Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm

Zusammenfassung

In diesem Manuskript gründeten wir eine Hochdurchsatz Methode zur Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in S. Aureus Biofilm Kultur aus Gewebekultur 96-Well-Platte

Zusammenfassung

Alkalischer Phosphatase (ALP) ist eine gemeinsame Enzym in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen exprimiert. Es katalysiert die Hydrolyse von Phosphat Monoesters aus vielen Molekülen bei grundlegenden pH und Phosphat-Stoffwechsel spielt eine unverzichtbare Rolle. Beim Menschen ist eukaryotische ALP eines der am häufigsten verwendete enzymatische Signale bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, wie z. B. Cholestase und Rachitis. In S. Aureus, ALP wird ausschließlich auf der Zellmembran erkannt; Es wird auch als sekretorischen Form sowie ausgedrückt. Allerdings ist wenig über seine Funktion im Biofilmbildung bekannt.

Dieses Manuskript soll einen schnellen und zuverlässigen Assay zur ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm zu messen, die kein Protein Isolierung erfordert zu entwickeln. Mit p-Nitrophenyl-Phosphat (pNPP) als Substrat, messen wir ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm in 96-Well-Zellkultur-Platten gebildet. Aktivität stützte sich auf die Bildung der lösliche Reaktionsprodukt von 405 nm Absorption gemessen. Die hohen Durchsatz Natur 96 gut Gewebekultur-Platte-Methode bietet eine sensible und reproduzierbare Methode zur ALP Aktivität Assays. Die gleichen experimentellen einrichten kann auch zur Messung der anderen extrazellulären molekulare Marker im Zusammenhang mit Biofilmbildung erweitert werden.

Einleitung

Alkalischer Phosphatase (ALP) drückt sich ubiquitär in beide prokaryotischen und eukaryotischen Zellen¹. Es kann katalysieren die Hydrolyse von Monophosphate aus unterschiedlichen Molekülen wie Nukleotide, Proteine, Alkaloide, Phosphat Ester und Anhydride der Phosphorsäure. Beim Menschen ist die eukaryotische ALP in vielen Geweben einschließlich Leber, Knochen, Darm und Plazenta². Es spielt eine wichtige Rolle in Protein-Phosphorylierung, Zellwachstum, Apoptose, Stammzell-Prozesse sowie normale skelettartigen Mineralisierung. Eukaryotische ALP ist auch eine wichtige Serum-Indikator für das Vorliegen von Krankheiten in Knochen, Leber und andere Gewebe/Organe, wenn erhöht^3,4.

Prokaryotische ALP wurde in einer Vielzahl von bakteriellen Zellen, einschließlich der E. Coli-⁵, S. Aureus^6,7 und einige gemeinsame Pansen-Bakterien in die Böden⁸erkannt. Bakterienaktivität ALP wurde als Biosensor zur Erkennung von Pestiziden, Schwermetallen⁹ und bakterielle Kontamination¹⁰verwendet. Die konstitutive Expression von ALP wurde Staphylokokken¹¹ identifizieren und Enterobacter¹² Serratia unterscheiden verwendet. Es wird weiter vorgeschlagen, dass konstitutive ALP-Produktion mit Pathogenität Staphylokokken¹³korreliert ist. Obwohl in verschiedenen Einstellungen^3,4, ALP untersucht worden ist noch wenig für seine Tätigkeit und Funktion in Biofilmen Kulturen berichtet.

Ein Biofilm ist dokumentiert worden, um ein anders funktionierenden bakterielle Leben im Vergleich zu seinen frei lebende Bakterienzelle Gegenstück¹⁴haben. In S. Aureuswurde die Bildung von Biofilm in einer Vielzahl von Krankheitsbildern und Konten für die Antibiotika-Resistenz und chronische Entzündungen^15,16identifiziert. Viele Moleküle war berichtet worden, um in einem Biofilm-Matrix wie Polysaccharide, Proteine, Nukleinsäuren und Lipiden gefunden werden, aber der Mechanismus der Biofilmbildung ist nicht vollständig verstandenen¹⁴. Um zu verstehen, die Rolle der ALP in Biofilmbildung, wir S. Aureus Biofilme in 96 gut Gewebekultur Platten kultiviert und die ALP-Aktivität mit Para-Nitrophenylphosphate (pNPP) gemessen.

