Summary
우리는 에틸 또는 메틸 이오페노산과 함께 포로 몽구스 위약 경용 광견병 백신 미끼를 바이오마커로 제공하고 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 사용한 새로운 액체 크로마토그래피를 사용하여 미끼 섭취를 검증했습니다.
Abstract
작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코에서 광견병 바이러스 (RABV)의 저수지이며 매년보고되는 동물 광견병 사례의 70 % 이상을 포함합니다. 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략에 의해 수행됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 구강 광견병 백신 및 몽구스를 위한 각종 미끼 모형에 대한 연구는 유망한 결과로 실시되었습니다. ORV의 성공을 모니터링하는 것은 일반적으로 RABV 중화 항체 (RVNA) 포스트 예방 접종의 변화를 평가하는 것을 포함하는 표적 종에 의하여 미끼 섭취를 추정에 의존합니다. 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RABV가 Enzootic 및 RVNA의 배경 수준이 저수지 종에 존재하는 지역에서 해석하기 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, 백신 또는 미끼 매트릭스와 통합된 바이오마커가 유용할 수 있다. 우리는 미끼 내부0.4 %와 1 %의 농도에서 에틸 이오페노산 (et-IPA)을 함유 한 16 개의 포로 몽구스 위약 ORV 미끼를 외부 미끼 매트릭스에서 제공했습니다. 우리는 또한 외부 미끼 매트릭스에서 0.035 %, 0.07 %, 0.14 %의 농도로 메틸 - 이오페노산 (me-IPA)을 함유 한 12 개의 포로 몽구스 ORV 미끼를 제공했습니다. 우리는 미끼 제공 하기 전에 혈 청 샘플을 수집 하 고 최대 8 주 포스트 제공에 대 한 다음 매주. 우리는 혈청에서 아세토니트릴로 이오페노산산을 추출하고 액체 크로마토그래피/질량 분석법을 사용하여 정량화했습니다. 우리는 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 et-IPA 또는 me-IPA에 대한 세라를 분석했습니다. 우리는 et-me-IPA에 대해 적어도 8 주와 4 주 동안 적절한 마킹 능력을 발견했습니다. 두 IPA 유도체 모두 몽구스에서 ORV 미끼 섭취량의 현장 평가에 적합할 수 있다. 몽구스 세라에서 마커의 수명으로 인해 연속 평가 중에 동일한 IPA 유도체를 사용하여 결과를 혼동하지 않도록 주의해야 합니다.
Introduction
광견병 바이러스(RABV)는 부정적 감각의 단일 좌초 된 lyssavirus이며, 카니보라와 치옵테라 의 주문 내에서 다양한 야생 동물 저수지 종 들 사이에서 순환한다. 몽구스의 여러 종은 RABV의 저수지이며, 작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코와 서반구 1,2,3의 다른 카리브 해 제도에서 유일한 저수지입니다 . 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략을 통해 수행됩니다. 미국(미국)에서는 이 관리 활동이 USDA/APHIS/야생 동물 서비스 국립 광견병 관리프로그램(NRMP) 4에 의해 조정됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 광견병 백신및 몽구스를 위한 다양한 미끼 종류에 대한 연구는 몽구스를 위한 ORV 프로그램이가능하다는 것을 시사하는 유망한 결과로 실시되어 5,6,7,8.
ORV의 충격을 감시하는 것은 일반적으로 RV 항체 혈청증에 있는 변경을 평가하는 관련시키는 표적 종에 의하여 미끼 옥천을 추정에 의존합니다. 그러나, 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RV가 RABV 중화 항체 (RVNA)의 enzootic 및 배경 수준이 저수지 종에서 존재하는 지역에서 도전적일 수 있습니다. 이러한 상황에서, 미끼 또는 외부 미끼 매트릭스에 포함된 바이오마커가 유용할 수 있다.
다양한 생물학적 마커는 너구리(프로시온 로터)9,10,stoats (무스텔라에르민)11,12,유럽 오소리 등 수많은 종에서 미끼 섭취를 모니터링하는 데 사용되어 왔다. 멜레스 멜레스) 13,멧돼지(수스 스크로파)14,작은 인도 몽구스15 및 대초원 개 (Cynomysludovicianus)16,17,다른 사람의 사이에서. 미국에서, 수술 ORV 미끼는 종종 미끼 매트릭스에서 1% 테트라사이클린 바이오마커를 포함하여 미끼 흡기18,19를모니터링한다. 그러나, 테트라사이클린의 사용에 대한 단점은 환경에 항생제의 분포에 대한 우려가 증가하고 테트라 사이클린의 검출이 일반적으로 침략적이라는 것을 포함, 뼈를 얻기 위해 동물의 치아 추출 또는 파괴를 요구 샘플20. 로다민 B는 다양한 조직에서 마커로 평가되어 왔으며 모발 및 수염10,21에서자외선(UV) 빛및 형광을 이용하여 검출될 수 있다.
이오페노산(IPA)은 코요테(Canis latrans)에서 미끼 소비를 평가하는 데사용되어 온백색, 결정성 분말로, 북극여우(Vulpeslagopus)23,붉은 여우(Vulpesvulpes)24,너구리 9개 , 25,멧돼지14,붉은 사슴 (세르부스elaphus scoticus)26,유럽 오소리12 및 페렛 (M.furo)27,다른 여러 포유류 종 중. IPA의 체류시간은 종에 따라 2주 미만의 28,29,26주 이상, 26주 이상 국내견(Canislupusfamiliaris)에서 52주 이상이다. 보존 시간은 또한 용량 의존적 일 수있다31. 이오페녹산은 혈청 알부민에 강하게 결합하고 역사적으로 혈중 요오드 수치32를측정하여 검출되었다. 이러한 간접접근법은 UV 검출33을통해 이오페노산 농도를 직접 측정하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에 의해 대체되었고, 결국 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법(LCMS)으로 대체되었습니다. 34,35. 이 연구를 위해, 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 이용한 매우 민감하고 선택적인 액체 크로마토그래피가 개발되어 다중 반응 모니터링(MRM)을 활용하여 이오페노산의 두 가지 유사체를 정량화합니다. 우리의 목표는 2-(3-하이드록시-2,4,6-triiodobenzyl) 프로파노산(메틸-IPA 또는 me-IPA) 및 2-(3-하이드록시-2,4,6-트리오도벤실)부타노산(에틸-IPA 또는 IPA 에서 전달될 때)의 마킹 능력을 평가하기 위해 이 LC-MS/MS 방법을 사용하는 것이었습니다. 포로 몽구스에게 미끼를.
