Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm

Zusammenfassung

In diesem Manuskript gründeten wir eine Hochdurchsatz Methode zur Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in S. Aureus Biofilm Kultur aus Gewebekultur 96-Well-Platte

Zusammenfassung

Alkalischer Phosphatase (ALP) ist eine gemeinsame Enzym in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen exprimiert. Es katalysiert die Hydrolyse von Phosphat Monoesters aus vielen Molekülen bei grundlegenden pH und Phosphat-Stoffwechsel spielt eine unverzichtbare Rolle. Beim Menschen ist eukaryotische ALP eines der am häufigsten verwendete enzymatische Signale bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, wie z. B. Cholestase und Rachitis. In S. Aureus, ALP wird ausschließlich auf der Zellmembran erkannt; Es wird auch als sekretorischen Form sowie ausgedrückt. Allerdings ist wenig über seine Funktion im Biofilmbildung bekannt.

Dieses Manuskript soll einen schnellen und zuverlässigen Assay zur ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm zu messen, die kein Protein Isolierung erfordert zu entwickeln. Mit p-Nitrophenyl-Phosphat (pNPP) als Substrat, messen wir ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm in 96-Well-Zellkultur-Platten gebildet. Aktivität stützte sich auf die Bildung der lösliche Reaktionsprodukt von 405 nm Absorption gemessen. Die hohen Durchsatz Natur 96 gut Gewebekultur-Platte-Methode bietet eine sensible und reproduzierbare Methode zur ALP Aktivität Assays. Die gleichen experimentellen einrichten kann auch zur Messung der anderen extrazellulären molekulare Marker im Zusammenhang mit Biofilmbildung erweitert werden.

Einleitung

Alkalischer Phosphatase (ALP) drückt sich ubiquitär in beide prokaryotischen und eukaryotischen Zellen¹. Es kann katalysieren die Hydrolyse von Monophosphate aus unterschiedlichen Molekülen wie Nukleotide, Proteine, Alkaloide, Phosphat Ester und Anhydride der Phosphorsäure. Beim Menschen ist die eukaryotische ALP in vielen Geweben einschließlich Leber, Knochen, Darm und Plazenta². Es spielt eine wichtige Rolle in Protein-Phosphorylierung, Zellwachstum, Apoptose, Stammzell-Prozesse sowie normale skelettartigen Mineralisierung. Eukaryotische ALP ist auch eine wichtige Serum-Indikator für das Vorliegen von Krankheiten in Kn....

Protokoll

1. mittlere Vorbereitung

1. 1 L des Tryptic Soy Bouillon (TSB) vorbereiten: in 1 L destilliertes Wasser, 15 g des Pankreas verdauen von Kasein, 5 g papaic Digest von Sojaschrot, 3 g Natrium-Chlorid, 2,5 g Dextrose und 2,5 g Dipotassium Phosphat hinzugeben. Vor Gebrauch sterilisieren.
2. Für Tryptic Soy Agar (TSA), 15 g Agar-Agar hinzufügen 1 L des TSB, Autoklaven. Dann lassen Sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Gießen Sie anschließend bei einem Verhältnis von 20 mL pro Petrischale (100 x 15 mm).
3. Biofilm-Nährmedium: 1 L autoklaviert TSB 10 g Glukose hinzufügen. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einem 0,2 µm-Filter.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis der ALP Aktivität von Biofilm Kulturen von S. Aureus in 96 gut Gewebekultur Platten. 75 μL der im Handel erhältlichen pNPP Lösung wurde jeweils gut und inkubierten bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nach der Inkubation für unterschiedliche Tageszeiten (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min und 75 min, bzw.) 75 μl 5 M NaOH wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Das Produkt wurde dann gemessen in eine.......

Diskussion

In unseren Test haben wir als ALP Substrat pNPP verwendet. Dies ist eine funktionierende Lösung für ELISA und keine Verdünnung erforderlich. Nach Hydrolyse von ALP, ein gelbes Produkt entwickelt und kann gemessen werden, bei 405 nm. Am Ende der enzymatischen Reaktion wir kurz zentrifugiert, die 96-well-Platte und den Überstand auf eine frische 96-well-Platte zur Messung der Extinktion mit dem Platte Reader übertragen. Wir fanden, dass dieses zusätzliche Zentrifugationsschritt kritisch, da es die Konsistenz der Extinktion.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Zentrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH Pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-Nitrophenylphosphat (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typische Konzentrationen von flüssigen pNPP-Substraten, die häufig in Enzyme-Linked Immunesorbent Assays (ELISA) verwendet werden, liegen zwischen 10 und 50 mM. Ähnlich wie bei den meisten gebrauchsfertigen pNPP-Flüssigsubstraten, wie dem hier verwendeten, wird die genaue pNPP-Konzentration aufgrund des proprietären Charakters nicht bekannt gegeben.
10x PBS, pH7,4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptischer Soja-Agar           15 g/l TSB	VWR	9002-18-0
Tryptische Sojabrühe:          g/L Pankreasverdauung von Kasein............ 15.0 Päpstlicher Aufschluss über Sojamehl......... 5,00 Natriumchlorid.............................. 3.00 Traubenzucker........................................   2,50 Dikaliumphosphat.................. 2.50	VWR	90006-098
96-Well-Gewebekulturplatten	BD	6902D09	U-förmiger Boden