Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af Iophenoxic Acid analoger i små indiske Mongoose (Herpestes Auropunktatus) sera til brug som en oral rabies vaccination biologisk markør

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

Vi tilbød fangenskab mongooses placebo oral rabiesvaccine lokkemad med ethyl eller methyliophenoxic syre som en biomarkør og verificeret agn optagelse ved hjælp af en roman væskekromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metode.

Abstract

Den lille indiske Mongoose (Herpestes auropunktatus) er et reservoir af rabiesvirus (rabv) i Puerto Rico og omfatter over 70% af dyr rabiestilfælde rapporteret årligt. Kontrollen af RABV cirkulation i dyreliv reservoirer er typisk opnås ved en strategi for oral rabiesvaccination (ORV). I øjeblikket ingen Wildlife ORV program findes i Puerto Rico. Forskning i orale rabiesvacciner og forskellige agn typer for mongooses er blevet gennemført med lovende resultater. Overvågning af ORV'S succes afhænger af vurderingen af agn optagelsen af målarter, som typisk involverer evaluering af en ændring i RABV-neutraliserende antistoffer (RVNA) efter vaccination. Denne strategi kan være svær at fortolke i områder med en aktiv Wildlife ORV program eller i områder, hvor RABV er enzootisk og baggrundsniveauer af RVNA er til stede i reservoir arter. I sådanne situationer kan en biomarkør, der er inkorporeret i vaccinen eller agn-matrixen, være nyttig. Vi tilbød 16 bundne mongooses placebo ORV lokkemad indeholdende ethyl-iophenoxic syre (et-IPA) i koncentrationer på 0,4% og 1% inde i agn og 0,14% i den eksterne agn matrix. Vi tilbød også 12 bundne mongooses ORV lokkemad indeholdende methyl-iophenoxic Acid (Me-IPA) i koncentrationer på 0,035%, 0,07% og 0,14% i den eksterne agn matrix. Vi indsamlede en serum prøve før agn tilbud og derefter ugentligt i op til otte uger post tilbud. Vi ekstraherede Iophenoxic syrer fra sera til acetonitril og kvantificerede ved hjælp af væskekromatografi/massespektrometri. Vi analyserede sera for et-IPA eller Me-IPA ved væskekromatografi-massespektrometri. Vi fandt passende mærkning evne til mindst otte og fire uger for et-og mig-IPA, hhv. Begge IPA-derivater kunne være egnede til felt evaluering af ORV agn optagelse i mongooses. På grund af den lang levetid af mærket i Mongoose sera skal man være forsigtig med ikke at tolerere resultater ved at bruge det samme IPA-derivat i de efterfølgende evalueringer.

Introduction

Rabies virus (RABV) er en negativ følelse enkelt strandede lyssavirus, og cirkulerer blandt forskellige dyreliv reservoir arter inden for ordrerne Carnivora og Chiroptera. Flere arter af Mongoose er reservoirer af RABV, og den lille indiske Mongoose (Herpestes auropunktatus) er det eneste reservoir i Puerto Rico og andre caribiske øer i den vestlige halvkugle1,2,3 . Kontrollen af RABV cirkulation i dyreliv reservoirer er typisk opnås gennem en strategi for oral rabiesvaccination (ORV). I USA (USA) koordineres denne ledelses aktivitet af USDA/APHIS/Wildlife Services national rabies Management program (NRMP)4. I øjeblikket ingen Wildlife ORV program findes i Puerto Rico. Forskning i rabiesvacciner og forskellige agn typer for mongooses er blevet gennemført med lovende resultater tyder på en orv program for mongooses er muligt5,6,7,8.

Overvågning af virkningen af ORV afhænger af vurderingen af agn optagelsen af målarter, som typisk involverer evaluering af en ændring i RV-antistof seroprævalens. Men, denne strategi kan være udfordrende i områder med en aktiv Wildlife ORV programmer eller i områder, hvor RV er enzootisk og baggrunden niveauer af RABV neutraliserende antistoffer (RVNA) er til stede i reservoir arter. I sådanne situationer kan en biomarkør inkluderet i agn eller den eksterne agn matrix være nyttig.

Forskellige biologiske markører er blevet brugt til at overvåge agn optagelse i talrige arter, herunder vaskebjørne(Procyon lotor)9,10, stoats(Mustela Ermine)11,12, European badgers ( Meles meles) 13, vildsvin (Sus scrofa)14, små indiske mongooses15 og prærie hunde (cynomysludovicianus)16,17, blandt andre. I USA, operationelle orv lokkemad ofte omfatter en 1% tetracyclin biomarkør i agn matrix til at overvåge agn optagelse18,19. Men ulemper ved brugen af tetracyclin omfatter en stigende bekymring over fordelingen af antibiotika i miljøet, og at påvisning af tetracyclin er typisk invasiv, kræver tandekstraktion eller ødelæggelse af dyret for at opnå knogle prøver20. Rhodamine B er blevet evalueret som en markør i en række forskellige væv og kan påvises ved hjælp af ultraviolet (UV) lys og fluorescens i hår og whiskers10,21.

Iophenoxic Acid (IPA) er et hvidt, krystallinsk pulver, der er blevet brugt til at evaluere indtagelse af agn i coyoter (Canis latrans)22, Arctic Fox (Vulpes lagopus)23, rød ræv (Vulpes vulpes)24, vaskebjørn 9 , 25, vildsvin14, kronhjorte (Cervus elaphus scoticus)26, European badgers12 og fritter (M. Furo)27, blandt flere andre pattedyrarter. Opbevaringstider for IPA varierer efter art fra mindre end to uger i nogle pungdyr28,29, til mindst 26 uger i hovdyr26 og over 52 uger i tamhunde (Canis lupus familiaris)30. Opbevaringstider kan også være dosisafhængige31. Iophenoxinsyre binder kraftigt til serumalbumin og blev historisk påvist ved måling af blodjod-niveauer32. Denne indirekte tilgang blev fortrængt af højtydende væskekromatografi (HPLC)-metoder til direkte måling af iophenoxinsyre koncentrationer med UV-detektion33, og til sidst med væskekromatografi og massespektrometri (LCMS) 34af35. Til denne undersøgelse, en meget følsom og selektiv væskekromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metode blev udviklet, der udnytter multiple reaktion overvågning (MRM) at kvantificere to analoger af iophenoxic syre. Vores mål var at bruge denne LC-MS/MS metode til at evaluere mærkning evne 2-(3-hydroxy-2, 4, 6-triiodobenzyl) propanoinsyre (methyl-IPA eller Me-IPA) og 2-(3-hydroxy-2, 4, 6-triiodobenzyl) butanoinsyre (ethyl-IPA eller et-IPA) og når de leveres i en ORV agn til fangenskab mongooses.