몽구스는 시판되는 훈제 소시지와 생선 기름으로 미끼를 찍은 케이지 트랩에서 라이브 포획되었습니다. 몽구스는 개별 60 cm x 60cm x 40cm 스테인레스 스틸 케이지에 보관하고 시판되는 닭 허벅지로 일주일에 두 번 보충된 상업용 건식 고양이 사료를 매일 50g씩 먹였습니다. 물은 사용할 수 있는 광고 libitum. 우리는 위약 ORV 미끼에 포로 몽구스에 IPA, 에틸-IPA와 메틸-IPA의 두 가지 유도체를 전달했다. 모든 미끼는 분말 닭 계란및 젤라틴(재료표)을 함유하는 외부 코팅(이하 "미끼 매트릭스")을 가진 28 mmx 20 mm x 9 mm 호일 블리스터 팩으로 구성되었다. 미끼는 0.7 mL의 물 또는 IPA 유도체를 포함하고 약 3 g의 무게를 가했으며, 그 중 ~2 g은 외부 미끼 매트릭스였다.
우리는 3 개의 농도에서 16 포로 몽구스 et-IPA를 제공: 0.14% (2.8 mg et-IPA ~ 2 g 미끼 매트릭스; 3 남성 [m], 3 여성 [f]), 0.4 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 2.8 mg et-IPA, 3m, 3f), 및 1.0 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 7.0 mg 에틸-IPA; 2m , 2f). 의 전반적인 복용량 2.8 mg의 복용량 속도에 해당 5 mg/kg27,36 푸에르토리코에서 560 g의 평균 몽구스 무게에 따라. 우리는 연구가 일부 바이오 마커에 대한 맛 혐오가 일부 종37에서 농도 >1%에서 발생할 수 있음을 시사하는 가장 높은 농도로 1 %를 선택했습니다. 우리는 블리스터 팩에서 1% 용량만 제공했는데, 응집은 용매에서 용해되는 용질이 미끼 매트릭스에 균등하게 통합될 만큼 충분히 용해되는 것을 방지하였다. 1개의 대조군 (2m, 1f)은 멸균수와 IPA가 없는 미끼를 받았다. 우리는 아침 (~8 시)에 매일 유지 보수 배급을 먹이기 전에 몽구스에게 미끼를 제공했습니다. 미끼는 약 24시간 후에 제거되었다. 우리는 치료 전에 혈액 샘플을 수집, 하루 후 치료 후 다음 매주 최대 8 주 후 치료. 우리는 이소플루란 가스를 흡입하여 몽구스를 마취시키고 페렛38에대해 설명된 바와 같이 두개골 정맥의 정맥에 의해 전혈의 1.0 mL까지 수집했다. 우리는 전혈 샘플을 원심 분리하고, 혈청을 극저온으로 옮기고 분석할 때까지 -80°C에서 저장했습니다. 모든 동물은 동물의 건강에 반복 혈액 무승부의 영향을 최소화하기 위해 모든 기간 동안 샘플링되지 않았습니다. 대조군 동물을 0일째에 샘플링한 다음, 매주 최대 8주 동안 치료 후 샘플링하였다.
우리는 3 개의 농도에서 me-IPA를 전달: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) 그리고 0.14% (2.8 mg), 모든 미끼 매트릭스에 통합, 와 함께 2 남성과 2 치료 그룹 당 여성. 두 남성과 두 여성은 멸균 물과 IPA로 가득 미끼를 받았다. 미끼 제공 시간과 몽구스 마취는 위에서 설명합니다. 우리는 1 일째에 치료 전에 혈액 샘플을 수집한 다음 매주 최대 4 주까지 치료 후.
우리는 정상성에 대한 혈청 농도 데이터를 테스트하고 다른 치료 그룹의 혈청 IPA 농도에 대한 추정 수단. 우리는 선형 혼합 모델을 사용하여 개인에 걸쳐 풀린 평균 혈청 et-IPA 농도를 비교했습니다. 미끼 유형(매트릭스/블리스터 팩)은 실험일 이외에 고정된 효과가었으며, 동물 ID는 무작위 효과였습니다. 모든 프로시저는 공통 통계소프트웨어(자료표)를사용하여 실행되었고 유의성은 α =0.05로 평가하였다.
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Protocol
모든 절차는 승인 된 연구 프로토콜 QA-2597에 따라 USDA 국립 야생 동물 연구 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 다음 프로토콜은 몽구스 혈청에서 메틸-이오페노산검출분석 절차를 기술한다. 이 방법은 몽구스 혈청에서 에틸 이오페노산의 분석으로 시작된 반복 과정의 최종 버전입니다. 에틸-이오페노산의 초기 평가 동안 사소한 변형이 이 방법들을 수정하였고, 그 결과 아래에 제시된 최종 프로토콜이 생성되었다. 대표적인 결과에는 두 반복 모두에서 얻은 결과가 포함됩니다.
1. 솔루션 및 표준 준비
- me-IPA 및 ET-IPA를 구입하십시오.
- 이월 A의 경우, 1 mL의 포름산과 1L의 초순수(≥ 18 MΩ)를 결합하여 물에 0.1%(v/v) 포름산 1L을 준비합니다. 이월 B의 경우, 1mL의 포름산을 ACN 1L과 결합하여 아세토니트릴(ACN)에 0.1% (v/v) 포름산 1L을 준비합니다.
- 희석제의 경우, TFA 1mL과 ACN 200 mL을 결합하여 ACN에서 0.5% (v/v) 삼중불소산(TFA)의 200 mL를 준비합니다.
- 약 1,000 μg/mL의 농도로 ACN에서 me-IPA 및 et-IPA의 농축 IPA 재고 솔루션을 준비합니다.
- 마이크로 저울에 me-IPA의 대략 10 mg을 무게하고 질량을 ± 0.0001 mg. 정량적으로 45 mL ACN을 사용하여 10 mL 클래스 A 체적 플라스크로 me-IPA를 전송한다. 모든 고체를 용해시키기 위해 1 분 초음파 처리한 다음 ACN으로 볼륨을 가져옵니다.
- 각 스톡의 ~8 mL을 폴리 테트라플루오로에틸렌(PTFE) 라이닝 캡이 있는 호박색 8 mL 유리 병으로 옮니다. 실온(RT)으로 보관하십시오. 남은 재고를 유해 폐기물로 옮김.
- 25x-7 me-IPA 스톡(표 1)의 경우 약 200 μg/mL로 ACN에서 me-IPA 주식을 준비합니다. 예: 1,000 μL 유리 주사기를 사용하여 me-IPA 농축 스톡의 1 mL을 단계 1.4.2에서 5 mL Class A 체적 플라스크로 옮김. ACN으로 부피를 희석하십시오. PTFE 라이닝 캡으로 호박색 8mL 유리 병으로 재고를 옮김을 옮김. RT에 보관하십시오.
