Die Ratten, die in dieser Studie verwendeten erhalten tägliche Pflege nach der AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: 2013 Ausgabe16. Die institutionelle Animal Care und Use Committee der University of Wisconsin-Madison überprüft und genehmigt dieses experimentelle Protokoll vor Projektbeginn.
(1) Tiere
- Verwenden Sie die outbred Sprague-Dawley männliche Ratten mit einem Gewicht von ca. 350 g.
2. Vorbereitung der Knochen morphogenetische Protein-2 (RhBMP-2) getränkten Schwamm Gerüste
Hinweis: Gerüst Vorbereitung sollte nur vor der Implantation in das Femur auftreten (siehe Schritt 6.14).
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Nutzung eines etablierten RhBMP-2 Knochen-Transplantat-Kit mit einem Kollagen Schwamm, lyophilisierter RhBMP-2 und steriles Wasser zur Rekonstitution17. Aufrechterhaltung der Sterilität, rekonstruieren Sie die RhBMP-2 mit sterilem Wasser zu einer Konzentration von 1,5 mg/mL.
- Mit steriler Schere und einem sterilen Lineal, trimmen Sie RhBMP-2 getränkt Kollagen Schwamm Umformen eine 5 x 3 mm x 3 mm defekt angepasst.
- Mit einer Spritze, die RhBMP-2-Lösung gleichmäßig verteilen Sie über das Kollagen Schwamm damit es absorbiert wird.
3. Vorbereitung des benutzerdefinierten Fixateur externe Gerät
Hinweis: Für die vollständige Auflistung der Abmessungen siehe Abbildung 1A .
- Schneiden Aluminium Blech Lager (Typ 6061, 0,088" Dicke) auf zwei Stücke (1,4" x 6") mit einer Stichsäge oder einem anderen geeigneten Werkzeug.
- Einteiler in die Fräsmaschine zu montieren und mit einer 1/8" 90°-Punkt Hartmetall Bohrer Mühle, cut vier 'V'-Rillen (0,035" tief) in Längsrichtung. Lassen Sie das andere Stück frei von Kürzungen.
- Einzelne Platten von 0.3" Breite der beiden Stücke (Abbildung 1 b). Messen Sie und Bohren Sie der Schraubenlöcher für 4-40 Gewinde. Tippen Sie auf Platte mit 'V'-Grooves mit 4-40 Gewinde. Bohren Sie die Platte ohne Rillen für eine #4 Schraube Körper Bohrer.
- Schleifen Sie beide Stücke um Ecken abrunden und reduzieren das Gewicht (Abbildung 1).
- Schrauben Sie Stücke zusammen mit 4-40, 18-8 Edelstahl-Taste Kopf Kopfschrauben (0,25"), so dass Nuten bündig mit der einfachen Platte (Abbildung 1 sind)
(4) Narkose Verfahren und Analgesie
- Anästhesie zu induzieren, indem man die Ratte in Induktion Kammer 4 L O2/min mit 4 % Isofluran zu liefern.
Achtung: Wissenschaftliches Personal müssen nicht einatmen betäubende Gas und richtige Kapuze und Belüftung im Labor.
- Entfernen Sie die Ratte aus der Kammer zu, nachdem die Ratte aufrichtenden Reflex verliert, befestigen Sie einen Nase Kegel und auf die Erhaltungsdosis von Anästhesie durch die Nase (O2 Fördermenge um ca. 2-3 L/min und 0,8 % Isofluran).
- Platzieren Sie die Ratte auf das Heizkissen oder unter das wärmende Licht, um Unterkühlung zu verhindern.
- Bestätigen Sie die ausreichende Tiefe der Narkose durch Einklemmen der Zehs oder palpebrale Reflex-Tests.
- Augen zu verhindern Austrocknung der Hornhaut zuweisen Sie Schmierung.
- Eine subkutane Injektion von extended-Release Buprenorphin (1 mg/kg) auf den Stamm/Dorsum der Ratte, weit weg von der Operationsstelle Analgesie für bis zu 3 Tage nach der Operation zu liefern.