Das Molekül pNPP ist ein Ready-to-Use-Substrat für die ALP und verbreitet, ALP Aktivität^6,17,18zu messen. Dieser farbmetrischen Assay basiert auf der Umwandlung von Para-Nitrophenyl Phosphat (pNPP), Para-Nitrophenol führt ein farbiges Produkt bei 405 nm. Im Vergleich zu anderen herkömmlichen ALP-Assay, wie Agarose gel Elektrophorese¹⁹, Weizenkeime Agglutinin (WGA) Niederschlag und WGA-HPLC²⁰, dieser Test hochspezifisch ist, ermöglicht empfindlich, leicht zu reproduzieren, und die meisten vor allem für hohe Durchsatz.

Protokoll

1. mittlere Vorbereitung

1. 1 L des Tryptic Soy Bouillon (TSB) vorbereiten: in 1 L destilliertes Wasser, 15 g des Pankreas verdauen von Kasein, 5 g papaic Digest von Sojaschrot, 3 g Natrium-Chlorid, 2,5 g Dextrose und 2,5 g Dipotassium Phosphat hinzugeben. Vor Gebrauch sterilisieren.
2. Für Tryptic Soy Agar (TSA), 15 g Agar-Agar hinzufügen 1 L des TSB, Autoklaven. Dann lassen Sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Gießen Sie anschließend bei einem Verhältnis von 20 mL pro Petrischale (100 x 15 mm).
3. Biofilm-Nährmedium: 1 L autoklaviert TSB 10 g Glukose hinzufügen. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einem 0,2 µm-Filter.

2. S. Aureus Biofilmbildung in 96 well Gewebekultur-Platte

Hinweis: Der S. Aureus -Biofilm ist wie zuvor beschrieben^6,21kultiviert.

1. Eine einzelne Kolonie von S. Aureus von TSA in 10 mL TSB zu impfen und wachsen über Nacht bei 37 ° C.
2. Verdünnen Sie die Übernachtung Kultur in 10 mL TSB/Glucose (10 g/L) im Verhältnis 1: 100 (V/V). Wirbel sanft, für eine konsequente Konzentration zu mischen.
3. Übertragen Sie 200 mL der verdünnten Kultur in insgesamt 18 Brunnen (mehr für experimentelle Gruppen, solche nicht-Biofilm-Kontrolle darauf eine Beziehung zur ALP Aktivität⁶) von einer 96-well-Platte. Verwenden Sie Drillinge für jeden Zeitpunkt: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min.. Siehe Punkt 3.2.
4. Inkubieren Sie die 96-well-Platte bei 37 ° C für 24 h für Biofilm Bildung^6,21.
5. Dekantieren des Überstands durch Absaugen.
6. Waschen Sie jeweils gut mit 1 x Phosphat gepufferte Lösung (PBS, pH 7,4), für 5 min bei 15.000 X g Zentrifugieren und dekantieren des Überstandes durch Absaugen.

3. Messung der ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm

Hinweis: ALP-Aktivität war wie beschrieben^6,18gemessen.

1. 75 mL gepufferten ALP Substrat bestehend aus handelsüblichen pNPP in jede Vertiefung aus Schritt 2,6 und beginnen Sie die Aufnahmezeit. Notieren Sie jeden Zeitpunkt in dreifacher Ausfertigung.
2. Nach der Inkubation für eine abwechslungsreiche Zeit: 0 min (Kontrolle), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min. hinzufügen bzw. 75 µL 5 M NaOH, die Reaktion zu stoppen.
3. Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 15.000 X g.
4. 100 µL des Überstandes in eine neue 96-well-Platte für farbmetrische Messung zu übertragen.
5. Messen Sie die Absorption der einzelnen gut bei 405 nm mit Platte 96 auch Leser. Nutzen Sie die 0 min Zeit zeigen Brunnen zu steuern für 405 nm Hintergrundgeräusche.
6. Wiederhole das ganze Experiment in drei einzelnen 96-well-Platten.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis der ALP Aktivität von Biofilm Kulturen von S. Aureus in 96 gut Gewebekultur Platten. 75 μL der im Handel erhältlichen pNPP Lösung wurde jeweils gut und inkubierten bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nach der Inkubation für unterschiedliche Tageszeiten (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min, bzw.) 75 μl 5 M NaOH wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Das Produkt wurde dann gemessen in einem 96-well-Platte-Reader bei 405 nm. Jeden Zeitpunkt wurde wiederholt in Triolen aus einem einzigen 96-well-Platte und das gesamte Experiment wurde wiederholt in 3 einzelnen 96-well-Platten.