- 표1에 설명된 6개의 추가 25x me-IPA 주식을 준비합니다. 각 스톡에 대해, 반복 피펫터를 사용하여 표시된 볼륨을 호박색 8mL 호박색 유리 병과 PTFE 라이닝 캡으로 결합합니다. 각 재고를 RT에 보관하십시오.
- 25x 대리 주식의 경우, 1.4.2단계에서 제조된 농축 재고로부터 약 10 μg/mL로 ACN에서 me-IPA의 대리 주식을 준비합니다. 농축 된 me-IPA 스톡의 0.100 mL을 100 μL 유리 주사기를 사용하여 10 mL Class A 체적 플라스크로 옮은 다음 ACN으로 부피를 희석합니다.
- PTFE 라이닝 캡으로 ~8 mL를 호박색 8mL 유리 병으로 옮김. RT에 보관하십시오.
- 표2에 설명된 바와 같이 2 mL 스크류 탑 유리 자동 샘플러 바이알에 두 가지 매질이 모두 포함된 4x 주식을 준비합니다.
- 예를 들어, 스톡 4x-7을 2mL 바이알에 준비하려면 0.5 mL 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 1.5단계에서 25x-7 me-IPA 스톡의 0.20 mL를 추가합니다. 0.5 mL 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 1.7 단계에서 25x 서로게이트 et-IPA 스톡의 0.20 mL를 추가합니다.
- 1mL 용량 팁이 있는 반복 피펫터를 사용하여 0.85 mL의 ACN을 추가합니다. 바이알을 단단히 캡으로 고정하고 5배 뒤집어 섞어보입니다.
- 표3에 설명된 대로 2mL 스크류 탑 자동 샘플러 바이알로 표준 곡선을 준비합니다.
- 예를 들어, 표준 7(Std 7)을 2mL 바이알에 준비하려면 0.5mL 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 단계 1.8.2에서 4x-7 스톡의 0.20 mL를 추가합니다. 1 mL 용량 팁의 반복 파이펫터를 사용하여 0.60 mL의 초순수 DI 물을 추가하십시오. 바이알을 단단히 캡으로 고정하고 5배 뒤집어 섞어보입니다.
2. 견본 준비
주의: 이 절차를 수행하는 직원은 광견병 사전 노출 예방의 전체 시리즈를 수신하고 연방 직업 보건 지정 의료 시설에서 0.5 IU 이상의 문서화 된 광견병 항체 역가가 있어야합니다. 직원은 추출을 수행하는 동안 항상 실험실 코트와 눈 보호를 착용해야합니다. 주의: 클래스 II 생체 안전 성 캐비닛에서 단계 2.3-2.6을 수행하십시오.
- 각 샘플에 대해 200-300 mg의 NaCl.를 포함하는 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 80 위치 플라스틱 랙에 튜브를 준비합니다. 2.6단계에서 사용할 수 있습니다.
참고: 많은 수의 시료에 마이크로 스쿱(또는 기타 소형 측정 장치)을 권장합니다. - 각 샘플에 대해 두 개의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 "A"로, 다른 하나는 "B"로 라벨을 붙입니다. 튜브를 80위치 플라스틱 랙에 배치합니다.
- 클래스 II 생물 안전 성 캐비닛에 혈청 추출에 필요한 다음 재료와 장비를 배치 : 단계 2.1 및 2.2단계로 제조 된 미세 원심 분리튜브 (랙내), 와류 믹서, 0.5 mL 및 5 mL 용량 팁이있는 반복 파이펫터, 100-1,000 μL 공기 변위 1,000 μL 팁이 있는 파이펫, 희석제 및 초순수 DI 물 각각 약 100mL의 용기, 생물학적 위험 폐기물 용기.
- 냉동 보관에서 세럼 샘플을 제거하고 생체 안전 성 캐비닛에서 RT로 따뜻하게하십시오. 소용돌이는 샘플링 전에 각 혈청 샘플을 혼합합니다.
- 0.5 mL 용량 팁의 반복 피펫을 사용하여 0.050 mL의 몽구스 혈청을 튜브 "A"에 분배하고 25x 대리 스톡의 0.050 mL를 추가합니다. 그런 다음 5 mL 용량 팁이있는 반복 피펫을 사용하여 튜브 "A"에 희석제 0.950 mL을 추가합니다. 캡을 단단히 고정하고 10-15 s용 와류 믹스.
- 2.1단계에서 미리 계량된 NaCl을 튜브 "A"로 분배하고 8-12s용 와류 믹스 3x를 분배합니다.
참고: 이제 샘플 랙을 클래스 II 생체 안전 캐비닛에서 제거할 수 있습니다. - 12,000 x g에서 1분 동안 원심분리튜브 "A"를 수성 및 ACN 상을 분리한다. 100-1,000 μL 공기 변위 파이펫을 사용하여 상부 ACN 상에서 "B"를 튜브로 0.80 mL. 남은 용액을 튜브 "A"로 유해 폐기물로 옮기고 바이오 유해 폐기물 용기에 빈 튜브를 폐기하십시오.
- 45°C 수조에서 N2 가스의 완만한 흐름으로 튜브 "B"에서 ACN 및 TFA를 제거합니다.
- 반복 피펫터를 사용하여 튜브 "B"에 0.250 mL의 ACN을 추가하고, 4-5 s에 대한 소용돌이 혼합물을 넣고 12,000 x g에서 잠시 원심 분리 (2−4 s)하여 튜브 바닥에 액체를 수집합니다.
- 5 mL 용량 팁이있는 반복 파이프터를 사용하여 튜브 "B"에 0.750 mL의 초순수 DI 물을 추가하고, 4-5 s의 소용돌이 혼합물을 한 다음 12,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 사용하여 샘플을 명확히합니다.
- 1,000 μL 공기 변위 파이펫을 사용하여 상급기의 0.75 mL를 자동 샘플러 바이알로 옮김. 생물학적 위험 폐기물 용기에 파이펫 팁을 버리십시오.
- 캡 자동 샘플러 바이알을 안전하게 분석하고 LC-MS/MS(섹션 4)로 분석합니다. 남은 용액을 튜브 "B"로 유해 폐기물로 옮기고 빈 튜브를 바이오 유해 폐기물 용기로 폐기하십시오. 모든 생물학적 유해 폐기물은 오토클레이브 또는 소각을 통해 폐기하십시오.
3. 품질 관리 샘플
주의: 섹션 2에 설명된 주의 문구를 따르십시오.