(5) aseptischen Vorbereitung und antibiotische Schutzausrüstungen
- Gegend um Hinterbein mit der 13th Rippe, der Fuß, der dorsalen Mittellinie und der ventralen Mittellinie als Margen zu rasieren.
- Scrub rasiert-Bereich mit steriler 2 x 2 Gaze getränkt mit 10 % Povidon-Jod gefolgt von 70 % EtOH (4 mal jeweils abwechselnd).
- Eine intramuskuläre Injektion von Cefazolin (20 mg/kg) in der operativen Quadrizeps zu verwalten.
- Verwalten von Enrofloxacin (0,25 mg/ml) im Trinkwasser für 7 Tage postoperativ um weiterhin Antibiotika geschützt.
- Stellen Sie Ratten auf Medizinalfutter (z. B. Uniprim) für die Dauer der Studie Pin Infektionen zu verhindern.
- Gelten Sie doppelte antibiotische Salbe für die Haut-polige Schnittstelle einmal täglich für 3 Tage postoperativ.
Hinweis: Vermeiden Sie jeder Fixateur externe Pin oder Klemmen Sie lösen, die zu die Entwicklung einer Infektion beitragen können.
(6) chirurgischen Eingriff
Hinweis: Stellen Sie eine konzertierte Anstrengungen zur Aufrechterhaltung eines sterilen Bereich und Arbeitsbereich und sterilen Technik während der Ganzheit des Falles zu folgen.
- Erweitern Sie rasierte Bein durch gefenstert, klar klebrigen drapieren und Deckel op Bank in sterilen Tüchern um einen sterilen Bereich zu erstellen.
- Ertasten der Femur und verwenden Sie eine #15 Klinge erstelle ich einen anterolateralen Einschnitt durch die Haut, die Verlängerung von der Patella auf den Trochanter Major am proximalen Femur.
- Vorsichtig einschneiden der seitliche Bein-Faszie entlang der intermuscular Septum, trennen den Vastus Lateralis Muskel des Quadrizeps anterior aus dem Oberschenkel nach hinten bis die laterale Femur ausgesetzt ist. Bewahren Sie die Entführer gluteal sehnen Einfügung auf den Trochanter Major.
- Führen Sie eine sorgfältige, atraumatische umlaufende Weichgewebe Dissektion und setzen Sie das Femur in seiner Mitte Diaphyse, beginnend auf der Mantelfläche. Um dies zu tun, verwenden Sie eine #15 Klinge sanft den Muskel vom darunter liegenden Knochen verringern, indem die Klinge gegen die Kontur der Knochenoberfläche parallel zu halten. Verwenden Sie einen periostalen Aufzug zu heben den Muskel von den freiliegenden Knochen, wie es zerlegt ist und fahren um die femoral Welle bis ca. 7-10 mm zentrale Diaphyse des Weichgewebes auf allen Seiten zur Vorbereitung der Ostectomy behoben wurde.
Hinweis: Vermeiden Sie Verletzungen an den medialen femoralen neurovaskuläre Bündel.
- Fügen Sie vier 1,0 mm Kirschner (k) Kabel: 2 proximalen und distalen im Femur senkrecht in den seitlichen Oberschenkelknochen, 2 gerichtet gerade Lateral, Medial. Stellen Sie sicher, dass alle Pins beide Cortex (Bicortical) für ausreichende Stabilität (Abb. 2A) engagieren.
- Beginnen Sie mit der distalen-die meisten Pin zunächst nur auf der Ebene der seitlichen Epicondylus. Ort Jig bündig mit der lateralen distalen Femur und fügen Sie einen 1,0 Gewindespitze k-Draht.
- Beibehaltung der Position von der Schablone auf den Knochen, identifizieren Sie, wo die meisten proximalen Knochen anhand der Schablone Löcher die Eingabe der Pin wird. Sobald die Position bestimmt wird, einzuschneiden Sie sorgfältig Parallel zu den Fasern der gluteal Sehnen nach Bedarf erstelle ich eine kleine Lücke im Gewebe des proximalen Pins zu durchfahren, damit Minimierung iatrogener Schäden an der Sehne. Bohren Sie einen 1,0 mm ohne Gewinde k-Draht in diese Lücke wieder sicherstellen, dass der Stift greift beide Cortex (Abb. 2 b).
