Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

Summary

Wir präsentieren einen mit Silikonkautschuk (PDMS) hergestellten Assay mit hoher Durchsatz-Traktionskraft. Dieser neuartige Test eignet sich zur Untersuchung körperlicher Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer und biomedizinischer Prozesse und Krankheiten. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode, indem wir eine TGF--abhängige Erhöhung der Kontraktilität während des epitheliaal-mesenchymalen Übergangs messen.

Abstract

Die zelluläre Kontraktilität ist in verschiedenen Aspekten der Biologie von wesentlicher Bedeutung, die Prozesse antreibt, die von Beweglichkeit und Teilung bis hin zu Gewebekontraktion und mechanischer Stabilität reichen, und stellt ein Kernelement des mehrzelligen Tierlebens dar. In anhaftenden Zellen wird die Acto-Myosin-Kontraktion in Zugkräften gesehen, die Zellen auf ihr Substrat ausüben. Dysregulation der zellulären Kontraktilität tritt in einer Vielzahl von Pathologien auf, was Kontraktilität zu einem vielversprechenden Ziel in verschiedenen diagnostischen Ansätzen macht, die Biophysik als Metrik verwenden. Darüber hinaus können neuartige therapeutische Strategien auf der Korrektur der scheinbaren Fehlfunktion der Zellkontraktilität basieren. Diese Anwendungen erfordern jedoch eine direkte Quantifizierung dieser Kräfte.

Wir haben die Silikonelastomer-basierte Traktionskraftmikroskopie (TFM) in einem parallelisierten Multi-Well-Format entwickelt. Unsere Verwendung eines Silikonkautschuks, speziell Polydimethylsiloxan (PDMS), anstelle des gängigen Hydrogelpolyacrylamids (PAA) ermöglicht es uns, robuste und inerte Substrate mit unbestimmten Haltbarkeiten herzustellen, die keine speziellen Lagerbedingungen erfordern. Im Gegensatz zu säulen-PDMS-basierten Ansätzen, die einen Modul im GPa-Bereich haben, ist das hier verwendete PDMS sehr konform und reicht von ca. 0,4 kPa bis 100 kPa. Wir schaffen eine Hochdurchsatzplattform für TFM, indem wir diese großen monolithischen Substrate räumlich in biochemisch unabhängige Brunnen aufteilen und so eine Multi-Well-Plattform für das Traktionskraftscreening schaffen, die mit bestehenden Multi-Well-Systemen kompatibel ist.

In diesem Manuskript verwenden wir dieses Multi-Well-Traktionskraftsystem, um den Epithel zu Mesenchymal Transition (EMT) zu untersuchen; wir EMT in NMuMG-Zellen induzieren, indem wir sie TGF-B aussetzen und die biophysikalischen Veränderungen während der EMT quantifizieren. Wir messen die Kontraktilität in Abhängigkeit von Konzentration und Dauer der TGF--Exposition. Unsere Ergebnisse hier zeigen den Nutzen von parallelisiertem TFM im Kontext der Krankheitsbiophysik.

Introduction

Acto-Myosin-Kontraktilität ist ein wesentliches Element der aktiven Zellmechanik, die das Zellverhalten von Motilität und Proliferation bis zur Stammzelldifferenzierung beeinflusst. In Geweben treibt Kontraktilität die Aktivität von der polaren Trennung in der Embryogenese bis hin zur Atemwegsverengung und Herzaktivität. Entscheidend ist, dass Zellen, um Spannung zu erzeugen, zuerst an ihrer extrazellulären Umgebung haften müssen. Dabei erzeugt diese Kontraktilität Zugkräfte auf ihre Umgebung. Traction Force Microscopy (TFM) ist in einer Vielzahl von Formen entstanden, um diese Kräfte aus verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren.

Der Bereich des TFM hat eine außergewöhnliche Bandbreite an Innovation und Anwendung erlebt, und die Ergebnisse haben den Weg für neue Perspektiven in der Biologie geebnet, die Mechanik und physikalische Kräfte einbeziehen. Beginnend mit faltenden Silikonsubstraten¹haben Forscher verschiedene Techniken angewendet, um die Zugkraftkräfte der Zelle zu messen. Diese Ansätze wurden kontinuierlich verbessert und haben nun eine Auflösunginshöhe in der Größenordnung von mehreren Mikrometern²erreicht. Es ist jedoch ein Hauptproblem aufgetreten, das die Schwierigkeit ist, Substrate mit entsprechend niedrigen Modulen mit den verfügbaren Silikonen zu schaffen. Um dieses Problem zu umgehen, wurde Polyacrylamid als Ersatz angenommen, da es einfach ist, Substrate in der Größenordnung von 1-20 kPa³zu erstellen. Wir haben vor kurzem sehr konforme Silikone in TFM⁴implementiert, so dass wir die gleiche Reihe von Moduli wie Polyacrylamid fertigen können, aber mit den Vorteilen von inertem und robustem Silikon.