Abbildung 1: S. Aureus Biofilm Kulturen wurden für andere Zeit (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min.) mit Substrat pNPP inkubiert und ihre ALP-Aktivität gemessen bei 405 nm. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

In unseren Test haben wir als ALP Substrat pNPP verwendet. Dies ist eine funktionierende Lösung für ELISA und keine Verdünnung erforderlich. Nach Hydrolyse von ALP, ein gelbes Produkt entwickelt und kann gemessen werden, bei 405 nm. Am Ende der enzymatischen Reaktion wir kurz zentrifugiert, die 96-well-Platte und den Überstand auf eine frische 96-well-Platte zur Messung der Extinktion mit dem Platte Reader übertragen. Wir fanden, dass dieses zusätzliche Zentrifugationsschritt kritisch, da es die Konsistenz der Extinktion bei 405 erhöht nm, wahrscheinlich durch den Wegfall möglichen suspendierten Zellen während der enzymatischen Reaktion entstehen.

Für Biofilmbildung verwenden wir 200 μl einer Verdünnung von 1: 100 (V/V) für Übernachtung Kultur als gemeldeten^6,21. Dies ist die optimale Verdünnung für S. Aureus , Biofilm im Vergleich zu anderen Verdünnungen (Daten nicht gezeigt) zu bilden. Da das Ziel dieses Papiers ist, ALP Aktivität im Biofilm zu messen, war es entscheidend, dass wir optimale Biofilm Kulturbedingungen gepflegt. Dies wurde durch die Wahl mit Glukose bei 10 g/L für optimale Biofilm Wachstum⁶weiter betont. Die Verdünnung Faktor und Glukose Konzentration müssen optimiert werden, wenn verschiedene bakterielle Zellen für Biofilmbildung verwendet werden.

Während der Inkubation der Biofilm-Kultur mit Substrat pNPP dauert es Zeit für das farbige Produkt zu entwickeln. Wir Maßen ALP Aktivität nach 15 und 30 min Zeitpunkten was ist, wenn die sichtbare gelbe Farbe beobachtet wird. Mit der aktuellen Konzentration bemerkten wir eine erhöhte Aktivität der ALP für bis zu 75 min, wie in Abbildung 1dargestellt. Nach 75 min wurde keine Erhöhung der ALP Aktivität beobachtet.

Zu guter Letzt da ALP in S. Aureus ist ein ausschließlich Membran gebunden Protein⁷, ihre Tätigkeit ohne Zelle Lysis getestet werden kann. Es gibt Vorteile für eine Enzym-Aktivität-Assay, der keine ganze Zellzerstörung erfordert. Insbesondere kann der Protein-Isolierung-Prozess manchmal ein weniger aktives Enzym Menge²²ergeben. Jedoch kann dieses Protokoll verwendet werden, wenn ALP nicht in seiner Membran gebundenen Form ist.

Wie bereits berichtet⁶ist ALP Aktivität im Biofilm Kultur im Vergleich zu seinem platonischen Gegenstück erhöht. Die experimentelle Einstellungen in der aktuellen Studie können erweitert werden, um Faktoren/Verbindungen zu untersuchen, die ALP in S. Aureus Biofilm beeinflussen. Die Erkenntnisse aus diesen Studien bieten zusätzliche Einblick, wie bakterielle Biofilmbildung steuern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Zentrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH Pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-Nitrophenylphosphat (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typische Konzentrationen von flüssigen pNPP-Substraten, die häufig in Enzyme-Linked Immunesorbent Assays (ELISA) verwendet werden, liegen zwischen 10 und 50 mM. Ähnlich wie bei den meisten gebrauchsfertigen pNPP-Flüssigsubstraten, wie dem hier verwendeten, wird die genaue pNPP-Konzentration aufgrund des proprietären Charakters nicht bekannt gegeben.
10x PBS, pH7,4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptischer Soja-Agar           15 g/l TSB	VWR	9002-18-0
Tryptische Sojabrühe:          g/L Pankreasverdauung von Kasein............ 15.0 Päpstlicher Aufschluss über Sojamehl......... 5,00 Natriumchlorid.............................. 3.00 Traubenzucker........................................   2,50 Dikaliumphosphat.................. 2.50	VWR	90006-098
96-Well-Gewebekulturplatten	BD	6902D09	U-förmiger Boden