Mongooses blev levende fanget i bur fælder loget med kommercielt tilgængelige røget pølser og fiskeolie. Mongooses blev anbragt i individuelle 60 cm x 60 cm x 40 cm rustfrit stål bure og fodret en daglig ration af ~ 50 g kommerciel tør kattefoder, suppleret to gange om ugen med en kommercielt tilgængelig kylling lår. Vand var til rådighed ad libitum. Vi leverede to derivater af IPA, ethyl-IPA og methyl-IPA, til bundne mongooses i placebo ORV lokoer. Alle lokkemad var sammensat af en 28 mm x 20 mm x 9 mm folie blisterpakning med en ekstern belægning (herefter "Bait matrix"), der indeholder pulveriseret hønseæg og gelatine (tabel over materialer). Lokkemad indeholdt 0,7 mL vand eller IPA-derivat og vejede ca. 3 g, hvoraf ~ 2 g var den udvendige agn matrix.

Vi tilbød 16 captive mongooses et-IPA i tre koncentrationer: 0,14% (2,8 mg et-IPA i ~ 2 g agn matrix; 3 hanner [m], 3 hunner [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA i 0,7 mL blisterpakning volumen; 3m, 3f), og 1,0% (7,0 mg ethyl-IPA i 0,7 mL blisterpakning volumen; 2m , 2f). Den samlede dosis på 2,8 mg svarer til en dosishastighed på 5 mg/kg27,36 og er baseret på en gennemsnitlig Mongoose vægt på 560 g i Puerto Rico. Vi valgte 1% som den højeste koncentration som forskning tyder smag aversion til nogle biomarkører kan forekomme i koncentrationer > 1% i nogle arter37. Vi tilbød kun 1% dosis i blisterpakningen, da flokkulering forhindrede den opløftning i at opløses i opløsningsmidlet tilstrækkeligt til at blive jævnt indarbejdet i agn matrixen. En kontrolgruppe (2m, 1f) modtog lokkemad fyldt med sterilt vand og ingen IPA. Vi tilbød lokoer til mongooses om morgenen (~ 8 a.m.) under eller før fodring af deres daglige vedligeholdelse ration. Agn rester blev fjernet efter ca. 24 timer. Vi indsamlede blodprøver før behandling, en dag efter behandling og derefter ugentligt op til 8 uger efter behandling. Vi bedøvet monokser ved indånding af isoflurangas og opsamlet op til 1,0 mL fuldblod ved venepunktur af kraniel Vena cava som beskrevet for fritter38. Vi centrifugerede hele blodprøver, overførte sera til cryovials og opbevarede dem ved-80 °C indtil analyse. Ikke alle dyr blev udtaget i alle perioder for at minimere virkningerne af gentagen blodprøvetagning på dyrenes sundhed. Kontroldyrene blev udtaget på dag 0 og derefter ugentligt i op til 8 uger efter behandlingen.

Vi leverede mig-IPA i tre koncentrationer: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) og 0,14% (2,8 mg), alle indarbejdet i agn matrix, med 2 hanner og 2 kvinder pr. behandlingsgruppe. To mænd og to hunner fik loits fyldt med sterilt vand og ingen IPA. Agn tilbyder tider og Mongoose anæstesi er beskrevet ovenfor. Vi indsamlede blodprøver før behandling på dag 1, og derefter ugentligt op til 4 uger efter behandling.

Vi testede serum koncentrationsdata for normalitet og anslåede midler for serum IPA koncentrationer af forskellige behandlingsgrupper. Vi brugte en lineær blandet model til at sammenligne gennemsnitlige serum et-IPA koncentrationer samlet på tværs af individer. Agn type (matrix/blisterpakning) var en fast effekt i tillæg til eksperimentel dag, hvorimod Animal ID var en tilfældig effekt. Alle procedurer blev kørt ved hjælp af fælles statistisk software (tabel over materialer) og signifikans blev evalueret ved α = 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af USDA National Wildlife Research Centers institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg under den godkendte forskningsprotokol QA-2597.

Bemærk: følgende protokol beskriver analyseproceduren til påvisning af methyliophenoxinsyre i monokose serum. Denne metode er den endelige version af en iterativ proces, der begyndte med analyse af ethyl-iophenoxic syre i Mongoose serum. Under den indledende evaluering af ethyl-iophenoxinsyre blev der foretaget mindre ændringer af metoderne, hvilket resulterede i den endelige protokol præsenteret nedenfor. Repræsentative resultater omfatter dem, der er opnået under begge iterationer.