- Halten Sie die Gigue Position in Kontakt mit dem Knochen zu und Bohren Sie zwei 1,0 mm Gewinde k-Drähte, auf beiden Seiten des Standortes zukünftige defekt. Sicherzustellen Sie, dass Pins führen beide Cortex (Abbildung 2).
- Legen Sie den Fixateur externe bar Level 1 cm über der Haut und festschrauben Sie, sperren die Bar im Ort. Schneiden Sie die überschüssige Pin-Längen (Abb. 2D).
- Bereiten Sie für die Ostectomy (mangels Schöpfung) indem man einen kleinen, gebogenen Retraktor um die vorderen und hinteren Oberschenkel zum Schutz der umgebenden Weichgewebe, Muskel und neurovaskuläre Bündel. Unter Verwendung einer ~ 5 mm sagittale oszillierenden Sägeblatt, einen 5 mm segmentale defekt durch die Mitte Diaphyse sehr vorsichtig zu schaffen. Gelten Sie eine leichte, gleichmäßige Druckverteilung mit der Säge zu vermeiden unnötigen Bruch (Abb. 2E).
- Kleine Mengen von Bewässerung (Raumtemperatur 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung (NS)) je nach Bedarf während der Erstellung Fehler um thermische Nekrose des Knochens zu vermeiden gilt.
- Spülen Sie die Wunde mit 10 mL NS nach dem Erstellen des Mangels.
- Verabreichen Sie 0,1 mL ein Bupivacain 0,25 % mit Adrenalin (1: 200, 000) an die Wunde als Analgetikum und Vasokonstriktor.
- Legen Sie das Gerüst (5 x 3 x 3 mm) von Kollagen Schwamm oder RhBMP-2 getränkten Schwamm (aus Schritt2) in den defekt. Jedes Gerüst sollte entsprechend dimensioniert sein, um die Länge und Umfang des Mangels, helfen den Schwamm in Position bleiben zu überspannen.
Hinweis: an dieser Stelle mRNA-komplexe können vorbereitet und gespritzt wie in Schritten 7.1-7.3 unten beschrieben, wenn die Biolumineszenz Bildgebung durchführen.
- Schließen Sie die Muskel-Ebene mit dem einfachen unterbrochene Muster mit 4: 0 resorbierbaren Naht. Schließen Sie die Hautschicht mit einem laufenden Subcuticular Muster mit 4: 0 resorbierbaren Naht und Haut kleben, um die überstehenden Stifte Lücken zu schließen.
- Entfernen Sie die Ratte aus die Bugnase, noch auf das Heizkissen und überwachen Sie kontinuierlich bis die Ratte in der Lage, konsequent eine aufrechte Körperhaltung beizubehalten. An dieser Stelle legen Sie in einem sauberen Käfig zu erholen.
7. Vorbereitung der komplexiert mRNA und Biolumineszenz Bildgebung
Hinweis: Transfektion mit mRNA-komplexe sollte während der Operation 1 Tag vor der Lumineszenz Bildgebung durchgeführt werden. Verwenden Sie sterile Techniken im Umgang mit mRNA.
- Mischung 10 µL der mRNA Kodierung für Gaussia Luciferase (Lager Konzentration von 1 µg/µL) mit 30 µL des Lipid-transfecting Agenten.
- Ermöglichen Sie die mRNA-Lipid-komplexe zu bilden durch Inkubation für mindestens 5 min bei Raumtemperatur. Die Lipid-transfecting Agent wird die mRNA-Moleküle kondensieren, sie zu stabilisieren und Transfektion Effizienzsteigerung.
Hinweis: Wenn die komplexe nicht sofort verwendet werden, speichern Sie sie im Eis für maximal 1 h.