참고: 다음 절차에서는 분석에 필요한 최소 품질 관리(QC) 샘플 수를 설명합니다. 충분한 제어 몽구스 혈청을 사용할 수있는 경우 각 수준에서 복제하는 것이 좋습니다.
- NaCl 200-300 mg을 함유한 4개의 1.5 mL 미세원원지 튜브를 준비합니다. 튜브를 80위치 플라스틱 랙에 배치합니다.
- 각 QC 샘플에 대해 두 개의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 "A"로, 다른 하나는 "B"로 라벨을 붙입니다. 튜브를 80위치 플라스틱 랙에 배치합니다.
- 2.3단계를 반복합니다.
- 냉동 보관에서 제어 몽구스 세럼을 제거하고 생체 안전 성 캐비닛에서 RT로 따뜻하게하십시오. 소용돌이는 샘플링 전에 대조군 혈청을 혼합한다.
- 0.050 mL의 제어 몽구스 세럼을 0.5 mL 용량 팁의 반복 피펫을 사용하여 4 개의 1.5 mL "A" 튜브에 분배합니다.
- 0.5 mL 용량 팁이 있는 반복 파이펫터를 사용하여 표 4에 명시된 4개의 QC 샘플 각각을 인증합니다. 각 QC 샘플을 단단히 캡하고 10-15 s용 와류 혼합물을 캡합니다.
- 단계 2.6-2.12에 설명된 대로 추출 절차를 수행합니다.
4. LC-MS/MS 분석
- 표5에 설명된 모든 매개 변수로 LC-MS/MS를 구성합니다. LC-MS/MS의 전원을 켜고 유량을 0.800mL/min로 설정하기 전에 컬럼이 70°C에 도달할 수 있도록 합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어(재료 표)에서 시퀀스를 설정하여 품질 관리 샘플 및 알 수 없는 샘플로 구성된 각 배치 전후에 표준 곡선을 주입합니다.
- 표 5에 나열된 매개 변수를 사용하여 모든 표준 및 샘플을 주입하고 MRM 이온 크로마토그램을 획득합니다.
- 시퀀스 완료 후 LC-MS/MS를 끄고 모든 자동 샘플러 바이알을 유해 폐기물로 폐기하십시오.
5. 정량화
- 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 et-IPA를 내부 표준으로 사용하여 me-IPA에 대한 상대 적 응답과 상대 농도의 교정 곡선을 생성합니다. me-IPA에 대한 정량자 MRM 전이로부터 상대적 응답을 계산(556.6 → 428.7) et-IPA에 대한 MRM 전이(570.7 → 442.7)로 나눈 값. 1/x에 가중치가 가중되고 원점을 무시하는 2차 이차 함수를 사용하여 7레벨 교정 곡선을 구성합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 me-IPA의 혈청 농도(C혈청)를계산합니다.
여기서c계는 μg/mL 단위로 교정 곡선에서 계측기에서 계측기에서 결정되는 농도,
1.25는 희석 인자, V파이널은 최종 시료 부피(1.0 mL) 및 V혈청은 mL(mL)의 혈청 부피( 0.050 mL 명목).
1.25는 희석 인자, V파이널은 최종 시료 부피(1.0 mL) 및 V혈청은 mL(mL)의 혈청 부피( 0.050 mL 명목).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
me-IPA 분석에서 대표적인 이온 크로마토그램은 그림1에 제시되어 있다. 대조군 몽구스 혈청(도1A)은지시된 보존 시간에 et-IPA(대리 analyte)의 보존 시간 및 me-IPA의 부재를 도시한다. 품질 관리 샘플(그림1B)은me-IPA에 대한 정량자 및 한정자 전환뿐만 아니라 et-IPA로부터 의 me-IPA의 기준선 분리를 도시한다. 도 1C는 33.5 μg/mL me-IPA의 관찰된 혈청 농도를 가진 연구에서 대표적인 샘플을 나타낸다.
me-IPA 분석의 대표적인 교정 곡선은 그림2에 나와 있습니다. 7레벨, 14포인트 표준 곡선범위는 0.00202에서 8.27 μg/mL me-IPA로 상관계수(r2)가 0.9998입니다. 상관 계수는 5개의 me-IPA 분석에 대해 0.9998에서 0.99997까지 다양했습니다. 대리 측정기 et-IPA 농도는 모든 표준에서 0.502 μg/mL이었다.
표 6은 0, 1.3, 31 및 82 μg/mL me-IPA(각 레벨에서 n = 10)로 강화된 제어 몽구스 혈청에 대한 정확도 및 정밀도 결과를 제시합니다. 결과는 5개의 별도 분석으로부터 수집되었다. 회수율의 범위는 96.9%에서 109%로 증가했습니다. 세 가지 요새 수준에서 퍼센트 상대 표준 편차 (% RSD)는 각각 3.4 %, 1.7 %, 2.3 %였다.
품질 관리 샘플에서 관찰된 신호 대 잡음 비(S/N)(n = 10음축 제어, n=10 at 1.3 μg/mL me-IPA)를 사용하여 검출 한계(DL; 3 x S/N) 및 정량 한계(QL; 10 x S/N)를 결정했습니다. 몽구스 혈청내의 me-IPA에 대한 DL 및 QL은 각각 0.012 μg/mL 및 0.042 μg/mL이었다.
한정자 MRM 전이의 피크 영역 응답은 수량자 MRM 전이(모든
표준 및 샘플에 대해 계산하였다) 각 샘플에 대한 이 비율을 캘리브레이션 표준에서 관찰된 평균 비율로 나누어 한정자 백분율 일치를 결정하였다. 도 1C에 도시된 샘플에 대한 한정자 비율은 0.439였고, 96.3%의 일치율을 보였다.
et-IPA 대리 아말립산의 회수는 교정 표준에서 관찰된 평균 et-IPA 피크 영역 응답으로 et-IPA 피크 영역 반응을 나누어 모든 QC 샘플 및 알려지지 않은 샘플에 대해 계산하였다. 평균 대리 분석기 회수는 91.0%(네거티브 컨트롤), 91.4%(1.3 μg/mL), 92.8%(31μg/mL), 95.4%(82μg/mL)였습니다.
me-IPA의 정량체 또는 한정자 전이에 대한 간섭 피크는 제어 몽구스 혈청에서 관찰되었다(도1A).