1. udarbejdelse af løsninger og standarder

  1. Købe mig-IPA og et-IPA.
  2. For mobile fase A, Forbered 1 l af 0,1% (v/v) myresyre i vand ved at kombinere 1 ml myresyre med 1 l ultrarent vand (≥ 18 MΩ). For mobile fase B, Forbered 1 L af 0,1% (v/v) myresyre i acetonitril (ACN) ved at kombinere 1 mL myresyre med 1 L ACN.
  3. For fortyndingsmiddel, Forbered 200 mL af 0,5% (v/v) trifluoroeddikesyre (TFA) i ACN ved at kombinere 1 mL TFA med 200 mL ACN.
  4. Forbered koncentrerede IPA-stamopløsninger af mig-IPA og et-IPA i ACN ved koncentrationer på ca. 1.000 μg/mL.
    1. Vejer ca. 10 mg Me-IPA på en mikrobalance og registrerer massen til ± 0,0001 mg. Overfør kvantitativt Me-IPA til en 10 mL klasse A-målekolbe med 45 mL ACN. Sonicate 1 min til at opløse alle faste stoffer, og derefter bringe til volumen med ACN.
    2. ~ 8 mL af hver bestand overføres til gule 8 mL hætteglas med polytetrafluorethylen (PTFE)-foret hætter. Opbevares ved stuetemperatur (RT). Overføre den resterende bestand til farligt affald.
  5. For 25x-7 Me-IPA-bestanden (tabel 1) skal du forberede et lager af mig-IPA i ACN på ca. 200 μg/ml. Eksempel: Overfør 1 mL af Me-IPA-koncentreret bestanden fra trin 1.4.2 til en 5 mL klasse A-målekolbe ved hjælp af en 1.000 μL glassprøjte. Fortyndes til volumen med ACN. Bestanden overføres til et gult 8 mL hætteglas med PTFE-foret hætte. Store på RT.
  6. Forbered de seks yderligere 25x Me-IPA-bestande, der er beskrevet i tabel 1. For hver bestand kombineres de mængder, der er angivet ved hjælp af en gentagelses pipette i et gult 8 mL gult hætteglas med PTFE-foret hætte. Opbevar hver bestand på RT.
  7. For 25x surrogat bestanden skal du forberede et surrogat lager af mig-IPA i ACN på ca. 10 μg/mL fra den koncentrerede bestand fremstillet i trin 1.4.2. 0,100 mL af den koncentrerede Me-IPA-bestand overføres til en 10 mL klasse A-målekolbe med en 100 μL glassprøjte og fortyndes derefter til volumen med ACN.
    1. Overfør ~ 8 mL til et gult 8 mL hætteglas med PTFE-foret hætte. Opbevares ved RT. Overfør det resterende materiel til farligt affald.
  8. Forbered 4X-lagre, der indeholder begge analytter i 2 mL skrue-top glas Autosampler hætteglas som beskrevet i tabel 2.
    1. For eksempel, at forberede bestanden 4X-7, til et 2 ml hætteglas, tilsættes 0,20 ml af 25x-7 mig-IPA bestand fra trin 1,5 ved hjælp af en Gentag pipette med 0,5 ml kapacitet spids. Der tilsættes 0,20 ml af 25x surrogat et-IPA-bestanden fra trin 1,7 ved hjælp af en gentagelses pipette med 0,5 ml kapacitets spids.
    2. Tilsæt 0,85 mL ACN med en gentaget pipette med 1 mL-spids. Hætteglasset forsvarligt og vend 5x for at blande.
  9. Standardkurven forberedes i 2 mL skrue-top Autosampler hætteglas som beskrevet i tabel 3.
    1. For eksempel, for at forberede standard 7 (Std 7), til et 2-mL hætteglas, tilsættes 0,20 mL af 4X-7-bestanden fra trin 1.8.2 ved hjælp af en gentagelses pipette med 0,5 mL-kapacitets spids. Der tilsættes 0,60 ml ultrarent di-vand ved hjælp af en gentagelses pipette med 1 ml-spids. Hætteglasset forsvarligt og vend 5x for at blande.

2. forberedelse af prøver

Forsigtig: personale, der udfører denne procedure skal have modtaget hele rækken af rabies præ-eksponering profylakse og har en dokumenteret rabies antistof titer over 0,5 IU fra en føderal bedrifts sundheds udpeget medicinsk facilitet. Personalet skal på alle tidspunkter bære laboratorie frakker og øjenværn, mens de udfører ekstraktionen. Forsigtig: Udfør trin 2.3 − 2.6 i et biosikkerheds kabinet i klasse II.

  1. For hver prøve forberedes et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, der indeholder 200 − 300 mg NaCl. Arranger rørene i en 80-position plastik rack. Afsat til brug i trin 2,6.
    Bemærk: en Micro scoop (eller en anden lille måleanordning) anbefales til et stort antal prøver.
  2. For hver prøve etiket to 1,5 mL mikrocentrifuge glas: en som "A" og den anden som "B". Arranger rørene i en 80-position plastik rack.
  3. Placer følgende materialer og udstyr, der er nødvendigt for serum ekstraktion i et klasse II-biosikkerhedskabinet: mikrocentrifuge glas (i stativer), der er fremstillet i trin 2,1 og 2,2, en vortex-mixer, en gentagelses pipette med 0,5 mL og 5 mL-spids spidser, 100 − 1000 μL luft forskydning pipette med 1.000 μl spidser, beholdere med ca. 100 ml hver af fortyndingsvæske og ultrarent di vand og en beholder til biologisk farligt affald.
  4. Fjern serumprøver fra frosset opbevaring og varm til RT i biosikkerheds kabinettet. Vortex blandes hver serum prøve før prøvetagning.
  5. Ved hjælp af en gentagelses pipette med 0,5 mL kapacitets spids dispenserer 0,050 mL Mongoose serum i tube "A" og tilsættes 0,050 mL 25x surrogat bestand. Tilsæt derefter 0,950 mL fortyndingsmiddel til tube "A" ved hjælp af en gentagelses pipette med 5 mL spids. Hætten forsvarligt og vortex mix for 10 − 15 s.
  6. Aflad den forvejede NaCl fra trin 2,1 til tube "A" og vortex mix 3x for 8 − 12 s. tør de udvendige overflader af hætteglasset, der indeholder røret "A", af med 70% (v/v) isopropanol.
    Bemærk: rack af prøver kan nu fjernes fra klasse II-biosikkerheds kabinettet.
  7. Centrifugeglasset "A" ved 12.000 x g i 1 min. for at adskille den vandige og ACN-fase. Afpipettér 0,80 mL af den øvre ACN-fase til tube "B" ved hjælp af en pipette med en luft fortrængning på 100 − 1000 μL. Den resterende opløsning i tube "A" overføres til farligt affald, og det tomme rør kasseres i en beholder til biologisk farligt affald.
  8. Fjern ACN og TFA fra tube "B" med en blid strøm af N2 -gas i et 45 °c-vandbad.
  9. Tilsæt 0,250 mL ACN til tube "B" ved hjælp af en gentaget pipettor, vortex mix for 4 − 5 s, og centrifuger derefter kortvarigt (2 − 4 s) ved 12.000 x g for at samle væsken i bunden af røret.
  10. Der tilsættes 0,750 ml ultrarent di vand til røret "B" ved hjælp af en gentagelses pipette med 5 ml spids, vortex mix for 4 − 5 s og derefter centrifugeres i 1 min ved 12.000 x g for at tydeliggøre prøven.
  11. Overfør 0,75 mL af supernatanten til et Autosampler-hætteglas ved hjælp af en pipette med luft forskydning på 1.000 μL. Kassér pipettespidser i beholderen til biologisk farligt affald.
  12. Hætteglas med Autosampler, og analysér med LC-MS/MS (afsnit 4). Den resterende opløsning i røret "B" overføres til farligt affald, og det tomme rør bortskaffes til en beholder til biologisk farligt affald. Alt biologisk farligt affald bortskaffes ved autoklave eller forbrænding.

