y.Y., foi apoiada pela National Science Foundation I/UCRC, o Center for Arthropod Management Technologies, o grant no. IIP-1338775 e parceiros da indústria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butane multi-purpose lighter | BIC | UXMPFD2DC | To soften wax when tethering |
| Clear polystyrene plastic vial (45-ml) | Freund Container and Supply | AS112 | To hold beetle while anesthetizing |
| Dehydrated culture media, agar powder | Fisher Scientific | S14153 | To make agar for holding moisture for adults |
| Delrin rod (1" diameter, 3.75" long) | Many suppliers: can use cheapest on the internet. | For post of flight mill | |
| Dental wax | DenTek | 47701000335 | Adheres wire tether to prothorax |
| Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull) | Magnet Shop | 63B06929118 | Opposing - to generate the float. |
| Hall effect sensor | Optikinc | OHN3120U | Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers. |
| Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall) | Small Parts, Inc. | HTX-22T-12 | Used for flight mill arms and main axis rod. |
| Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm) | Percival Scientific | I-41VL | |
| LabVIEW Full Development System software, system-design platform | National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html) | LabVIEW 2018 (Full Edition) | Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill. LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems. |
| Mesh cage (18 x 18 x 18 cm) | MegaView Science Co. Ltd. | BugDorm-4M1515 | mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture |
| Needle tool | BLICK | 34920-1063 | For scoring soil surface for egg laying in laboratory |
| Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick) | K&J Magnetics | R311 | Used to trigger the digital hall effect sensor. |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | S33580A | |
| Plastic container (44-ml) | Dart | 150PC | For initial rearing of young larvae |
| Plastic container (473-ml) | Placon | 22885 | For rearing of older larvae |
| Round brush (size 2) | Simply Simmons | 10472906 | For transferring freshly hatched neonates to surface of roots |
| Sieve (250-µm) | Fisher Scientific | 08-418-05 | To separate eggs from soil |
| Steel wire (28-gauge) | The Hillman Group | 38902350282 | |
| Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length) | United States Plastic Corporation | 47503 | To accept the rotating arm. |
| Vacuum | Gast Manufacturing, Inc. | 1531-107B-G288X | For aspirating adults in laboratory |
| White poly chiffon fabric | Hobby Lobby | 194811 | To prevent escape of larvae from rearing container |
References
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