몽구스 혈청에서 et-IPA를 결정하는 데 사용되는 추출 절차 및 기악 조건(도3 및 표7)은 me-IPA 방법과 동일하지만, 다음과 같은 변경이 있었다. 프로필-이오페노산(pr-IPA)을 대리 성 아말란제로서 사용하였고, 더 오래되고 덜 민감한 LC-MS/MS를 사용하였다. 소스 건조 가스 온도는 12 L/min의 유동및 35 psi의 분무기 압력으로 350°C였다. 모세관 전압은 -2,500 V였습니다. 소스에는 칼집 가스또는 노즐 전압을 조정하는 수단이 없었습니다. et-IPA에 대한 정량자 MRM 전이는 570.7 → 442.8 (pr-IPA의 경우 584.7 → 456.8)이었다. 파편은 80 V이고 충돌 에너지는 두 세포모두에 대해 10V였습니다. et-IPA에 대한 한정자 MRM은 570.7 → 126.8, 40 V의 충돌 에너지였다.
et-IPA에 대한 모든 몽구스 혈청 샘플의 시험은 8개 이상의 분석을 수행하였다. 7레벨 교정 곡선의 범위는 0.00207에서 8.48μg/mL로 상관계수(r2)는 0.9990에서 0.9999사이입니다. 대리 측정pr-IPA 농도는 0.512 μg/mL이었다. 표 7은 0, 1.3, 13, 32, 85 및 170 μg/mL me-IPA로 강화된 제어 몽구스 혈청에 대한 정확도 및 정밀도 결과를 제시합니다. 결과는 8개의 개별적인 분석으로부터 수집되었다. 회수율의 범위는 89.5%에서 115%로 증가했습니다. 5개 요새 수준에서 의 %RSD는 각각 4.3 %, 1.5 %, 2.3 %, 5.6 %, 1.1 %였다. 품질 관리 샘플에서 관찰된 S/N(n=21 네거티브 컨트롤, n=21 에서 1.3 μg/mL me-IPA)을 DL 및 QL을 결정하는데 사용되었다. 몽구스 혈청내me-IPA에 대한 DL 및 QL은 각각 0.12 μg/mL 및 0.42 μg/mL이었다. 품질 관리 샘플로부터의 평균 대리 타액 회수는 86.8%(n =75)였습니다. et-IPA의 정량체 또는 한정자 전이에 대한 간섭 피크는 제어 몽구스 혈청에서 관찰되지 않았다.
모든 몽구스는 et-IPA 미끼를 24시간 시간 제약 내에서 미끼의 ≥25%를 소비하고 그들의 세라에서 et-IPA의 정량화 가능한 수준을 가졌다(표 8). 혼합 모델 분석에서, 전체 평균 혈청 IPA 농도는 블리스터 팩 (9.8 μg / mL, 95 % CI 4.0.6g / 6g)에 비해 미끼 매트릭스 (17.5 μg / mL, 95 % CI 11.7-23.3 μg / mL)에서 바이오 마커의 2.8 mg을 가진 미끼에서 약간 더 높았습니다. , P = 0.07). 실험일마다 부패한 두 미끼 유형에 대한 농도(β = -0.15±0.04, F = 14.4, P = 0.0005). 혈청 IPA 농도에서의 개별 수준 가변성이 관찰되었다(동물 ID 공분산 파라미터 추정 = 46.6±20.7). 모든 몽구스는 빈 호일 블리스터 팩만 남은 상태에서 100%의 제어 미끼를 소비했습니다. 혈청 내의 et-IPA 잔류물의 평균 농도는 기간에 의해 가변적이었으며 시간이지남에 따라 일관되게 감소하지 않은 것으로 나타났다(도 3).
모든 몽구스는 24시간 시간 제한 내에서 미끼의 ≥ 25%를 소비하고 그들의 세라에서 me-IPA의 정량화가능한 수준을 가졌다(표 9). 몽구스 세라에서 et-me-IPA의 평균 혈청학적 농도는 미끼에서 IPA의 농도에 의존하는 것으로 나타났다. 미끼에 IPA의 높은 농도 전체 복용량 (2.8 et-IPA의 경우 mg) 동일 하 게 유지 하는 경우에 더 높은 혈 청 잔류물 귀착되었다. 흥미롭게도, me-IPA는 1일째에 초기 스파이크와 함께 시간이 지남에 따라 더욱 균일한 저하 패턴을 생성하는 것으로 나타났으며,14일째까지 농도가 고원에 나타난 14일까지 꾸준히 감소했습니다(그림 4).
그림 1 : 대표 이온 크로마토그램. (A) 대리 성 액틸-이오페노산(et-IPA)으로 강화된 제어 몽구스 혈청의 대표적인 MRM 이온 크로마토그램. 화살표는 메틸-이오페노산(me-IPA)에 대한 체류 시간을 나타낸다. (B) 31 μg/mL me-IPA로 강화된 제어 몽구스 혈청의 대표적인 MRM 이온 크로마토그램. me-IPA에 대한 수량자(퀀트) 및 한정자(Qual) 전환의 상대적 강도가 도시됩니다. (C) 33.5 μg/mL의 관찰된 me-IPA 농도를 가진 몽구스 혈청 샘플의 대표적인 MRM 이온 크로마토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 대표적인 보정 곡선. 메틸-이오페노산(me-IPA)에 대한 데이터 분석 소프트웨어에 의해 생성된 원래의 교정 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 시간 지남에 따라 미끼 유형 및 농도에 의한 평균 혈청 에틸 IPA(et-IPA) 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 시간이 지남에 따라 미끼 농도에 의한 혈청 메틸 IPA(me-IPA) 농도를 평균합니다. 모든 me-IPA 농도는 외부 미끼 매트릭스내로 통합되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| me-IPA 농도 (μg/mL) | ||
| 자료 | ||
| 25x-7 | 1.6단계 참조 | 200개 |
| 25x-6 | 1.000 mL 25x-7 스톡과 3.000 mL ACN 결합 | 50개 |
| 25x-5 | 1.000 mL 25x-6 스톡과 3.000 mL ACN 결합 | 13세 |
| 25x-4 | 1.000 mL 25x-5 스톡과 3.000 mL ACN 결합 | 3.1 |
| 25x-3 | 1.000 mL 25x-4 스톡과 3.000 mL ACN 결합 | 0.78 |
| 25x-2 | 1.000 mL 25x-3 스톡과 3.000 mL ACN 결합 | 0.2 |
| 25x-1 | 1.000 mL 25x-2 재고와 3.000 mL ACN 결합 | 0.049 |
표 1: ACN에서 25배 me-IPA 주식 준비(8mL 앰버 글래스 바이알).