3. kvalitetskontrol prøver

Forsigtig: Følg de advarende udsagn, der er beskrevet i afsnit 2.

Bemærk: følgende procedure beskriver det mindste antal kvalitetskontrol prøver (QC), der kræves til en analyse. Replikater på hvert niveau anbefales, hvis tilstrækkelig kontrol Mongoose serum er til rådighed.

  1. Forbered fire 1,5 mL mikrocentrifuge glas indeholdende 200 − 300 mg NaCl. Arranger rørene i en 80-position plastik rack.
  2. For hver QC-prøve, etiket to 1,5 mL mikrocentrifuge glas: en som "A" og den anden som "B". Arranger rørene i en 80-position plastik rack.
  3. Gentag trin 2,3.
  4. Fjern Control Mongoose serum fra frosset opbevaring og varm til rt i biosikkerhed kabinettet. Vortex Bland kontrolserummet før prøvetagning.
  5. Der dispenserer 0,050 mL af Control Mongoose serum i de fire 1,5-mL "A"-rør ved hjælp af en gentagelses pipette med 0,5 mL kapacitets spids.
  6. Befæste hver af de fire QC prøver som angivet i tabel 4 ved hjælp af en Gentag pipette med 0,5 ml kapacitet spids. Cap hver QC prøve sikkert og vortex mix for 10 − 15 s.
  7. Udfør ekstraktions proceduren som beskrevet i trin 2.6 − 2.12.

4. LC-MS/MS analyse

  1. Konfigurer LC-MS/MS med alle parametre, der er beskrevet i tabel 5. Tænd LC-MS/MS, og lad kolonnen nå 70 °C, før du indstiller strømningshastigheden til 0,800 mL/min.
  2. Konfigurer en sekvens i dataindsamlings softwaren (tabel over materialer) til at injicere standardkurven før og efter hver batch bestående af kvalitetskontrol prøver og ukendte prøver.
  3. Injicer alle standarder og prøver, og få MRM ionkromatogrammer ved hjælp af parametrene i tabel 5.
  4. Efter sekvens afslutningen skal du slukke LC-MS/MS og bortskaffe alle Autosampler-hætteglas som farligt affald.

5. kvantificering

  1. Brug dataanalyse softwaren til at generere en kalibreringskurve med relative svar versus relative koncentrationer for mig-IPA ved hjælp af et-IPA som den interne standard. Beregn de relative svar fra Kvantifikatoren MRM Transition for Me-IPA (556,6 → 428,7) divideret med MRM-overgangen for et-IPA (570,7 → 442,7). Konstruer en kalibreringskurve på 7 niveauer ved hjælp af en anden ordre kvadratisk funktion, der er vægtet 1/x, og ignorerer oprindelsen.
  2. Beregn serumkoncentrationen (Cserum) af Me-IPA ved hjælp af følgende ligning:
    Equation 1
    Hvis c-instrumentet er den koncentration, der bestemmes af instrumentet fra kalibreringskurven i enheder af μg/ml, er 1,25 fortyndingsfaktoren Equation 2 , v-finalen er den endelige prøvevolumen (1,0 ml), og v-serum er serum volumenet i ml ( 0,050 mL nominel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative ionkromatogrammer fra en Me-IPA-analyse er præsenteret i figur 1. Control Mongoose serum (figur 1a) illustrerer Opbevaringstiden for et-IPA (surrogat analysand) og fraværet af mig-IPA på den angivne retentions tid. Kvalitetskontrol prøven (figur 1b) illustrerer den baseline adskillelse af Me-IPA fra et-IPA samt Kvantifikatoren og kvalifikatorovergangene for Me-IPA. Figur 1c viser en repræsentativ prøve fra studiet med en observeret serumkoncentration på 33,5 μg/ml Me-IPA.

I figur 2vises en repræsentativ kalibreringskurve fra en Me-IPA-analyse. Den 7-niveau, 14-punkts standardkurve spænder fra 0,00202 til 8,27 μg/mL Me-IPA med en korrelationskoefficient (r2) af 0,9998. Korrelationskoefficienterne varierede fra 0,9998 til 0,99997 for de fem me-IPA-analyser. Koncentrationen af surrogat analysand et-IPA var 0,502 μg/mL i alle standarder.

Tabel 6 præsenterer nøjagtigheds-og præcisions resultaterne for Control Mongoose serum tilsat 0, 1,3, 31 og 82 μg/ml Me-IPA (n = 10 på hvert niveau). Resultaterne blev indsamlet fra fem separate analyser. Procentdelen af inddrivelser varierede fra 96,9% til 109%. Den relative procentvise standardafvigelse (% RSD) ved de tre befæstning niveauer var henholdsvis 3,4%, 1,7% og 2,3%.

Signal-støj-forholdet (S/N), der er observeret i kvalitetskontrol prøver (n = 10 negative kontroller; n = 10 ved 1,3 μg/mL Me-IPA) blev anvendt til at bestemme detektionsgrænsen (DL; 3 x S/N) og kvantificeringsgrænse (QL; 10 x S/N). DL og QL for Me-IPA i Mongoose serum var henholdsvis 0,012 μg/mL og 0,042 μg/mL.