TFM-Ansätze haben wertvolle mechanobiologische Entdeckungen ermöglicht, aber ein anhaltendes Manko ist ihre Komplexität, die ihre Verwendung oft auf Forscher in den ingenieurtechnischen oder physikalischen Disziplinen beschränkt. Dies ist zu einem großen Teil auf die detaillierten Kalibrierungen und anspruchsvollen Berechnungen zurückzuführen, die zur Quantifizierung der Kontraktilität erforderlich sind. Eine weitere große Herausforderung ist, dass TFM-Methoden weitgehend niedrigen Durchsatz und daher ungeeignet sind, viele verschiedene Bedingungen oder Populationen gleichzeitig zu studieren⁵. Dies hat einen Engpass zur Folge, der die Übertragung von TFM von einer spezialisierten Biophysik in breitere biologische und pharmakologische Anwendungen behindert hat.

Wir haben vor kurzem eine Multi-Well-Format TFM-Platte entwickelt, die es Forschern ermöglicht, ihre TFM-Messungen parallelisieren, um die Kontraktilitätsmetriken schneller zu quantifizieren, während die Auswirkungen verschiedener Verbindungen untersucht und auch weniger Reagenzien verwendet werden⁴ . Diese Methode hat einen breiten Nutzen in verschiedenen mechanobiologischen Studien, von der Bewertung der Auswirkungen von Verbindungen auf die zelluläre Aktivität bis hin zur Quantifizierung der kontraktilen Veränderungen in Differenzierung oder Krankheit.

Ein Bereich der biomedizinischen Forschung, der stark von TFM profitieren wird, ist die Untersuchung, wie physikalische Hinweise die bösartigen Phänotypen von Krebszellen beeinflussen. Metastasen, die für 90% der krebsbedingten Todesfälle verantwortlich sind, sind dadurch gekennzeichnet, dass Krebszellen ihre ursprüngliche Tumorstelle verlassen und eine sekundäre Stelle besiedeln. Damit Zellen durch Gewebe wandern und in das Gefäßsystem ein- und auswandern können, müssen sie ihre Formen radikal ändern, um sich durch diese physikalischen Barrieren zu quetschen, während sie erhebliche Kräfte erzeugen, um sich entlang der extrazellulären Matrix zu bewegen oder sich zwischen anderen Zellen. Diese Kräfte werden durch fokale Adhäsionswechselwirkungen^2,3auf das Substrat übertragen und können mit TFM quantifiziert werden. Während Krebserkrankungen biochemisch außergewöhnlich vielfältig sind, mit einem wachsenden Repertoire bekannter Mutationen und Proteinveränderungen, wurden einige häufige physikalische Veränderungen beobachtet; bei einer Vielzahl von Krebsarten, einschließlich Brust-, Prostata- und Lungenkrebs, haben metastasierende Zellen gezeigt, dass sie das 2-3-fache der Zugkraft von nicht-metastasierenden Zellen^{ausüben 6,7,8}. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine starke Korrelation zwischen metastasierender Progression und den Zugkräften der Zellen geben kann; Die detaillierten zeitabhängigen Änderungen der Kontraktilität sind jedoch schwer zu prüfen.

Der epitheliale-mesenchymale Übergang (EMT) ist ein Prozess, bei dem Zellen die adhäsiv- und eng verkäuerte Zellzellhaftung reduzieren und immer wandernder und invasiver werden. Neben physiologischen Funktionen, die Wundheilung und Entwicklungsprozesse umfassen, ist EMT auch ein Prozess, der während der Metastasierung genutzt wird, was es zu einem nützlichen Modellsystem macht, um diesen Prozess zu untersuchen. Mit TGF-B können wir das EMT in murinen Brustepithelzellen (NMuMG)⁹ induzieren, um die physikalischen Veränderungen während dieser Transformation direkt zu quantifizieren und die zeit- und dosisabhängigen Wirkungen von TGF--B auf EMT und Zellkontraktilität zu charakterisieren. In diesem Artikel zeigen wir den Nutzen dieses Ansatzes, indem wir die Veränderungen der Kontraktilität während einer induzierten EMT messen.

Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll wird Forscher bei der Herstellung und Verwendung der Multi-Well-TFM-Schale in Abbildung 1führen.

1. Herstellung von PDMS-Silikonsubstraten

1. Herstellung eines PDMS-Silikonkautschukgemischs auf Basis einer Zusammengesetzten Mischung aus zwei handelsüblichen Kits.
   1. Fügen Sie Teil A und Teil B des PDMS-Kits (z. B. GEL-8100, siehe Materialtabelle)in einem 1:1-Gewichtsverhältnis in das 50 ml-Rohr ein.
      HINWEIS: Die Mischung wird auf einem Rotator mit einer Geschwindigkeit gemischt, die langsam genug ist, damit die Mischung während der Umdrehung hin und her fließt, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
   2. Fügen Sie die erforderliche Menge an Härtungsmittel für den gewünschten Modul des Substrats hinzu.
      HINWEIS: Die Menge des Härtungsmittels, das der Mischung zugesetzt werden soll, hängt vom gewünschten Modul des Substrats ab und kann in der Regel zwischen 0,1 % und 1,8 % liegen. Siehe Tabelle 1 und Abbildung 3 für eine Anleitung zu spezifischen Verklinkerkonzentrationen und resultierenden Moduli.
   3. Mischen Sie die Formulierung auf dem Rotator für 30-45 min; stellen Sie sicher, dass die Drehung langsam genug für eine gründliche Durchmischung ist.
2. Bodenschicht: Beschichtung von PDMS-Substraten auf dem Glasschlitten
   1. Platzieren Sie das in Abbildung 2 dargestellte maßgefertigte Futter auf dem Spincoater. Reinigen Sie das Glas mit Ethanol oder Isopropanol und trocknen Sie es mit einem fusselfreien Tuch. Legen Sie die Glasrutsche in das Futter und schalten Sie das Vakuum ein, um die Folie an Ort und Stelle zu halten.
   2. Tragen Sie ungehärtetes PDMS ca. 1 cm von den Rändern auf und arbeiten Sie in Richtung der Mitte. Tragen Sie genügend (3-4 ml) PDMS auf, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche abgedeckt wird.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das PDMS gleichmäßig auf der Oberfläche des Glases verteilt ist, kann eine Pipettenspitze hilfreich sein, um die PDMS-Mischung von der Mitte bis zu den Rändern zu verteilen.
   3. Drehen Sie das Glas mit der PDMS-Mischung auf einem Spincoater mit dem folgenden Protokoll.
      1. Um das ungeheilte PDMS auf dem Dia zu verteilen, beschleunigen Sie bei 50 U/min/s von 0 auf 200 U/min; halten bei 200 Rpm für 1 min.
      2. Um eine 100 m dicke PDMS-Schicht zu erreichen, bei 50 U/min auf 300 U/min beschleunigen und 1 min bei 300 U/min halten. Unterschiedliche gewünschte Dicken von mehr als 100 m erfordern spezifische Geschwindigkeitswerte.
      3. Um zu entfernen, bei 50 Rpm/s auf 0 rpm abbremsen. Deaktivieren Sie Vakuum und entfernen Sie den beschichteten Schlitten, wobei Darauf zu achten ist, die beschichtete Oberfläche nicht zu berühren.
         HINWEIS: Es ist wichtig, die Beschleunigungs- und Verzögerungsschritte einzubeziehen, um eine glatte, durchgehende Oberfläche zu gewährleisten.
         VORSICHT: Damit die Probe nicht aus dem Futter fliegt, sollte der maßgefertigte Halter verwendet werden, um den Schlitten zu halten, und sich nicht einfach auf Vakuum und das vorhandene Flachefutter verlassen. Die Einzelheiten und Spezifikationen dieses Halters sind in Abbildung 2angegeben.
   4. Legen Sie die spin-beschichtete Probe bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur (100 °C) für 2 h in den Ofen.
      HINWEIS: Die Oberfläche des Ofens, in dem die Probe platziert wird, sollte fest (d. h. kein Drahtgestell) und eine ebene Oberfläche sein, um die gleichmäßige Erwärmung und Dicke der Probe zu gewährleisten. Eine Keramik- oder Stahlplatte bildet eine ideale Oberfläche.
3. Top-Perlen-Schicht
   1. Fügen Sie die Perlenlösung im entsprechenden Verhältnis zur verbleibenden PDMS-Mischung hinzu.
      HINWEIS: Dieses Verhältnis hängt von der Konzentration der Stockperlenlösung und der gewünschten Perlendichte auf der Probe ab. Typische Endwerte sind 9,2 x 10¹¹ Perlen/ml und 0,05-0,2 Perlen/m2 , und ein Überschuss an Perlen ist im Allgemeinen einer unzureichenden Menge vorzuziehen.