| 농도(μg/mL) | |||
| 자료 | 나-IPA | 에 IPA | |
| 4x-7 | 0.200 mL 25x-7 + 0.200 mL 25x 대리 + 0.850 mL ACN | 32세 | 1.6 |
| 4x-6 | 0.200 mL 25x-6 + 0.200 mL 25x 대리 + 0.850 mL ACN | 8개 | 1.6 |
| 4x-5 | 0.200 mL 25x-5 + 0.200 mL 25x 대리 + 0.850 mL ACN | 2개 | 1.6 |
| 4x-4 | 0.200 mL 25x-4 + 0.200 mL 25x 대리 + 0.850 mL ACN | 0.5 | 1.6 |
| 4x-3 | 0.200 mL 25x-3 + 0.200 mL 25x 대리 + 0.850 mL ACN | 0.12 | 1.6 |
| 4x-2 | 0.200 mL 25x-2 + 0.200 mL 25x 대리 + 0.850 mL ACN | 0.031 | 1.6 |
| 4x-1 | 0.200 mL 25x-1 + 0.200 mL 25x 대리 + 0.850 mL ACN | 0.008 | 1.6 |
| 4x-0 | 0.200 mL 25x 서로게이트 + 1.050 mL ACN | 0 | 1.6 |
표 2: ACN에서 4x IPA 주식 준비(2mL 자동 샘플러 바이알).
| 농도(μg/mL) | |||
| 자료 | 나-IPA | 에 IPA | |
| Std 7 | 0.200 mL 4x-7 + 0.600 mL DI 물 | 8개 | 0.4 |
| Std 6 | 0.200 mL 4x-6 + 0.600 mL DI 물 | 2개 | 0.4 |
| Std 5 | 0.200 mL 4x-5 + 0.600 mL DI 물 | 0.5 | 0.4 |
| Std 4 | 0.200 mL 4x-4 + 0.600 mL DI 물 | 0.13 | 0.4 |
| Std 3 | 0.200 mL 4x-3 + 0.600 mL DI 물 | 0.03 | 0.4 |
| Std 2 | 0.200 mL 4x-2 + 0.600 mL DI 물 | 0.0078 | 0.4 |
| Std 1 | 0.200 mL 4x-1 + 0.600 mL DI 물 | 0.002 | 0.4 |
| Std 0 | 0.200 mL 4x-0 + 0.600 mL DI 물 | 0 | 0.4 |
| 빈 | 0.200 mL ACN + 0.600 mL DI 물 | 0 | 0 |
표 3: 75/25 물/ACN(2mL 자동 샘플러 바이알)에서 me-IPA 표준 준비.
| 혈청의 농도 (μg / mL) | |||
| 자료 | 나-IPA | 에 IPA | |
| 네거티브 컨트롤 | 0.050 mL 25x 서로게이트 + 0.950 mL 희석제 | 0 | 10개 |
| 낮은 요새화 | 0.050 mL 25x 대리 + 0.020 mL 25x-4 + 0.930 mL 희석제 | 1.2 | 10개 |
| 미드 요새화 | 0.050 mL 25x 대리 + 0.030 mL 25x-6 + 0.920 mL 희석제 | 30개 | 10개 |
| 높은 요새화 | 0.050 mL 25x 대리 + 0.020 mL 25x-7 + 0.930 mL 희석제 | 80 | 10개 |
표 4: 품질 관리 샘플 강화 (1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 준비).
| 액체 크로마토그래피: | |||||||||||||||||||||
| 열: | C18, 2.1 x 50mm, 2.5 μm 입자 크기 | ||||||||||||||||||||
| 기둥 온도: | 70 °C | ||||||||||||||||||||
| 사출 량: | 5 μL | ||||||||||||||||||||
| 유량: | 0.800 mL /min | ||||||||||||||||||||
| 모바일 단계: | 용매 A: | 물에 있는 0.1% 포산산 | |||||||||||||||||||
| 용매 B: | ACN에서 0.1% 포산 | ||||||||||||||||||||
| 그라데이션 프로그램: | |||||||||||||||||||||
| 시간(최소): | 0 | 0.25 | 2.25 | 2.26 | 3.4 | 3.41 | 4.75 | ||||||||||||||
| % B: | 40 | 40 | 55세 | 100개 | 100개 | 40 | 40 | ||||||||||||||
| 바늘 세척: ACN, 3 s | |||||||||||||||||||||
| MS/MS 소스: ESI(네거티브 모드) | |||||||||||||||||||||
| 가스 온도: | 300 °C | ||||||||||||||||||||
| 가스 흐름: | 5 L/분 | ||||||||||||||||||||
| 분무기: | 45 psi | ||||||||||||||||||||
| 모 세관: | -4000 V | ||||||||||||||||||||
| 노즐 전압: | -500 V | ||||||||||||||||||||
| 시스 가스 온도: | 250 °C | ||||||||||||||||||||
| 시스 가스 흐름: | 7 L/분 | ||||||||||||||||||||
| MRM 전환: | |||||||||||||||||||||
| 애말리테 ()와 | 전구체 이온(m/z) | 제품 이온(m/z) * | 조각가 (V) | 충돌 에너지 (V) | 드웰 타임 (ms) | 시간 세그먼트 | |||||||||||||||
| 나 IPA | 556.6 | 428.7 | 74세 | 12세 | 60 | 2개 | |||||||||||||||
| 126.9 | 65세 | 60 | |||||||||||||||||||
| 126.8 | 61세 | 60 | |||||||||||||||||||
| 에-IPA | 570.7 | 442.7 | 87세 | 16세 | 60 | ||||||||||||||||
| 시간 세그먼트: | |||||||||||||||||||||
| 세그먼트 | 시작 (최소) | 끝 (최소) | 형식 | 분배기 | 델타 EMV | 극성 | 저장된 데이터 | ||||||||||||||
| 1개 | 0 | 0.6 | MS2 스캔 | 폐기물로 | 0 | 부정적인 | 아니요 | ||||||||||||||
| 2개 | 0.6 | 2개 | Mrm | MS로 | -100 | 부정적인 | 예 | ||||||||||||||
| 3개 | 2개 | 4.75 | MS2 스캔 | 폐기물로 | 0 | 긍정적인 | 아니요 | ||||||||||||||
| * 정량자 전환은 굵게표시됩니다. | |||||||||||||||||||||
표 5: LC-MS/MS 매개 변수. 정량화 기 생성물 이온은 굵게 표시됩니다.
| 대상 | 관찰 | 백분율 | ||||
| 자료 | 하루 | 나-IPA | 나-IPA | 복구 | ||
| QC-1 | 1개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-2 | 1개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-11 | 2개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-12 | 2개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-21 | 3개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-22 | 3개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-31 | 4개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-32 | 4개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-3 | 5개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-4 | 5개 | 0 | Nd | 해당/A | ||
| QC-13 | 1개 | 1.25 | 1.26 | 101% | Ave (10) = | 102% |
| QC-14 | 1개 | 1.25 | 1.23 | 98.40% | SD = | 3.50% |
| QC-23 | 2개 | 1.25 | 1.26 | 101% | % RSD = | 3.40% |
| QC-24 | 2개 | 1.25 | 1.28 | 102% | ||
| QC-33 | 3개 | 1.29 | 1.3 | 101% | ||
| QC-34 | 3개 | 1.29 | 1.25 | 96.90% | ||
| QC-5 | 4개 | 1.29 | 1.37 | 106% | ||
| QC-6 | 4개 | 1.29 | 1.41 | 109% | ||
| QC-15 | 5개 | 1.29 | 1.3 | 101% | ||
| QC-16 | 5개 | 1.29 | 1.34 | 104% | ||
| QC-25 | 1개 | 30.1 | 30.2 | 100% | Ave (10) = | 103% |
| QC-26 | 1개 | 30.1 | 31.2 | 104% | SD = | 1.80% |
| QC-35 | 2개 | 30.1 | 31.1 | 103% | % RSD = | 1.70% |
| QC-36 | 2개 | 30.1 | 31.1 | 103% | ||
| QC-7 | 3개 | 31세 | 31.6 | 102% | ||
| QC-8 | 3개 | 31세 | 31.4 | 101% | ||
| QC-17 | 4개 | 31세 | 32.5 | 105% | ||
| QC-18 | 4개 | 31세 | 32.8 | 106% | ||
| QC-27 | 5개 | 31세 | 31.7 | 102% | ||
| QC-28 | 5개 | 31세 | 32.1 | 104% | ||
| QC-37 | 1개 | 80.2 | 77.8 | 97.00% | Ave (10) = | 101% |
| QC-38 | 1개 | 80.2 | 78.9 | 98.40% | SD = | 2.30% |
| QC-9 | 2개 | 80.2 | 81.8 | 102% | % RSD = | 2.30% |
| QC-10 | 2개 | 80.2 | 79.8 | 99.50% | ||
| QC-19 | 3개 | 82.7 | 83.5 | 101% | ||
| QC-20 | 3개 | 82.7 | 84세 | 102% | ||
| QC-29 | 4개 | 82.7 | 84.7 | 102% | ||
| QC-30 | 4개 | 82.7 | 87.2 | 105% | ||
| QC-39 | 5개 | 82.7 | 83세 | 100% | ||
| QC-40 | 5개 | 82.7 | 84.1 | 102% |
표 6: 몽구스 혈청(μg/mL)에서 me-IPA에 대한 QC 결과.
| 대상 에-IPA(μg/mL) | N | 평균(%) | SD (%) | % RSD |
| 0 | 21세 | |||
| 1.3 | 12세 | 103개 | 4.5 | 4.3 |
| 13세 | 9개 | 91.7 | 1.4 | 1.5 |
| 32세 | 12세 | 106 | 2.4 | 2.3 |
| 85세 | 12세 | 105 | 5.8 | 5.6 |
| 170명 | 9개 | 106 | 1.1 | 1.1 |
표 7: 몽구스 혈청(μg/mL)에서 et-IPA에 대한 QC 결과.
| 미끼 유형 및 에틸 IPA 미끼 농도 (μg/mL) | ||||||||
| 기간 | 0.4% - 물집 | 1.0% - 물집 | 0.14% - 매트릭스 | 컨트롤 | ||||
| 평균(SD) | N | 평균(SD) | N | 평균(SD) | N | 평균(SD) | N | |
| 0일차 | Nd | 5개 | Nd | 4개 | Nd | 6개 | Nd | 3개 |
| 1일차 | 13.7 (10.9) | 2개 | 11.2 (10.4) | 4개 | 20.6 (17.3) | 2개 | Na | Na |
| 제 7일 | 11.5 (6.3) | 6개 | 9.9 (9.6) | 4개 | 21.4 (10.9) | 6개 | Nd | 3개 |
| 제 14일 | 10.2 (5.2) | 6개 | 5.7 (2.5) | 3개 | 17.8 (10.2) | 6개 | Nd | 3개 |
| 제 21일 | 8.9 (4.1) | 4개 | 10.0 (9.5) | 4개 | 23.8 (5.3) | 3개 | Nd | 2개 |
| 제 28일 | 8.5 (3.9) | 5개 | 11.1 (10.6) | 3개 | 17.7 (9.3) | 4개 | Nd | 3개 |
| 제 35일 | 17.0 (NA) | 1개 | 9.1 (9.0) | 4개 | 21.7 (9.3) | 2개 | Nd | 1개 |
| 제 42일 | Na | 0 | 8.4 (8.5) | 4개 | 16.5 (NA) | 1개 | Nd | 2개 |
| 제 49일 | 10.2 (5.8) | 2개 | 8.1 (8.4) | 4개 | 17.5 (4.7) | 2개 | Nd | 2개 |
| 제 56일 | 10.9 (5.4) | 2개 | 3.8 (1.1) | 3개 | 17.6 (6.1) | 2개 | Nd | 2개 |
표 8: 미끼 유형에 의한 평균(스탠드 편차[SD]) 에틸-IPA 혈청 농도. ND = 감지되지 않음, NA = 해당되지 않음.
| 용량 및 메틸 IPA 농도 (μg/mL) | ||||||||
| 기간 | 0.04% | 0.07% | 0.14% | 컨트롤 | ||||
| 평균(SD) | N | 평균(SD) | N | 평균(SD) | N | 평균(SD) | N | |
| 0일차 | ND (NA) | 4개 | ND (NA) | 4개 | ND (NA) | 4개 | ND (NA) | 4개 |
| 1일차 | 7.8 (7.1) | 4개 | 22.2 (9.2) | 4개 | 29.1 (16.0) | 4개 | ND (NA) | 4개 |
| 제 7일 | 4.4 (4.8) | 4개 | 14.4 (4.6) | 4개 | 21.3 (12.0) | 4개 | ND (NA) | 4개 |
| 제 14일 | 5.7 (5.9) | 4개 | 12.0 (3.5) | 4개 | 19.6 (10.6) | 4개 | ND (NA) | 4개 |
| 제 21일 | 4.9 (4.5) | 4개 | 12.0 (0.8) | 3개 | 18.3 (9.9) | 4개 | ND (NA) | 4개 |
| 제 28일 | 5.4 (5.0) | 4개 | 9.8 (2.4) | 4개 | 16.4 (8.1) | 4개 | ND (NA) | 4개 |
표 9: 투여량에 의한 평균(SD) 메틸-IPA 혈청 농도. ND = 감지되지 않음, NA = 해당되지 않음. 모든 메틸 IPA 농도는 외부 미끼 매트릭스내로 통합되었다.