Toparealet svar af kvalifikatoren MRM overgang divideret med Kvantifikatoren MRM Transition (Equation 3 blev beregnet for alle standarder og prøver. Dette forhold for hver prøve blev derefter divideret med det gennemsnitlige forhold, som er observeret i kalibrerings standarderne, for at bestemme kvalifikatorprocenten. Kvalifikatorforholdet for eksemplet vist i figur 1c var 0,439, med en 96,3% match.

Genvinding af et-IPA-surrogat analysand blev beregnet for alle QC-prøver og ukendte prøver ved at dividere et-IPA-topområde respons med det gennemsnitlige respons på et-IPA-topareal, som er observeret i kalibrerings standarderne. De gennemsnitlige inddrivelser af surrogat analysand var 91,0% (negative kontroller), 91,4% (1,3 μg/mL), 92,8% (31 μg/mL) og 95,4% (82 μg/mL).

Ingen interferens toppe for hverken kvantifier eller kvalifikator overgange af Me-IPA blev observeret i Control Mongoose serum (figur 1a).

Ekstraktions proceduren og instrumentale forhold, der anvendes til at bestemme et-IPA i Mongoose serum (figur 3 og tabel 7), var identisk med Me-IPA-metoden, men med følgende ændringer. Propyl-iophenoxinsyre (pr-IPA) blev anvendt som surrogat analysand, og der blev anvendt en ældre, mindre følsom LC-MS/MS. Kilden tørring gas temperatur var 350 °C med et flow på 12 L/min og en nebulisator Tryk på 35 PSI. Kapillar spændingen var-2.500 V. Kilden havde ingen kappe gas eller midler til at justere dyse spænding. Kvantifikatoren MRM Transition for et-IPA var 570,7 → 442,8 (584,7 → 456,8 for pr-IPA). Fragmentor var 80 V og kollisions energien var 10 V for begge analytter. Kvalifikatoren MRM for et-IPA var 570,7 → 126,8 med en kollisionsenergi på 40 V.

Testningen af alle monteske serumprøver for et-IPA blev udført i løbet af otte analyser. Kalibreringskurven på 7 niveauer varierede fra 0,00207 til 8,48 μg/mL med korrelationskoefficienter (r2), som spænder fra 0,9990 til 0,9999. Koncentrationen af surrogat analysand pr-IPA var 0,512 μg/mL. Tabel 7 præsenterer nøjagtigheds-og præcisions resultaterne for Control Mongoose serum tilsat 0, 1,3, 13, 32, 85 og 170 μg/ml Me-IPA. Resultaterne blev indsamlet fra otte separate analyser. Procentdelen af inddrivelser varierede fra 89,5% til 115%. % RSD ved de fem befæstning niveauer var henholdsvis 4,3%, 1,5%, 2,3%, 5,6% og 1,1%. S/N observeret i kvalitetskontrol prøver (n = 21 negative kontroller; n = 21 ved 1,3 μg/mL Me-IPA) blev anvendt til at bestemme DL og QL. DL og QL for Me-IPA i Mongoose serum var henholdsvis 0,12 μg/mL og 0,42 μg/mL. Den gennemsnitlige surrogat analysand genfinding fra kvalitetskontrol prøver var 86,8% (n = 75). Ingen interferens toppe for hverken kvantifier eller operator overgange af et-IPA blev observeret i kontrol Mongoose serum.

Alle monokser tilbød et-IPA-lokkemad forbrugt ≥ 25% af lokkemad inden for 24-timers tidsbegrænsningen og havde kvantificerbare niveauer af et-IPA i deres sera (tabel 8). Fra den blandede model analyse var de samlede gennemsnitlige serum-IPA-koncentrationer marginalt højere fra lokkemad med 2,8 mg biomarkør i agn-matrixen (17,5 μg/mL, 95% CI 11,7 − 23,3 μg/mL) sammenlignet med blisterpakningen (9,8 μg/mL, 95% CI 4,0 − 15,6 μg/mL) (F = 3,6 , P = 0,07). Koncentrationer for begge lokke typer, som er afveget med eksperimentel dag (β =-0,15 ± 0,04, F = 14,4, P = 0,0005). Individuelle niveau variabilitet i serum IPA-koncentrationerne blev observeret (parameter estimat for dyreid-Kovarians = 46,6 ± 20,7). Alle mongooses forbruges 100% af kontrol lokket med kun den tomme folie blisterpakning tilbage. Den gennemsnitlige koncentration af et-IPA-restkoncentrationer i serum var variabel efter tidsperiode og synes ikke at falde konsekvent over tid (figur 3).

Alle mongooses tilbød mig-IPA lokkemad forbruges ≥ 25% af agn inden for 24 time tidsgrænsen og havde kvantificerbare niveauer af mig-IPA i deres sera (tabel 9). Gennemsnitlig serologisk koncentration af et-og mig-IPA i Mongoose sera forekom afhængig af koncentrationen af IPA i lokkemad. Højere koncentrationer af IPA i agn resulterede i højere serum rester selv i tilfælde, hvor den samlede dosis (2,8 mg i tilfælde af et-IPA) forblev den samme. Interessant, mig-IPA syntes at producere en mere jævn nedbrydning mønster over tid med en indledende spike på dag 1, efterfulgt af en støt nedgang indtil dag 14, hvor koncentrationerne syntes at plateau (figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Repræsentative ionkromatogrammer. A) repræsentativt MRM ionkromatogram af kontrol monokose serum tilsat surrogat analysand ethyl-iophenoxic syre (et-IPA). Pilen angiver Opbevaringstiden for methyl-iophenoxic Acid (Me-IPA). B) repræsentativt MRM ionkromatogram af Control Mongoose serum tilsat 31 μg/ml Me-IPA. De relative intensiteter af den kvantifikator (Quant) og operator (qual) overgange for mig-IPA er vist. C) repræsentativt MRM-ionkromatogram af en monakose serum prøve med en observeret Me-IPA-koncentration på 33,5 μg/ml. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentativ kalibreringskurve. En original kalibreringskurve genereret af dataanalyse softwaren til methyl-iophenoxic Acid (Me-IPA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Gennemsnitlig serum-ETHYLIPA-koncentration (et-IPA) ved agn type og koncentration over tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Gennemsnitlig koncentration af serum METHYLIPA (Me-IPA) ved agn koncentration over tid. Alle Me-IPA-koncentrationer blev indarbejdet i den eksterne agn matrix. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Me-IPA-koncentration (μg/mL)
Id
25x-7 Se trin 1,6 200
25x-6 Kombiner 1,000 mL 25x-7 aktier med 3,000 mL ACN 50
25x-5 Kombiner 1,000 mL 25x-6 aktier med 3,000 mL ACN 13
25x-4 Kombiner 1,000 mL 25x-5 aktier med 3,000 mL ACN 3,1
25x-3 Kombiner 1,000 mL 25x-4 aktier med 3,000 mL ACN 0,78
25x-2 Kombiner 1,000 mL 25x-3 aktier med 3,000 mL ACN 0,2
25x-1 Kombiner 1,000 mL 25x-2 aktier med 3,000 mL ACN 0,049