   2. Mischen Sie die Perlenlösung mit dem ungehärteten PDMS. Dies kann erreicht werden, indem das Rohr für ca. 30 min auf einen Rotator, 1-2 min wirbelt oder 30 min beschallt wird. Diese Methoden können kombiniert werden.
      HINWEIS: In unserer Anwendung stellen wir fest, dass Beschallung wirksam ist, um Perlenaggregate zu brechen, und Rotation ist effektiv beim Mischen. Synthetisierte Treuhandperlen können sich im Lager anaggregieren. Vor der Verwendung können sie in Hexan resuspendiert und beschallt werden. Wenn es signifikante große Aggregate gibt, kann man die Perlensuspension durch einen 5-mm-Spritzenfilter filtern. Dieser Filtrationsschritt ist optional; es hilft, die Probe mit monodispersen Perlen zu beschichten, aber ein erheblicher Bruchteil der Perlen kann im Filter verloren gehen.
   3. Nehmen Sie die Rutsche aus dem Ofen, lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen und legen Sie sie auf den Spincoater.
   4. 3-4 ml der Perle und das ungehärtete PDMS-Gemisch auf die Oberfläche der beschichteten Probe geben.
      HINWEIS: Die Mischung mit Perlen hinzugefügt ist weniger zähflüssig aufgrund des Hexans. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Substrats nicht zu berühren, da es das bereits beschichtete PDMS-Substrat beschädigen kann. Darüber hinaus darf die Perlenmischung die Oberfläche zunächst nicht befeuchten; achten Sie darauf, dass die Mischung nicht sofort von der ausgehärteten PDMS-Oberfläche abfließt.
   5. Drehen Sie das Beispiel mit dem folgenden Protokoll.
      1. Um die Perle und die ungehärtete PDMS-Mischung zu verbreiten, beschleunigen Sie bei 100 U/min von 0 auf 500 U/min; halten bei 500 Rpm für 1 min.
      2. Um eine dünne Schicht von Perlen-eingebettetem PDMS zu erreichen, beschleunigen Sie bei 200 U/min von 500 auf 5000 U/min; halten bei 5000 Rpm für 10 s.
      3. Um zu entfernen, bei 100 Rpm/s auf 0 rpm abbremsen. Deaktivieren Sie Vakuum und entfernen Sie beschichtete Schlitten, wobei darauf zu achten ist, dass die beschichtete Oberfläche nicht berührt wird.
   6. Die spin-beschichtete Probe 1 h bei 100 °C in den Ofen stellen.
      HINWEIS: Temperaturen über 100 °C oder dauern länger als 1 h können die Strahlfluoreszenz reduzieren. Stellen Sie sicher, dass die Ofentemperatur auf 100 °C und nicht höher eingestellt ist.
   7. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Um die Probe zu lagern, bedecken Sie die Oberfläche, um Staub- und Lichteinwirkung zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass nichts die Oberfläche berührt. Die Probe ist bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit regalstabil.
4. Montage der Platte
   1. Fügen Sie Teil A (Basis) und Teil B (Härtungsmittel, z.B. Sylgard) eines PDMS-Elastomer-Kits in einem 10:1-Gewichtsverhältnis in das 50 ml-Rohr ein.
   2. Mischen Sie die Mischung auf dem Rotator für 30-45 min.
      HINWEIS: Für eine Platte 5 ml Basis mit 0,5 ml Härtungsmittel mischen. Bis zu 1 ml Hexan können hinzugefügt werden, um die Viskosität der Mischung zu reduzieren.
   3. Tragen Sie die Mischung auf den Boden des Teilers auf und verteilen Sie die Mischung.
      HINWEIS: Die Trennwand sollte auf dem Kopf platziert werden.
   4. Legen Sie das Substrat auf den Teiler auf den Kopf.
   5. Die Probe 2 h bei 65 °C auf den Kopf in den Ofen stellen.
   6. Nehmen Sie Proben aus dem Ofen und reinigen Sie den Boden des Glases mit 70% Ethanol oder Isopropanol, um pdMS-Rückstände zu entfernen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Um die Probe zu lagern, legen Sie einen Deckel auf das Substrat und wickeln Sie das Gerät in Aluminiumfolie, um eine Exposition gegenüber dem Licht zu vermeiden. Die Probe ist bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit regalstabil. Die bei dieser Methode verwendete Trennwand ist in einem 96-Well-Format; Allerdings können Forscher je nach gewünschten Experimentseinstellungen und Verfügbarkeit von Trennstrukturen andere Formate (384-well, 2-well, 4-well, 8-well usw.) verwenden. Möglicherweise ist eine weitere Optimierung erforderlich.