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Discussion
연구를 위해 개발된 LC-MS/MS 방법은 몽구스 혈청에서 me-IPA 및 et-IPA를 정확하게 정량화하기 위해 다중 반응 모니터링의 선택성을 활용하였다. MS/MS 검출의 선택성은 또한 분석 전에 혈청에서 단백질을 침전시키기 위하여 아세토니트릴에 전적으로 의존하는 간단한 정리 프로토콜을 허용했습니다.
이오페노산은 ACN에서 용해되지만 물에 실질적으로 용해되지 않습니다. ACN 추출로부터 물을 배제하기 위해, 염화나트륨을 첨가하여 맑은 물을 강제로 첨가하였다:ACN 상 분리는 수성(혈청) 상으로부터의 이온 강도를 증가시킴으로써 분리되었다. 휘발성 산 삼류 성 산 (TFA) 또한 iophenoxic 산 추출 하는 동안 protonatated 하 고 ACN 단계에서 더 쉽게 용해 될 것 이다 보장 하기 위해 추가 되었습니다. TFA는 LC-MS/MS 분석 전에 드라이다운 단계 동안 제거된다.
몽구스에서 혈액 무승부는 약 1 mL, 0.5 mL 이하의 혈청을 산출했다. 각 시료의 복제 분석을 수행하기 위해 Class A 체적 파이펫 및 플라스크와 같은 일반적인 분석 실험실 유리 제품대신 미세 원심 분리튜브를 사용하는 마이크로 스케일 시료 준비 절차가 필요했습니다. 정확하고 정확한 결과를 얻으려면 분석가가 마이크로리터 크기의 팁이 있는 유리 마이크로리터 주사기 및 양성 변위 반복 파이펫터의 사용에 능숙해야 합니다.
이 방법의 한계는 비용이 많이 드는 LC-MS/MS 계측 및 사용 및 유지 보수에 대한 교육을 받은 분석가가 필요하다는 것입니다. 그러나, me-IPA 및 et-IPA는 설명된 HPLC 조건을 사용하여 기준선으로 해결되기 때문에, 이 방법은 간섭이 관찰되지 않는 경우 UV 검출기를 이용한 단일 사중극자 LCMS 또는 HPLC에 잠재적으로 적응될 수 있었다.
2.8 mg 투여량에서 물집 팩과 미끼 매트릭스에서 et-IPA를 사용한 몽구스와의 평균 혈청 농도의 차이는 마커가 블리스터 팩에 포함될 때, 미끼 매트릭스에 통합되는 것이 아니라 유출을 시사한다. 이것은 미끼 섭취와 반대로 백신을 추정하는 목적을 위한 연루가 있을 수 있습니다. 예를 들어, 마커를 외부 미끼 매트릭스에 통합하면 동물이 매트릭스를 먹지만 백신이 유출되는 경우 백신 커버리지의 추정치를 부풀릴 수 있다. 그러나, 규제 제한은 블리스터 팩 내의 백신과 생물학 마커를 직접 혼합하는 기능을 배제할 수 있습니다. <100% 소비가 기록된 경우, 3건의 경우 블리스터 팩에 et-IPA가 함유된 미끼가 있었고, 그 중 2건은 1% 농도가 더 높았다. 이것은 et-IPA가 더 높은 농도에 있을 때 잠재적인 맛 혐오를 건의합니다. 미끼 매트릭스에 1% (20.0 mg) et-IPA를 함유하는 미끼가 몽구스에게 제공되었을 때, 모든 동물은 미끼를 거부했다.
14일째에 et-me-IPA에 대한 평균 IPA 농도는 각각 약 17 및 19 μg/mL이었다. Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos, Ciudad Real, 스페인, 부틸 및 펜틸-IPA를 사용하여 수행된 유사한 연구는 동일한 농도와 미끼로 전달될 때 몽구스 세라에서 약 45 및 10 μg/mL의 14농도를 발견했습니다. 우리의 연구에서와 같이 공식화. 이러한 차이 제안 IPA의 다른 파생 상품 몽구스의 다른 속도로 대사 수 있습니다., 마커 보존 때 유용할 수 있는 (단기 또는 장기 보존) 우려.
위장 시스템의 생리학의 차이 흡수 및 다른 종에서 IPA의 배설에 영향을 미칠 수 있습니다. 국내 고양이(펠리스카투스)에서IPA의 혈장 제거 반감기는 1.5 mg/kg에서 전달되었을 때 107일인 반면, 동일한 투여량비율로 브러시테일 포섬의 비율은 약 1일28일이었다. IPA가 국내 염소(카프라 aegagrus hircus)에게주어졌을 때 1.5 mg/kg의 투여 량으로 IPA의 말단 제거 반감기는 81 일이었다, 비록 조사자들은 투여 후 160 일까지 높은 요오드 농도를 계속 찾았습니다. 39. Vivveridae (몽구스가 이전에40명이배정된 가족)의 위장 시스템은 국내 고양이41의것과 유사하게 설명되며, 이는 IPA의 보유 시간을 설명할 수 있습니다. 몽구스. 연구는 또한 IPA는 화성에서 다르게 대사 될 수 있습니다 제안, eutherian 종보다 더 빠른 배설을 허용29.
이 연구에서 평가된 IPA의 두 유도체는 몽구스에서 장기(4−8주) 마킹 능력을 제공했다. 몽구스에서 생물학적 마커로 IPA의 사용은 연구 목표와 마킹의 원하는 기간을 고려해야한다. 연속된 기간 동안 동일한 연구 사이트에서 동물을 표시 해야 하는 경우, IPA의 다른 파생 상품 한 마킹 이벤트에서 결과 이전 이벤트 동안 표시 하 여 혼동 되지 않도록 하는 데 사용할 수 있습니다. 미국 야생동물에 대한 수술 ORV의 일환으로, RVNA 및 바이오마커의 존재에 대한 표적 종 및 시험은 전형적으로 ORV 분포42에따라 4-6주 동안 수행된다. 실용적인 관점에서, 이 기간 동안 et-또는 me-IPA가 쉽게 검출될 수 있는 것으로 보인다. 이 연구에서 평가된 IPA의 두 콘젠더의 다양한 농도를 제공하는 몽구스의 잔류물 부패 기능을 평가하기 위한 향후 연구는 유용할 것이다.
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Disclosures
저자 AV 및 SO는 경구 광견병 백신 미끼 제조 업체의 풀 타임 직원입니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 농무부, 동물 및 식물 건강 검사 서비스, 야생 동물 서비스, 국립 광견병 관리 프로그램 및 IDT 바이오로지카(독일 데사우-로슬라우)의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
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