Tabel 1: klargøring af 25x Me-IPA-lagre i ACN (i 8 mL ravfarvet hætteglas).

Koncentration (μg/mL)
Id Me-IPA et-IPA
4X-7 0,200 mL 25x-7 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 32 1,6
4X-6 0,200 mL 25x-6 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 8 1,6
4X-5 0,200 mL 25x-5 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 2 1,6
4X-4 0,200 mL 25x-4 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,5 1,6
4X-3 0,200 mL 25x-3 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,12 1,6
4X-2 0,200 mL 25x-2 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,031 1,6
4X-1 0,200 mL 25x-1 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,008 1,6
4X-0 0,200 mL 25x surrogat + 1,050 mL ACN 0 1,6

Tabel 2: klargøring af 4X IPA-lagre i ACN (i 2-mL Autosampler-hætteglas).

Koncentration (μg/mL)
Id Me-IPA et-IPA
Std 7 0,200 mL 4X-7 + 0,600 mL DI vand 8 0,4
Std 6 0,200 mL 4X-6 + 0,600 mL DI vand 2 0,4
Std 5 0,200 mL 4X-5 + 0,600 mL DI vand 0,5 0,4
Std 4 0,200 mL 4X-4 + 0,600 mL DI vand 0,13 0,4
Std 3 0,200 mL 4X-3 + 0,600 mL DI vand 0,03 0,4
Std 2 0,200 mL 4X-2 + 0,600 mL DI vand 0,0078 0,4
Std 1 0,200 mL 4X-1 + 0,600 mL DI vand 0,002 0,4
Std 0 0,200 mL 4X-0 + 0,600 mL DI vand 0 0,4
Tom 0,200 mL ACN + 0,600 mL DI vand 0 0

Tabel 3: klargøring af Me-IPA-standarderne i 75/25-vand/ACN (i 2-mL Autosampler-hætteglas).

Koncentration (μg/mL) i serum
Id Me-IPA et-IPA
Negativ kontrol 0,050 mL 25x surrogat + 0,950 mL fortyndingsmiddel 0 10
Lav befæstning 0,050 mL 25x surrogat + 0,020 mL 25x-4 + 0,930 mL fortyndingsmiddel 1,2 10
Mid befæstning 0,050 mL 25x surrogat + 0,030 mL 25x-6 + 0,920 mL fortyndingsmiddel 30 10
Høj befæstning 0,050 mL 25x surrogat + 0,020 mL 25x-7 + 0,930 mL fortyndingsmiddel 80 10

Tabel 4: prøve befæstning af kvalitetskontrol (Forbered i 1,5-mL mikrocentrifuge glas).

Flydende kromatografi:
Kolonne: C18, 2,1 x 50 mm, 2,5 μm partikelstørrelse
Kolonne temperatur: 70 °C
Injektionsvolumen: 5 μL
Strømningshastighed: 0,800 mL/min
Mobil fase: Solvens A: 0,1% myresyre i vand
Solvens B: 0,1% myresyre i ACN
Gradient program:
Tid (min.): 0 0,25 2,25 2,26 3,4 3,41 4,75
B 40 40 55 100 100 40 40
Nåle vask: ACN, 3 s
MS/MS kilde: ESI (negativ tilstand)
Gastemperatur: 300 °C
Gasflow: 5 L/min
Forstøver: 45 PSI
Kapillær: -4000 V
Dyse spænding: -500 V
Kappe gas temperatur: 250 °C
Kappe gas flow: 7 L/min
MRM-overgange:
Analysand Prækursor ion (m/z) Produkt-ion (m/z) * Fragmentor (V) Kollisionsenergi (V) Opholdstid (MS) Tids segment
Me-IPA 556,6 428,7 74 12 60 2
126,9 65 60
126,8 61 60
Et-IPA 570,7 442,7 87 16 60
Tidssegmenter:
Segment Start (min.) End (min.) Type Diverter Delta EMV Polaritet Data, der er lagret
1 0 0,6 MS2 Scan Til affald 0 Negative Nej
2 0,6 2 Mrm Til MS -100 Negative Ja
3 2 4,75 MS2 Scan Til affald 0 Positive Nej
* Kvantifier overgange er fed.

Tabel 5: LC-MS/MS-parametre. Kvantifier produktioner er fed.