- Mit einer 20 µL Pipette mit gefilterten Tipps ausgestattet, die Hälfte des Volumens der mRNA-komplexe an den proximalen und distalen Enden des Mangels, bzw. Spritzen.
- Betäuben Sie am nächsten Tag, 3 min vor Bildgebung, die Ratte mit inhalativen Isofluran wie zuvor im Schritt 4.1 beschrieben.
- Positionieren Sie die Ratte in eine in-Vivo imaging-Kammer mit einem Prüfkopf liefert Wartung Isofluran (0,8 % Isofluran, O2 Fördermenge von ca. 2-3 L/min) ausgestattet.
- Coelenterazine Nukleinsäuretablette in Kochsalzlösung in einer Dosis von 4 mg/kg Körpergewicht in der Nähe des Mangels zu injizieren.
- Biolumineszenz-Bilder mit dem in-Vivo imaging-System (IVIS) laut des Herstellers Anweisungen18zu erwerben.
(8) Imaging-Protokoll
- Betäuben Sie nach der Kalibrierung der schlichten radiologischen Maschine, ein x-ray System19Ratte mit inhalativen Isofluran wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 4.1) zu und positionieren Sie die Ratte in einem Prüfkopf mit inhalativen Isofluran (0,8 % Isofluran, O2 Fördermenge von ca. 2-3 L/min) für eine Anteroposterior (AP) Femur Röntgenbild.
- Während die Ratte sternalen liegen wird, voraus die chirurgische Megalosauridae nach vorne beugen in der Hüfte und Gelenk zu ersticken. Das Knie Gelenk um ca. 90° Flex. Kleben Sie die Pfote plantaren Seite nach unten, in der Nähe der Körperwand. Positionieren Sie die Tibia nach vorne aus dem Oberschenkelknochen, die Möglichkeit der Überlagerung der Knochen zu beseitigen. Um leichtes Entführung der Hüfte zu bieten, legen Sie einen transluzenten Schwamm (ca. 15 mm dick) in der Leistengegend. Dann erhalten Sie ein anterior-posterioren (Cranio-caudale) Bild des Oberschenkelknochens.
- Wiederholen Sie diese AP Femur radiologischen Ansicht sofort nach der Operation, 4 und 12 Wochen. Verwenden Sie Band und Gaze, um des Tieres Extremität für Qualität und konsequente Imaging angemessen zu positionieren.
- Entfernen Sie die Ratte aus der Bugnase und überwachen Sie kontinuierlich bis die Ratte in der Lage, konsequent eine aufrechte Körperhaltung beizubehalten. Platzieren Sie anschließend zurück in den Käfig.
9. histologischen Verfahren
- Ratten in einer Kammer mit inhalativen CO2 gemäß AVMA ethischen Standards16einschläfern.
- Nach Euthanasie rasieren die Megalosauridae, entfernen Sie die Haut von der operative Extremität und Machtkonfiguration Femur an der Hüfte. Entfernen Sie vorsichtig alle Weichteile aus dem operativen Oberschenkelknochen (einschließlich alle Muskeln, Sehnen und Bänder). Lassen Sie nur eine dünne Schicht der Muskulatur rund um die defekt-Website, um die heilende Region vor versehentlicher Beschädigung während der Präparation zu schützen.
- Legen Sie das Femur in 10 % Neutral gepufferte Formalin bei Zimmertemperatur ca. 3-4 Tage für Fixierung ermöglichen. Halten Sie ein 15:1 Formalin Gewebe-Volumen-Verhältnis. Wechseln Sie die Lösung einmal auf halbem Weg durch die Fixierung Prozess.
- Entkalken Sie das Femur in eine 15 % Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) pH 6,5 Säurelösung für 3-4 Wochen. Sammeln Sie serielle Röntgenaufnahmen um Entkalkung Endpunkt zu bestimmen.
- Halbieren Sie den Oberschenkelknochen längs mit einem Schnitt von anterior Posterior in der Mitte sagittale Ebene. Gewebe für standard Paraffin einbetten und Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung einreichen.
- H & E Folien zu einem Pathologen zur histologischen Beurteilung zu senden.