2. Oberflächenfunktionalisierung

1. 80 L eines Sulfo-SANPAH-Aliquots in 40 ml 0,1 M HEPES-Puffer (pH 7-9) auflösen.
   HINWEIS: Bereiten Sie Sulfo-SANPAH-Aliquots vor, indem Sie 100 mg Sulfo-SANPAH-Pulver in 2 ml sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. 0,1 M HEPES-Puffer vorbereiten, indem Sie 50 ml HEPES in 450 ml sterilem entionisiertem Wasser verdünnen und durch einen 0,22 m porenfilter filtern.
2. Fügen Sie jedem Bohrgut der 96-Well-Platte 200 L verdünnte Sulfo-SANPAH-Lösung hinzu.
3. Setzen Sie die Platte UV-Licht (300-460nm) in entsprechender Entfernung und Dauer aus.
   HINWEIS: Nach UV-Belastung sollte die Farbe der Lösung dunkler sein. UV-Belichtungsabstand und -dauer hängen von der UV-Lampenleistung ab. In unserer Anwendung setzen wir für 10-15 min in einem Abstand von 5 cm.
4. Entfernen Sie die Sulfo-SANPAH-Lösung aus den Brunnen und fügen Sie jedem Bohrgut 200 l von 5 g/ml Fibronectin-Lösung hinzu.
   HINWEIS: Forscher-spezifisches Protein kann für die Oberflächenbeschichtung verwendet werden. Einige häufig verwendete Proteine sind Kollagen, Fibronectin und Laminin. Wir haben festgestellt, dass Sulfo-SANPAH die effektivste Methode ist, und die Plasmareinigung, während sie manchmal in PDMS eingesetzt wird, wird abgeraten, da sie eine Siliziumdioxidschicht erzeugt und die Oberfläche sichtbar schädigt.
5. Inkubieren Sie die Platte bei 4 °C über Nacht.
   HINWEIS: Je nach Dem verwendeten Protein können je nach Protein unterschiedliche Inkubationsmethoden angewendet werden.
6. Entfernen Sie die Fibronectin-Lösung und waschen Sie jeden Brunnen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zweimal.
7. Legen Sie einen Deckel auf die Probe.
8. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L PBS hinzu.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die fibronectinbeschichteten Proben können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.

3. UV-Sterilisation

1. Sterilisieren Sie die Probe unter UV-Licht in einem biologischen Sicherheitsschrank für 30 min.
   HINWEIS: Längere UV-Expositionszeiten können sich negativ auf die Jesfluoreszenz auswirken. Alle nachfolgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

4. Zellkultur

1. Entfernen Sie PBS aus jedem Brunnen, und fügen Sie jedem Brunnen 200 L Zellen hinzu, die in Kulturmedien suspendiert sind.
   1. Die Zellen mit der gewünschten Zelldichte plattieren. Die Zelldichte hängt vom gewünschten Experiment ab. Bei Einzelzellstudien sollten Zellen mindestens 50 m voneinander entfernt sein, und Zellen in der Nähe der Ränder des Bildfensters sollten nicht in die TFM-Messung einbezogen werden. Bei Monolayer-Zellen sollte das Bildfenster über das Anzeigefeld mit einer konfluenten Zellschicht abgedeckt sein.
   2. Bereiten Sie die kompletten Wachstumskulturmedien für NMuMG-Zellen vor, indem Sie DMEM mit 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 g/ml Insulin, 1% Penicillin-Streptomycin, 1 mM L-Glutamin und 0,5 g/ml Amphotericin B ergänzen.
   3. Herstellung des Insulinbestands durch Rekonstituierung in säuertem Wasser (2,5 ml Eisessigsäure in 130 ml entionisiertem Wasser) auf eine Konzentration von 10 mg/ml. Lagern Sie die Lagerlösung bei 4 °C. Warten Sie, bis die Lösung klar ist, und filtern Sie dann durch einen 0,22 m Porenfilter.
2. TGF--Zusatz
   1. Zur Herstellung des TGF-Lagers 2 g TGF-G in 100 l Zitronensäure (pH 3,0) auflösen und mit 0,22 m Poren sterilisieren. Wirbel nisch die Röhre und aliquot in die gewünschten Volumina. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 °C auf.
   2. Fügen Sie 1,5 L TGF-A-Stammlösung zu 10 ml des gesamten Zellkulturmediums hinzu, um das Zellkulturmedium mit der endgültigen TGF-Konzentration von 3 ng/ml zu bilden.
      HINWEIS: Um 10 mM pH 3,0 Zitronensäure herzustellen, verdünnen Sie die Säure in Wasser und stellen Sie pH auf 3,0 ein, indem Sie HCl hinzufügen.

5. Datenerfassung

1. Erwerben Sie für jede Position mindestens ein Bild von Treuhänderpartikeln und Zellen. Konzentrieren Sie sich auf die Perlenschicht.
   HINWEIS: Die Pixelgröße sollte basierend auf der Größe der verwendeten Treuhandpartikel und der verwendeten Bildverarbeitungsmethode optimiert werden. In dieser Anwendung verwenden die Autoren ein 10x 0.4 NA-Objektiv, und Bilder werden mit einer Auflösung von 1024 x 1024 mit 455 nm/Pixel aufgenommen. Im Allgemeinen ist es hilfreich, eine Auflösung von mindestens 1-5 Pixel pro Perle beizubehalten. hier sind Perlen polydisperse und haben eine individuelle Größe von 300-500 nm. Es ist entscheidend, dass die fluoreszierenden Treuhandperlen im Fokus für Bilder für TFM-Berechnungen stehen. Der Fokus und die bildgebende Qualität der Perlen sollten Vorrang vor der Abbildung der Zellen selbst haben. Es sollte kein Quergespräch zwischen verschiedenen Kanälen geben, insbesondere keine Fluoreszenz, nicht von den Treuhandperlen, die in den bildgebenden Spektren der Perlen erscheinen.
2. Sobald alle Positionen von Interesse aufgezeichnet wurden, fügen Sie jedem Brunnen eine Ablösungslösung hinzu, um kraftfreie Referenzbilder der Treuhänderteilchen zu erhalten.
   1. Zur Herstellung einer Zellablösung eine wässrige Lösung mit 2% TritonX-100, 50 mM Natriumazid und 500 mM Kaliumhydroxid mischen.
      HINWEIS: Die obigen Informationen sind als Beispiel für eine effektive Trennlösung vorgesehen. Verschiedene Ablösungslösungen nach Ermessen der Forscher können verwendet werden, um die Zellen von der Substratoberfläche zu lösen.

6. Bildanalyse

1. Führen Sie die entsprechende Bildanalyse nach Belieben durch.
   HINWEIS: Analysesoftware wurde intern entwickelt. Die Bildanalyse kann mit maßgeschneiderter Software oder Software durchgeführt werden, die online verfügbar ist.

7. Perlensynthese

HINWEIS: Das folgende Protokoll basiert auf der von Klein et al.¹⁰beschriebenen Synthesemethode.

1. Unter einer Dunstabzugshaube den Drei-Hals-Kolben mit einem wassergekühlten Refluxkondensator zubereiten.
   VORSICHT: Stellen Sie eine Synthese in einer gut belüfteten chemischen Rauchhaube auf.
2. 0,5 ml PDMS-Stabilisator und Fluorophor in den Kolben geben.
3. Einen Hals mit einem Gummiseptum mit einer Stickstoffeinlassnadel und einer Auslassnadel ausstatten und den anderen Hals mit einem Gummiseptum ausstatten, um das Reagenz mit einer Spritze hinzuzufügen.
4. 100 ml wasserfreies Hexan in 250 ml in den Kolben geben und einen kleinen magnetischen Rührstab hinzufügen.
5. Den Kolben bei 75 °C in das Mineralölbad stellen und 1 H mit Stickstoffgas reinigen.
6. 6 ml Methylmethacrylat zu einem 25 ml runden Bodenkolben geben.
7. 0,100 g 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN) in den runden Bodenkolben geben und das Gemisch mit Stickstoffgas für 1 h reinigen.
   HINWEIS: Spülen Sie Methylamethacrylat durch vorverpackte Säule, um Inhibitoren vor der Anwendung zu entfernen. Methylamethacrylat und AIBN-Mischung in den Drei-Hals-Kolben geben.
8. Die Lösung wird zunächst trüb und wird milchig. Lassen Sie die Reaktion für 3 h laufen, nachdem die Lösung trüb wird.
9. Nach 3 H, legen Sie den Kolben in einem Eiswasserbad.
10. Vakuumfilter die Lösung mit grobem Filterpapier.
11. Zentrifugieren Sie das Filtrat und setzen Sie die Partikel in Hexan wieder auf.
    HINWEIS: Das Volumen des zu zuzurechnenden Hexans hängt von der gewünschten Konzentration der Perlenlösung ab. Die Beschallung erleichtert die Redispersion der Perlenpartikel in Hexanlösung. Von den Autoren hergestellte Perlen haben polydisperse Durchmesser von ca. 300-500nm. Aufgrund der Verwendung von Kreuzkorrelationsmuster-Tracking zur Bestimmung von Verschiebungen sind keine monodispersen Perlen erforderlich.

8. Rheologie-Messprotokoll

HINWEIS: Rheologie ist nicht für jeden Forscher oder Experiment erforderlich, sondern notwendig, um die Moduli für neue Formulierungen von PDMS zu quantifizieren. In diesem Protokoll verwenden wir ein Scherrheometer, um die Auswirkungen von Verklinker, Frequenz und Dehnung auf Moduli von PDMS-Proben zu messen. Je nach den verfügbaren Werkzeugen und Demenkern kann Moduli auch mit vielen anderen mechanischen Analyseansätzen gemessen werden. Darüber hinaus können Forscher, die dieses Protokoll verwenden, unsere in Tabelle 1, Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellten veröffentlichten Moduli verwenden.

1. Verwenden Sie ein Rheometer mit einer parallelen Plattengeometrie mit einem Durchmesser von 25 mm. Andere Geometrien können verwendet werden.
2. Initialisieren Sie das System und kalibrieren Sie das Gerät und das Messsystem (Parallelplatte, d = 25 mm). Nachdem Sie den Nullspalt gemessen haben, beginnen Sie mit dem Laden der PDMS-Probe.
3. Sobald das PDMS-Elastomer und das Vernetzungsmittel gemischt wurden, pfeifen Sie die Mischung auf die Bodenplatte des Rheometers.
   1. Bewegen Sie die Spindel nach unten, um die Oberseite des PDMS-Samples vollständig zu kontaktieren.
   2. Schneiden Sie die geladene Probe von der Bodenplatte vorsichtig ab.
4. Wenden Sie in einem Dehnungsfegertest für jede Zusammensetzung mit unterschiedlicher Vernetzungsdichte steigende Stämme an, um sicherzustellen, dass die Polymerstruktur bei allen Schermessungen im linearen viskoelastischen Regime verbleibt.
   HINWEIS: Dehnungswerte, die für Zellstudien relevant sind, liegen in der Regel im Bereich von 0,1-10%. Wir haben festgestellt, dass PDMS linear bis zu ca. 100% Stamm ist.
5. Messen Sie den dynamischen Scherspeichermodul (G') und den Verlustmodul (G') des PDMS-Netzwerks in einem Zeit-Sweep-Test mit einer Frequenz von 1 Hz und einer Oszillatorscherdehnung von 0,5 % bei 100 °C.
6. Um die Viskoelastizität und Zeitabhängigkeit des endgültigen PDMS-Netzwerks zu bestimmen, wenden Sie einen Frequenz-Sweep-Test mit einer Frequenz von 0,1-100 Hz und einer oszillatorigen Scherspannung von 0,5 % an.

Results

Vor der Zugabe von TGF-B hat eine konfluente Monoschicht von Zellen eine kopfsteinpflasterartige Form und ist dicht gepackt. Bei der TGF--Behandlung werden die Zellen in der Morphologie länger, vergrößern den Zellbereich und erhalten einen mesenchymalen Phänotyp. Unter Verwendung des mit weichen PDMS-Elastomeren hergestellten Multi-Well-Geräts wurden die physikalischen Eigenschaften von Zellen in insgesamt 17 verschiedenen Bedingungen untersucht. Die Zellen wurden mit vier verschiedenen T...

Discussion

Für den Erfolg dieser Methode ist es entscheidend, eine gleichmäßig beschichtete Probe mit einer konstanten Dicke von ca. 100 m zu haben. Der Modul sollte sorgfältig ausgewählt werden, um die physikalische Bedeutung des biologischen Systems von Interesse zu untersuchen. Bei der Herstellung einer Deckschicht sollte die Konzentration der fiduziden Fluoreszenzpartikel für eine genaue Analyse von Verschiebung und Traktionsspannung optimiert werden. Die Analyse isolierter Einzelzellen erfordert eine dichtere Treuhandschicht a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plate
GEL-8100	Nusil Technology	GEL-8100	High Reines dielektrisches, weiches Silikon-Gel-Kit
Dow Corning Sylgard 184 Silikonverkapselung klar 0,5 kg Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg	Härter
Custom Cut Glas	Hausser Scientific Company		109,6 mm x 72,8 mm x 1 mm Dicke
Target 2TM Nylon-Spritzenfilter	ThermoFisher Scientific	F2513-4
96-Well-Stripwell-Stripwell-Eierkisten-Streifenhalter	Corning	2572
Polystyrol-Universal-Mikrotiterplattendeckel mit Eckkerbe;	Corning	3099
Ethylalkohol	Greenfield Global	P016EA95	0,95
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS-Reagenz, ≥ 99,5%
Surface Coating
Sulfo-SANPAH Vernetzer	Proteochem	c1111-100mg
Fibronektin Rinderplasma	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	Lösung, sterilfiltriert, BioReagenz, geeignet für Zellkultur
PBS, 1X	Wisent	319-005-CL	pH 7,4, ohne Calcium und Magnesium
DMSO	Sigma-Aldrich	472301
Zellkultur
DMEM, 1X	Wisent	319-005-CL	4,5g/L Glukose, mit L-Glutamin, Natriumpyruvat und Phenolrot
FBS (Fetal Bovine Serum)	Wisent	080-150	Premium Qualität  Endotoxin < 1, Hämoglobin < 25
HEPES	Wisent	330-050-EL	1M, freie Säure
Humaninsulin Rekombinant	Wisent	511-016-CM	USP grade
Penicillin-Streptomycin Lösung	Wisent	450-201-EL	100 X, steril filtriert für Zellkultur
L-Glutamin Lösung	Wisent	609-065-EL	200mM Lösung, steril filtriert für Zellkultur
Amphotericin B	Wisent	450-105-QL	250 μm g/ml, steril filtriert für Zellkulturen
Rekombinantes humanes TGF-β 1	Peprotech	100-21	HEK293 Abgeleitete
Essigsäure	Sigma-Aldrich	537020	Glacial, ≥ 99,85%
Zitronensäure	Sigma-Aldrich	251275	ACS-Reagenz, ≥ 99,5%
NMuMG	ATCC	CRL-1636	Maus Brustdrüsen Zelllinie
Natriumazid	Fisher Schientific	AC190385000	99%, extra rein, ACROS Organics
Kaliumhydroxid	Sigma-Aldrich	221473	ACS Reagenz, ≥ 85%, Pellets
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100	Laborqualität
Bead Synthese
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI)	Sigma-Aldrich	468495-100MG	97%
Methylmethacrylat	Sigma-Aldrich	M55909-500ML	enthält ≤ 30  ppm MEHQ als Inhibitor, 99%
Inhibitor-Entferner	Sigma-Aldrich	306312-1EA	Vorgepackte Säule zur Entfernung von Hydrochinon und Monomethylether Hydrochinon
Methacryloxylpropyl Terminiertes Polydimethylsiloxan	Gelest	DMS-R31 (25.000 g/mol)	Polydimethylsiloxan-Stabilisator, 25.000 g/mol, 1.000 cSt
2,2′-Azobis(2-methylpropionitril) (AIBN)	Sigma-Aldrich	441090-25G	98%
Hexan	Sigma-Aldrich	296090-2L	wasserfrei, 95%
Hexan, Isomerengemisch	Sigma-Aldrich	227064-1L	wasserfrei, ≥ 99%
Wasmann  qualitatives Filterpapier, Güteklasse 1	Sigma-Aldrich	WHA1001055	Kreise, Durchmesser 55  mm,
Ausrüstung
Laurell WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
UVP Handheld-UV-Lampe Modell UVGL-58	VWR	21474-622
Rheometer	Anton Paar	MCR 302 WESP