Mål Observeret Procent
Id Dag Me-IPA Me-IPA Opsving
QC-1 1 0 Nd Nielsen
QC-2 1 0 Nd Nielsen
QC-11 2 0 Nd Nielsen
QC-12 2 0 Nd Nielsen
QC-21 3 0 Nd Nielsen
QC-22 3 0 Nd Nielsen
QC-31 4 0 Nd Nielsen
QC-32 4 0 Nd Nielsen
QC-3 5 0 Nd Nielsen
QC-4 5 0 Nd Nielsen
QC-13 1 1,25 1,26 101% Ave (10) = 102%
QC-14 1 1,25 1,23 98,40% SD = 3,50%
QC-23 2 1,25 1,26 101% % RSD = 3,40%
QC-24 2 1,25 1,28 102%
QC-33 3 1,29 1,3 101%
QC-34 3 1,29 1,25 96,90%
QC-5 4 1,29 1,37 106%
QC-6 4 1,29 1,41 109%
QC-15 5 1,29 1,3 101%
QC-16 5 1,29 1,34 104%
QC-25 1 30,1 30,2 100% Ave (10) = 103%
QC-26 1 30,1 31,2 104% SD = 1,80%
QC-35 2 30,1 31,1 103% % RSD = 1,70%
QC-36 2 30,1 31,1 103%
QC-7 3 31 31,6 102%
QC-8 3 31 31,4 101%
QC-17 4 31 32,5 105%
QC-18 4 31 32,8 106%
QC-27 5 31 31,7 102%
QC-28 5 31 32,1 104%
QC-37 1 80,2 77,8 97,00% Ave (10) = 101%
QC-38 1 80,2 78,9 98,40% SD = 2,30%
QC-9 2 80,2 81,8 102% % RSD = 2,30%
QC-10 2 80,2 79,8 99,50%
QC-19 3 82,7 83,5 101%
QC-20 3 82,7 84 102%
QC-29 4 82,7 84,7 102%
QC-30 4 82,7 87,2 105%
QC-39 5 82,7 83 100%
QC-40 5 82,7 84,1 102%

Tabel 6: QC resultater for mig-IPA i Mongoose serum (μg/mL).

Target et-IPA (μg/mL) N Middelværdi (%) SD (%) % RSD
0 21
1,3 12 103 4,5 4,3
13 9 91,7 1,4 1,5
32 12 106 2,4 2,3
85 12 105 5,8 5,6
170 9 106 1,1 1,1

Tabel 7: QC resultater for et-IPA i Mongoose serum (μg/mL).

Agn og ethylipa-agn koncentration (μg/mL)
Tidsperiode 0,4%-blister 1,0%-blister 0,14%-matrix Kontrol
Gennemsnit (SD) N Gennemsnit (SD) N Gennemsnit (SD) N Gennemsnit (SD) N
Dag 0 Nd 5 Nd 4 Nd 6 Nd 3
Dag 1 13,7 (10,9) 2 11,2 (10,4) 4 20,6 (17,3) 2 Na Na
Dag 7 11,5 (6,3) 6 9,9 (9,6) 4 21,4 (10,9) 6 Nd 3
Dag 14 10,2 (5,2) 6 5,7 (2,5) 3 17,8 (10,2) 6 Nd 3
Dag 21 8,9 (4,1) 4 10,0 (9,5) 4 23,8 (5,3) 3 Nd 2
Dag 28 8,5 (3,9) 5 11,1 (10,6) 3 17,7 (9,3) 4 Nd 3
Dag 35 17,0 (NA) 1 9,1 (9,0) 4 21,7 (9,3) 2 Nd 1
Dag 42 Na 0 8,4 (8,5) 4 16,5 (NA) 1 Nd 2
Dag 49 10,2 (5,8) 2 8,1 (8,4) 4 17,5 (4,7) 2 Nd 2
Dag 56 10,9 (5,4) 2 3,8 (1,1) 3 17,6 (6,1) 2 Nd 2

Tabel 8: gennemsnitlig (stand afvigelse [SD]) ethyl-IPA serumkoncentration af agn type. ND = ikke detekteret, NA = ikke relevant.

Dosis og methylipa-koncentration (μg/mL)
Tidsperiode 0,04% 0,07% 0,14% Kontrol
Gennemsnit (SD) N Gennemsnit (SD) N Gennemsnit (SD) N Gennemsnit (SD) N
Dag 0 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4
Dag 1 7,8 (7,1) 4 22,2 (9,2) 4 29,1 (16,0) 4 ND (NA) 4
Dag 7 4,4 (4,8) 4 14,4 (4,6) 4 21,3 (12,0) 4 ND (NA) 4
Dag 14 5,7 (5,9) 4 12,0 (3,5) 4 19,6 (10,6) 4 ND (NA) 4
Dag 21 4,9 (4,5) 4 12,0 (0,8) 3 18,3 (9,9) 4 ND (NA) 4
Dag 28 5,4 (5,0) 4 9,8 (2,4) 4 16,4 (8,1) 4 ND (NA) 4

Tabel 9: gennemsnitlig (SD) methyl-IPA-serumkoncentration efter dosis. ND = ikke detekteret, NA = ikke relevant. Alle methylipa koncentrationer blev indarbejdet i den eksterne agn matrix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LC-MS/MS-metoden udviklet til studierne udnyttede selektiviteten af multiple reaktion overvågning til nøjagtigt kvantificere mig-IPA og et-IPA i Mongoose serum. Selektiviteten af MS/MS Detection tillod også en simpel oprydnings protokol, der udelukkende var baseret på acetonitril til at fremskynde proteiner fra serum før analyse.

Iophenoxic syrer er opløselige i ACN, men er praktisk taget uopløselige i vand. For at udelukke vand fra ACN-ekstraktionen blev natriumchlorid tilsat for at gennemtvinge et klart vand: ACN-faseadskillelse ved at forøge den ioniske styrke i den vandige (serum) fase. Den flygtige syre trifluoreddikesyre (TFA) blev også tilsat for at sikre, at iophenoxic-syrer blev protoneret under ekstraktionen og ville være mere let opløseligt i ACN-fasen. TFA fjernes under det tørre trin forud for LC-MS/MS-analyse.

Blod trækker fra Mongoose var ca 1 mL, giver 0,5 mL eller mindre af sera. Til udførelse af replikat analyser af hver prøve blev der krævet en prøve forberedelsesprocedure i mikroskala, som brugte mikrocentrifugerør i stedet for typiske analytiske laboratorieglas, såsom klasse A-Målepipetter og-kolber. For at opnå nøjagtige og præcise resultater er det nødvendigt, at analytikere er dygtige i brugen af glas mikroliter sprøjter og positive-forskydning gentagne pipettorer med mikroliter-size tips.

En begrænsning af denne metode er, at det kræver dyre LC-MS/MS instrumentering og analytikere uddannet i dets anvendelse og vedligeholdelse. Da Me-IPA og et-IPA er baseline-løst ved hjælp af de beskrevne HPLC-betingelser, kunne metoden muligvis tilpasses til en enkelt firpolet LCMS eller HPLC med UV-detektor, forudsat at der ikke blev observeret nogen interferenser.

Forskellen i gennemsnitlige serumkoncentrationer mellem monokser, der forbruges lokkemad med et-IPA i blisterpakningen og agn matrix ved 2,8 mg dosis antyder spild, når markøren er indeholdt i blisterpakningen, snarere end indarbejdet i agn matrix. Dette kan have konsekvenser med henblik på at anslå vaccine i modsætning til indtagelse af agn. For eksempel kan inkorporering af markør i den udvendige agn matrix oppuere skønnet over vaccine dækning, hvis dyret spiser matrixen, men vaccine udslip ud. Reguleringsmæssige restriktioner kan dog udelukke muligheden for at blande en biologisk markør direkte med en vaccine i blisterpakningen. I de tilfælde, hvor < 100% forbrug blev registreret, var der tre tilfælde med loits indeholdende et-IPA i blisterpakningen, hvoraf to var den højeste koncentration på 1%. Dette antyder potentiel smag aversion, når et-IPA er ved højere koncentrationer. Når lokkemad indeholdende 1% (20,0 mg) et-IPA indarbejdet i agn matrix blev tilbudt til mongooses, alle dyr afviste agn.

De gennemsnitlige IPA-koncentrationer for et-og mig-IPA på dag 14 var henholdsvis ca. 17 og 19 μg/mL. Lignende forskning udført på Instituto de Investigación en recursos Cinegéticos, Ciudad Real, Spanien, ved hjælp af butyl og pentyl-IPA fundet dag 14 koncentrationer på ca. 45 og 10 μg/mL i Mongoose sera, når de leveres i samme koncentration og agn formulering som i vores undersøgelse. Disse forskelle tyder på, at forskellige derivater af IPA kan metabolisere med forskellige satser i mongooses, hvilket kan være nyttigt, når markør retention (enten kort eller langsigtet tilbageholdelse) er en bekymring.

Forskelle i fysiologien i mave-tarmsystemet kan påvirke absorptionen og udskillelsen af IPA i forskellige arter. Plasma eliminationshalveringstiden for IPA hos indenlandske katte (Felis catus), når det blev leveret ved 1,5 mg/kg, var 107 dage, hvorimod satsen i brushtail possums med samme dosishastighed var ca. en dag28. Når IPA blev givet til indenlandske geder (Capra aegagrus hircus) med en dosishastighed på 1,5 mg/kg den terminale eliminationshalveringstid af IPA var 81 dage, selv om investigatorerne fortsatte med at finde forhøjede jod koncentrationer op til 160 dage efter administration 39. det gastrointestinale system af medlemmer af Vivveridae (den familie, som mongooses tidligere havde fået tildelt40) er beskrevet som svarende til den indenlandske kat41, som kan forklare retentionstiden for IPA i mongooses. Forskning tyder også på, at IPA kan blive metaboliseret forskelligt i marsupialer, hvilket giver mulighed for hurtigere udskillelse end hos de eutheriske arter29.

Begge derivater af IPA evalueret i denne undersøgelse leverede langsigtede (4 − 8 uger) mærkning evne i mongooses. Anvendelsen af IPA som en biologisk markør i monokser bør tage hensyn til undersøgelsens mål og den ønskede varighed af mærkningen. I tilfælde, hvor dyr skal mærkes fra de samme forsøgssteder i sammenhængende perioder, kan forskellige derivater af IPA anvendes til at sikre, at resultaterne fra én mærknings begivenhed ikke forveksles ved mærkning under tidligere begivenheder. Som en del af operationelle ORV for dyreliv i USA, udtages prøver af målarter og testning for tilstedeværelsen af RVNA og biomarkør typisk 4 − 6 uger efter ORV distribution42. Fra et praktisk synspunkt, ser det enten et-eller mig-IPA kan let påvises i denne periode. Fremtidig forskning for at evaluere rest nedbrydningsfunktionen i mongooses tilbød forskellige koncentrationer af begge kongenere af IPA evalueret i denne undersøgelse ville være nyttigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere AV og så er fuldtidsbeskæftigede af en oral rabiesvaccine agn producent.

Acknowledgments

Denne forskning blev delvis støttet af det amerikanske ministerium for landbrug, dyre-og plantesundheds inspektionstjeneste, Wildlife Services, nationale rabies Management program og IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Tyskland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
  2. Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
  3. Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
  4. Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
  5. Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
  6. Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
  7. Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
  8. Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
  9. Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
  10. Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
  11. Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
  12. de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
  13. Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
  14. Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
  15. Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
  16. Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
  17. Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
  18. Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
  19. Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
  20. Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
  21. Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  22. Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. Shumake, S. A., Bullard, R. W. , American Society for Testing and Materials. Philadelphia. 5th Volume. STP 974 141-147 (1987).
  23. Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
  24. Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
  25. Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
  26. Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
  27. Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
  28. Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
  29. Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
  30. Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
  31. Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
  32. Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
  33. Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
  34. Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
  35. Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
  36. Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
  37. Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
  38. Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
  39. Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
  40. Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. Mongooses: their natural history. , Oliver and Boyd. Edinburgh and London. (1967).
  41. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
  42. National Rabies Management Program (NRMP). Oral rabies vaccination draft operations manual. , USDA APHIS Wildlife Services. (2009).

Tags

Immunologi og infektion biologisk markør Herpestes auropunktatus iophenoxic Acid rabies lille indisk MONGOOSE LC-MS/MS
Analyse af Iophenoxic Acid analoger i små indiske Mongoose (<em>Herpestes Auropunktatus</em>) sera til brug som en oral rabies vaccination biologisk markør
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter