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Immunology and Infection

Análisis de análogos de ácido iophenoxic en pequeña mangosta india (Herpestes Auropunctatus) Sera para su uso como un marcador biológico de vacunación de rabia oral

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

Ofrecimos mongooses placebo cebos de vacuna de rabia oral con ácido etil o metilio-ifenoxico como biomarcador y verificamos la aceptación de cebos utilizando una novedosa cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) método.

Abstract

La pequeña mangosta india (Herpestes auropunctatus) es un reservorio del virus de la rabia (RABV) en Puerto Rico y comprende más del 70% de los casos de rabia animal reportados anualmente. El control de la circulación rabosa en los embalses de vida silvestre se logra típicamente mediante una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). Actualmente no existe ningún programa de ORV de vida silvestre en Puerto Rico. Se han llevado a cabo investigaciones sobre vacunas orales contra la rabia y varios tipos de cebos para la mangosta sin demonios con resultados prometedores. El monitoreo del éxito del ORV se basa en la estimación de la aceptación de cebos por especies objetivo, lo que normalmente implica evaluar un cambio en los anticuerpos neutralizantes rabv (RVNA) después de la vacunación. Esta estrategia puede ser difícil de interpretar en áreas con un programa activo de ORV de vida silvestre o en áreas donde RABV es enzoótico y los niveles de fondo de RVNA están presentes en las especies de reservorios. En tales situaciones, un biomarcador incorporado con la vacuna o la matriz de cebo puede ser útil. Ofrecemos 16 cebos orV placebo de mangostas cautivas que contienen ácido etil-iofenoxic (et-IPA) en concentraciones de 0.4% y 1% dentro del cebo y 0.14% en la matriz de cebo externo. También ofrecimos 12 cebos ORV de mangostas cautivas que contienen ácido metil-iofenoxic (me-IPA) en concentraciones de 0.035%, 0.07% y 0.14% en la matriz de cebo externo. Recogimos una muestra de suero antes de la oferta de cebo y luego semanalmente hasta ocho semanas después de la oferta. Extrajimos ácidos iofenoxicos de los sueros en acetonitrilo y cuantificamos mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas. Analizamos los sueros para et-IPA o me-IPA por cromatografía líquida-espectrometría de masas. Encontramos una capacidad de marcado adecuada durante al menos ocho y cuatro semanas para et- y me-IPA, respectivamente. Ambos derivados del IPA podrían ser adecuados para la evaluación sobre el terreno de la ingesta de cebo ORV en mangostas. Debido a la longevidad del marcador en la mangosta sera, se debe tener cuidado de no confundir los resultados mediante el uso de la misma derivada IPA durante evaluaciones consecutivas.

Introduction

El virus de la rabia (RABV) es un lyssavirus de una sola cadena de sentido negativo, y circula entre diversas especies de embalses de vida silvestre dentro de los órdenes Carnivora y Chiroptera. Múltiples especies de mangosta son reservorios de RABV, y la pequeña mangosta india (Herpestes auropunctatus) es el único reservorio en Puerto Rico y otras islas del Caribe en el hemisferio occidental1,2,3 . El control de la circulación rabosa en los embalses de vida silvestre se realiza típicamente a través de una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). En los Estados Unidos (EE.UU.), esta actividad de gestión está coordinada por el Programa Nacional de Gestión de La Rabia (NRMP)4del USDA/APHIS/Wildlife Services. Actualmente no existe ningún programa de ORV de vida silvestre en Puerto Rico. Se ha llevado a cabo investigaciones sobre vacunas antirrábicas y varios tipos de cebos para mangostas con resultados prometedores que sugieren que un programa de ORV para mangostas es posible5,6,7,8.

El monitoreo del impacto de la ORV se basa en la estimación de la aceptación del cebo por especies objetivo, lo que normalmente implica evaluar un cambio en la seroprevalencia de anticuerpos RV. Sin embargo, esta estrategia puede ser difícil en áreas con un programa activo de ORV de vida silvestre o en áreas donde rv es enzoótico y los niveles de fondo de anticuerpos neutralizantes RABV (RVNA) están presentes en las especies de reservorios. En tales situaciones, un biomarcador incluido en el cebo o la matriz de cebo externa puede ser útil.

Varios marcadores biológicos se han utilizado para monitorear la adopción de cebos en numerosas especies, incluyendo mapaches (Procyon lotor)9,10,stoats (Mustela ermine)11,12, tejones europeos ( Meles meles) 13, jabalíes (Sus scrofa)14, pequeñas mangostas indias15 y perros de la pradera (Cynomysludovicianus)16,17, entre otros. En los Estados Unidos, los cebos ORV operativos a menudo incluyen un biomarcador de tetraciclina del 1% en la matriz de cebos para monitorear la toma de cebo18,19. Sin embargo, los inconvenientes en el uso de la tetraciclina incluyen una creciente preocupación por la distribución de antibióticos en el medio ambiente y que la detección de tetraciclina es típicamente invasiva, lo que requiere la extracción dental o la destrucción del animal para obtener hueso muestras20. Rhodamine B ha sido evaluado como un marcador en una variedad de tejidos y se puede detectar utilizando luz ultravioleta (UV) y fluorescencia en el cabello y bigotes10,21.

El ácido iofenoxic (IPA) es un polvo blanco y cristalino que se ha utilizado para evaluar el consumo de cebo en coyotes (Canis latrans)22, zorro ártico (Vulpes lagopus)23, zorro rojo (Vulpes vulpes)24, mapaches 9 , 25, jabalí14, venado rojo (Cervus elaphus scoticus)26, tejones europeos12 y hurones (M. furo)27, entre varias otras especies de mamíferos. Los tiempos de retención de IPA varían según la especie de menos de dos semanas en algunos marsupiales28,29, a al menos 26 semanas en ungulados26 y más de 52 semanas en perros domésticos (Canis lupus familiaris)30. Los tiempos de retención también pueden depender de la dosis31. El ácido iofenoxico se une fuertemente a la albúmina sérica y fue detectado históricamente por la medición de los niveles de yodo en sangre32. Este enfoque indirecto fue suplantado por métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para medir directamente las concentraciones de ácido crianoxórico con detección UV33,y finalmente con cromatografía líquida y espectrometría de masas (LCMS) 34,35. Para este estudio, se desarrolló un método de cromatografía líquida altamente sensible y selectiva con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) que utiliza monitoreo de reacción múltiple (MRM) para cuantificar dos análogos del ácido iofenoxico. Nuestro objetivo era utilizar este método LC-MS/MS para evaluar la capacidad de marcado de ácido 2-(3-hidroxi-2,4,6-triiodobenzyl)propanoico (metil-IPA o me-IPA) y 2-(3-hidroxi-2,4,6-triiodobenzyl)ácido butanoico (etil-IPA o et-IPA) y cuando se entrega en un ORV (etil-IPA o et-IPA) y cuando se entrega en un ORV (etil-IPA o et-IPA) y cuando se entrega en un ORV cebo a las mangostas cautivas.

Las mangostas fueron capturadas en vivo en trampas de jaulas con salchichas ahumadas disponibles en el mercado y aceite de pescado. Las mangostas se alojaban en jaulas individuales de acero inoxidable de 60 cm x 60 cm x 40 cm y alimentaban una ración diaria de 50 g de comida seca para gatos, complementada dos veces por semana con un muslo de pollo disponible en el comercio. El agua estaba disponible ad libitum. Entregamos dos derivados de IPA, etil-IPA y metil-IPA, a mangostas cautivas en cebos ORV placebo. Todos los cebos estaban compuestos por un blíster de lámina de 28 mm x 20 mm x 9 mm con un recubrimiento externo (en adelante "matriz de cebo") que contiene huevo de pollo en polvo y gelatina (Tabla de materiales). Los cebos contenían 0,7 ml de agua o derivado de IPA y pesaban aproximadamente 3 g, de los cuales 2 g era la matriz de cebo externa.

Ofrecimos 16 mangostas cautivas y-IPA en tres concentraciones: 0,14% (2,8 mg et-IPA en matriz de cebo de 2 g; 3 machos [m], 3 hembras [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA en 0,7 ml de volumen de envase blíster; 3 m, 3f) y 1,0% (7,0 mg de etil-IPA en 0,7 ml de volumen de blíster; , 2f). La dosis global de 2,8 mg corresponde a una dosis de 5 mg/kg27,36 y se basa en un peso medio de mangosta de 560 g en Puerto Rico. Seleccionamos el 1% como la concentración más alta como la investigación sugiere que la aversión al sabor a algunos biomarcadores puede ocurrir en concentraciones >1% en algunas especies37. Sólo ofrecimos la dosis del 1% en el blíster, ya que la floculación impidió que el soluto se disolviera en el disolvente lo suficiente como para incorporarse uniformemente a la matriz de cebo. Un grupo de control (2m, 1f) recibió cebos llenos de agua estéril y sin IPA. Ofrecimos cebos a las mangostas por la mañana (8 a.m.) durante o antes de alimentar su ración de mantenimiento diario. Los restos de cebo fueron retirados después de aproximadamente 24 horas. Recogimos muestras de sangre antes del tratamiento, un día después del tratamiento y luego semanalmente hasta 8 semanas después del tratamiento. Hemos anestesiado las mangostas por inhalación de gas isoflurano y recolectamos hasta 1,0 ml de sangre entera por venopunción de la vena cava craneal como se describe para hurones38. Centrifugamos muestras de sangre entera, transferimos sueros a crioviales y las almacenamos a -80 oC hasta su análisis. No todos los animales fueron muestreados durante todos los períodos de tiempo para minimizar los impactos de las extracciones repetidas de sangre en la salud de los animales. Los animales de control se tomaron muestras el día 0, luego semanalmente hasta 8 semanas después del tratamiento.

Entregamos me-IPA en tres concentraciones: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) y 0,14% (2,8 mg), todo ello incorporado a la matriz de cebo, con 2 machos y 2 hembras por grupo de tratamiento. Dos machos y dos hembras recibieron cebos llenos de agua estéril y sin IPA. Los tiempos de ofrenda de cebo y la anestesia de mangosta se describen anteriormente. Recogimos muestras de sangre antes del tratamiento el día 1, y luego semanalmente hasta 4 semanas después del tratamiento.

Probamos los datos de concentración sérica para la normalidad y los medios estimados para las concentraciones séricas de IPA de diferentes grupos de tratamiento. Utilizamos un modelo mixto lineal para comparar las concentraciones medias de suero y IPA agrupadas entre individuos. El tipo de cebo (matriz/blister pack) era un efecto fijo además del día experimental, mientras que la identificación animal era un efecto aleatorio. Todos los procedimientos se ejecutaron utilizando un software estadístico común (Tablade materiales)y la importancia se evaluó en el valor de 0,05.

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Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Investigación de Vida Silvestre del USDA bajo el protocolo de investigación aprobado QA-2597.

NOTA: El siguiente protocolo describe el procedimiento de análisis para detectar el ácido metil-iofenoxic en suero de mangosta. Este método es la versión final de un proceso iterativo que comenzó con el análisis del ácido etil-iofenoxic en suero de mangosta. Durante la evaluación inicial del ácido etil-iofenoxic se realizaron modificaciones menores en los métodos, dando como resultado el protocolo final que se presenta a continuación. Los resultados representativos incluyen los obtenidos durante ambas iteraciones.

1. Preparación de soluciones y normas

  1. Comprar me-IPA y et-IPA.
  2. Para la fase móvil A, preparar 1 L de ácido fórmico del 0,1% (v/v) en agua combinando 1 ml de ácido fórmico con 1 L de agua ultrapura (18 M). Para la fase móvil B, preparar 1 L de 0,1% (v/v) ácido fórmico en acetonitrilo (ACN) combinando 1 ml de ácido fórmico con 1 L de ACN.
  3. Para diluyente, preparar 200 ml de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,5% (v/v) en ACN combinando 1 ml de TFA con 200 ml de ACN.
  4. Preparar soluciones concentradas de ipA de me-IPA y et-IPA en ACN a concentraciones de aproximadamente 1.000 g/ml.
    1. Pesar aproximadamente 10 mg de me-IPA en un microbalance y registrar la masa en 0.0001 mg. Transfiera cuantitativamente el me-IPA a un matraz volumétrico de 10 ml Clase A utilizando 45 ml de ACN. Sonicar 1 min para disolver todos los sólidos, y luego llevar al volumen con ACN.
    2. Transfiera 8 ml de cada material a viales de vidrio ámbar de 8 ml con tapas forradas de politetrafluoroetileno (PTFE). Conservar a temperatura ambiente (RT). Transfiera el stock restante a residuos peligrosos.
  5. Para el stock de 25x-7me-IPA (Tabla 1), prepare un stock de me-IPA en ACN a aproximadamente 200 g/ml. Ejemplo: Transfiera 1 ml del material concentrado me-IPA del paso 1.4.2 a un matraz volumétrico de clase A de 5 ml utilizando una jeringa de vidrio de 1.000 ml. Diluir al volumen con ACN. Transfiera el caldo a un vial de vidrio ámbar de 8 ml con tapa forrada de PTFE. Almacenar en RT.
  6. Prepare las seis existencias 25x me-IPA adicionales descritas en la Tabla1. Para cada material, combine los volúmenes indicados utilizando un pipeteador repetido en un vial de vidrio ámbar de 8 ml de ámbar con tapa forrada de PTFE. Almacene cada acción en RT.
  7. Para la población sustituta de 25x, prepare un stock suplente de me-IPA en ACN a aproximadamente 10 g/ml a partir de la población concentrada preparada en el paso 1.4.2. Transfiera 0,100 ml de la culata me-IPA concentrada a un matraz volumétrico de 10 ml clase A utilizando una jeringa de vidrio de 100 ml y, a continuación, diluya al volumen con ACN.
    1. Transfiera 8 ml a un vial de vidrio ámbar de 8 ml con tapa forrada de PTFE. Almacenar en RT. Transfiera el material restante a residuos peligrosos.
  8. Prepare 4 existencias que contengan ambos analitos en viales de automuestreador de vidrio atornillado de 2 ml como se describe en la Tabla2.
    1. Por ejemplo, para preparar el material 4x-7, a un vial de 2 ml, agregue 0,20 ml del material de 25x-7 me-IPA del paso 1.5 utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 0,5 ml. Agregue 0,20 ml del material suplente de 25x y-IPA del paso 1.7 utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 0,5 ml.
    2. Añadir 0,85 ml de ACN utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 1 ml. Tapar el vial de forma segura e invertir 5x para mezclar.
  9. Prepare la curva estándar en viales de automuestreador atornillado de 2 ml como se describe en la Tabla3.
    1. Por ejemplo, para preparar la norma 7 (Std 7), a un vial de 2 ml, añada 0,20 ml del stock 4x-7 del paso 1.8.2 utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 0,5 ml. Añadir 0,60 ml de agua DI ultrapura utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 1 ml. Tapar el vial de forma segura e invertir 5x para mezclar.

2. Preparación de la muestra

ADVERTENCIA: El personal que realiza este procedimiento debe haber recibido la serie completa de profilaxis previa a la exposición a la rabia y tener un título documentado de anticuerpos contra la rabia por encima de 0,5 UI de un centro médico designado por Salud Ocupacional Federal. El personal debe usar batas de laboratorio y protección ocular en todo momento mientras realiza la extracción. ADVERTENCIA: Realice los pasos 2.3-2.6 en un gabinete de bioseguridad de clase II.

  1. Para cada muestra, prepare un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 200 a 300 mg de NaCl.Organice los tubos en un bastidor de plástico de 80 posiciones. Reservar para su uso en el paso 2.6.
    NOTA: Se recomienda una micro primicia (u otro dispositivo de medición pequeño) para un gran número de muestras.
  2. Para cada muestra, etiquete dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml: uno como "A" y el otro como "B". Coloque los tubos en un estante de plástico de 80 posiciones.
  3. Coloque los siguientes materiales y equipos necesarios para la extracción de suero en un armario de bioseguridad de clase II: tubos de microcentrífuga (en bastidores) preparados en los pasos 2.1 y 2.2, un mezclador de vórtice, un pipeteador repetido con 0,5 ml y 5 ml de capacidad, puntas de 100 a 1.000 ol de desplazamiento de aire pipeta con puntas de 1.000 l, recipientes con aproximadamente 100 ml cada uno de agua DI diluyente y ultrapura, y un contenedor de residuos de biorhazard.
  4. Retire las muestras de suero del almacenamiento congelado y caliente a RT en el gabinete de bioseguridad. Los vórtices mezclan cada muestra de suero antes del muestreo.
  5. Usando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 0,5 ml, dispensar 0,050 ml de suero de mangosta en el tubo "A" y añadir 0,050 ml de material sustituta 25x. A continuación, añadir 0,950 ml de diluyente al tubo "A" utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 5 ml. Tapa de forma segura y mezcla de vórtice para 10 x 15 s.
  6. Dispensar el NaCl prepesado del paso 2.1 en el tubo "A" y la mezcla de vórtice 3x para 8 x 12 s. Limpie las superficies exteriores del bastidor del vial que contiene el tubo "A" usando 70% (v/v) isopropanol.
    NOTA: El bastidor de muestras ahora se puede retirar del gabinete de bioseguridad de clase II.
  7. Tubo centrífugo "A" a 12.000 x g durante 1 min para separar las fases acuosa y ACN. Pipeta de 0,80 ml de la fase ACN superior al tubo "B" utilizando una pipeta de desplazamiento de aire de 100 a 1.000 ml. Transfiera la solución restante en el tubo "A" a residuos peligrosos y deseche el tubo vacío en un contenedor de residuos biopeligrosos.
  8. Retire ACN y TFA del tubo "B" con un flujo suave de N2 gas en un baño de agua de 45 oC.
  9. Añadir 0,250 ml de ACN al tubo "B" utilizando un pipetador repetido, mezcla de vórtice durante 4 x 5 s, y luego centrifugar brevemente (2 x 4 s) a 12.000 x g para recoger el líquido en la parte inferior del tubo.
  10. Añadir 0,750 ml de agua DI ultrapura al tubo "B" utilizando un pipetador repetido con punta de capacidad de 5 ml, mezcla de vórtice para 4 x 5 s, y luego centrifugar durante 1 min a 12.000 x g para aclarar la muestra.
  11. Transfiera 0,75 ml del sobrenadante a un vial de automuestreador utilizando una pipeta de desplazamiento de aire de 1.000 ml. Deseche las puntas de las pipetas en un contenedor de residuos de riesgo biológico.
  12. Tapa de los viales del automuestreador de forma segura y analizarlos mediante LC-MS/MS (sección 4). Transfiera la solución restante en el tubo "B" a residuos peligrosos y deseche el tubo vacío en un contenedor de residuos biopeligrosos. Deseche todos los residuos biopeligrosos mediante autoclave o incineración.

3. Muestras de control de calidad

ADVERTENCIA: Siga las declaraciones de precaución descritas en la sección 2.

NOTA:El siguiente procedimiento describe el número mínimo de muestras de control de calidad (QC) necesarias para un análisis. Se recomiendan réplicas en cada nivel si hay suficiente suero de mangosta de control disponible.

  1. Preparar cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 200 a 300 mg de NaCl. Coloque los tubos en un estante de plástico de 80 posiciones.
  2. Para cada muestra de control de calidad, etiquete dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml: uno como "A" y el otro como "B". Coloque los tubos en un estante de plástico de 80 posiciones.
  3. Repita el paso 2.3.
  4. Retire el suero de mangosta de control del almacenamiento congelado y caliente a RT en el gabinete de bioseguridad. El vórtice mezcla el suero de control antes del muestreo.
  5. Dispensar 0,050 ml de suero de mangosta de control en los cuatro tubos "A" de 1,5 ml utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 0,5 ml.
  6. Fortalezca cada una de las cuatro muestras de control de calidad especificadas en la Tabla 4 utilizando un pipeteador repetido con punta de capacidad de 0,5 ml. Tapar cada muestra de control de calidad de forma segura y mezcla de vórtice para 10 a 15 s.
  7. Realice el procedimiento de extracción como se describe en los pasos 2.6 a 2.12.

4. Análisis LC-MS/MS

  1. Configure el LC-MS/MS con todos los parámetros descritos en el Cuadro5. Encienda el LC-MS/MS y permita que la columna alcance los 70 oC antes de ajustar el caudal a 0,800 ml/min.
  2. Configure una secuencia en el software de adquisición de datos (Tablade materiales)para inyectar la curva estándar antes y después de cada lote que consista en muestras de control de calidad y muestras desconocidas.
  3. Inyectar todas las normas y muestras y adquirir cromatógramas de iones MRM utilizando los parámetros enumerados en la Tabla5.
  4. Después de la finalización de la secuencia, apague el LC-MS/MS y deseche todos los viales del muestreador automático como residuos peligrosos.

5. Cuantificación

  1. Utilice el software de análisis de datos para generar una curva de calibración de respuestas relativas frente a concentraciones relativas para me-IPA utilizando et-IPA como estándar interno. Calcule las respuestas relativas de la transición mrm cuantificador para me-IPA (556,6 a 428,7) divididas por la transición MRM para et-IPA (570,7 a 442,7). Construya una curva de calibración de 7 niveles utilizando una función cuadrática de segundo orden que se pondera 1/x e ignora el origen.
  2. Calcule la concentración sérica(sueroC) de me-IPA utilizando la siguiente ecuación:
    Equation 1
    donde el instrumento c es la concentración determinada por el instrumento a partir de la curva Equation 2 de calibración en unidades de g/ml, 1,25 es el factor de dilución, Vfinal es el volumen final de la muestra (1,0 ml), y suero V es el volumen sérico en ml ( 0,050 ml nominal).

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Representative Results

En la Figura 1se presentan cromatogramas iónicos representativos de un análisis me-IPA. El suero de mangosta de control (Figura1A)ilustra el tiempo de retención de et-IPA (analito suplente) y la ausencia de me-IPA en el tiempo de retención indicado. La muestra de control de calidad (Figura1B)ilustra la separación de línea de base de me-IPA de et-IPA, así como las transiciones de cuantificador y calificador para me-IPA. La Figura 1C muestra una muestra representativa del estudio con una concentración sérica observada de 33,5 g/ml me-IPA.

En la Figura 2se presenta una curva de calibración representativa de un análisis me-IPA. La curva estándar de 7 niveles y 14 puntos oscila entre 0,00202 y 8,27 g/mL me-IPA con un coeficiente de correlación (r2) de 0,9998. Los coeficientes de correlación oscilaron entre 0,9998 y 0,99997 para los cinco análisis me-IPA. La concentración de analito sustituto y-IPA fue de 0,502 g/ml en todas las normas.

La Tabla 6 presenta los resultados de precisión y precisión para el suero de mangosta de control fortificado con 0, 1.3, 31 y 82 g/mL me-IPA (n a 10 en cada nivel). Los resultados se recopilaron de cinco análisis separados. Las recuperaciones porcentuales oscilaron entre el 96,9% y el 109%. La desviación estándar relativa porcentual (% RSD) en los tres niveles de fortificación fue del 3,4%, 1,7% y 2,3%, respectivamente.

La relación señal-ruido (S/N) observada en muestras de control de calidad (n a 10 controles negativos; n a 10 a 1,3 g/mL me-IPA) se utilizó para determinar el límite de detección (DL; 3 x S/N) y el límite de cuantificación (QL; 10 x S/N). El DL y el QL para me-IPA en suero de mangosta fueron 0.012 g/mL y 0.042 g/mL, respectivamente.

Las respuestas de área pico de la transición MRMEquation 3 calificador divididas por la transición de MRM cuantificador ( se calculó para todos los estándares y muestras. Esta proporción para cada muestra se dividió entonces por la relación media observada en los estándares de calibración para determinar la coincidencia porcentual del calificador. La relación de calificador para la muestra mostrada en la Figura 1C fue de 0,439, con una coincidencia del 96,3%.

La recuperación del analito suplente et-IPA se calculó para todas las muestras de control de calidad y muestras desconocidas dividiendo la respuesta de área pico et-IPA por la respuesta de área pico promedio et-IPA observada en los estándares de calibración. Las recuperaciones medias de analitos sustitutas fueron del 91,0% (controles negativos), del 91,4% (1,3 g/ml), del 92,8% (31 g/ml) y del 95,4% (82 g/ml).

No se observaron picos de interferencia para las transiciones cuantificador o calificador de me-IPA en el suero de la mangosta de control (Figura1A).

El procedimiento de extracción y las condiciones instrumentales utilizadas para determinar et-IPA en suero de mangosta (Figura3 y Tabla7) fue idéntico al método me-IPA, pero con los siguientes cambios. El ácido propilo-iofenoxico (pr-IPA) se utilizó como analito sustituto y se utilizó un LC-MS/MS más antiguo y menos sensible. La temperatura del gas de secado de la fuente fue de 350 oC con un caudal de 12 L/min y una presión nebulizadora de 35 psi. El voltaje capilar era de -2.500 V. La fuente no tenía gas de vaina ni medios para ajustar el voltaje de la boquilla. La transición del MRM cuantificador para et-IPA fue de 570,7 a 442,8 (584,7 a 456,8 para pr-IPA). El fragmentador era de 80 V y la energía de colisión era de 10 V para ambos analitos. El calificador MRM para et-IPA fue de 570,7 a 126,8 con una energía de colisión de 40 V.

La prueba de todas las muestras de suero de mangosta para et-IPA se realizó en ocho análisis. La curva de calibración de 7 niveles osciló entre 0,00207 y 8,48 g/ml con coeficientes de correlación (r2) que oscilaban entre 0,9990 y 0,9999. La concentración de analito subrogado pr-IPA fue de 0,512 g/ml. La Tabla 7 presenta los resultados de precisión y precisión para el suero de mangosta de control fortificado con 0, 1.3, 13, 32, 85 y 170 g/mL me-IPA. Los resultados se recopilaron de ocho análisis separados. Las recuperaciones porcentuales oscilaron entre el 89,5% y el 115%. El % de RSD en los cinco niveles de fortificación fue del 4,3%, 1,5%, 2,3%, 5,6% y 1,1%, respectivamente. El S/N observado en las muestras de control de calidad (n a 21 controles negativos; n a 21 a 1,3 g/mL me-IPA) se utilizó para determinar el DL y el QL. El DL y el QL para me-IPA en suero de mangosta fueron de 0,12 g/ml y 0,42 g/ml, respectivamente. La recuperación media de analitos sustitutas a partir de muestras de control de calidad fue del 86,8% (n a 75). No se observaron picos de interferencia para las transiciones cuantificador o calificador de et-IPA en el suero de mangosta de control.

Todas las mangostas ofrecidas y cebos et-IPA consumieron el 25 % del cebo dentro de la restricción de tiempo de 24 horas y tenían niveles cuantificables de et-IPA en su sera (Tabla 8). A partir del análisis del modelo mixto, las concentraciones medias generales de IpA séricas fueron marginalmente más altas de los cebos con 2,8 mg de biomarcador en la matriz de cebos (17,5 g/ml, IC del 95% 11,7 a 23,3 g/ml) en comparación con el envase de blíster (9,8 g/ml, IC del 95% 4,0 a 15,6 g/ml) , P a 0,07). Las concentraciones de ambos tipos de cebo se descomponían con un día experimental (a -0,15 a 0,04, F a 14,4, P a 0,0005). Se observó variabilidad a nivel individual en las concentraciones séricas de IpA (estimación del parámetro de covarianza ID animal 46,6 a 20,7). Todas las mangostas consumieron el 100% de los cebos de control con sólo el blíster de papel de aluminio vacío restante. La concentración media de residuos et-IPA en suero fue variable por período de tiempo y no parecía disminuir constantemente con el tiempo (Figura3).

Todas las mangostas me ofrecieron cebos de IPA consumidos en el 25% del cebo dentro del límite de tiempo de 24 horas y tenían niveles cuantificables de me-IPA en su sera (Tabla9). La concentración serológica media de et- y me-IPA en la mangosta sera parecía dependiente de la concentración de IPA en el cebo. Las concentraciones más altas de IPI en el cebo dieron lugar a residuos séricos más altos incluso en los casos en que la dosis global (2,8 mg en el caso de et-IPA) se mantuvo igual. Curiosamente, me-IPA parecía producir un patrón de degradación más uniforme con el tiempo con un pico inicial en el día 1, seguido de una disminución constante hasta el día 14 donde las concentraciones parecían estanca (Figura4).

Figure 1
Figura 1 : Cromatografías iónionas representativas. (A) Cromatograma de iones MRM representativo del suero de mangosta de control fortificado con ácido etil-iofenoxico de analito subrogado (et-IPA). La flecha indica el tiempo de retención del ácido metil-iofenoxic (me-IPA). (B) Cromatograma de iones MRM representativo del suero de mangosta de control fortificado con 31 g/ml me-IPA. Se muestran las intensidades relativas de las transiciones cuantificador (Quant) y calificador (Qual) para me-IPA. (C) Cromatograma de iones MRM representativo de una muestra de suero de mangosta con una concentración de me-IPA observada de 33,5 g/ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Curva de calibración representativa. Una curva de calibración original generada por el software de análisis de datos para el ácido metil-iofenoxic (me-IPA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Concentración media de IPA etílico sérico (et-IPA) por tipo de cebo y concentración a lo largo del tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Concentración media de IPA metilo sérico (me-IPA) por concentración de cebo a lo largo del tiempo. Todas las concentraciones de me-IPA se incorporaron a la matriz de cebo externo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentración de me-IPA (g/mL)
Id
25x-7 Consulte el paso 1.6 200
25x-6 Combinar 1.000 mL 25x-7 Stock con 3.000 mL ACN 50
25x-5 Combine 1.000 mL 25x-6 Stock con 3.000 mL ACN 13
25x-4 Combine 1.000 mL 25x-5 Stock con 3.000 mL ACN 3.1
25x-3 Combine 1.000 mL 25x-4 Stock con 3.000 mL ACN 0.78
25x-2 Combine 1.000 mL 25x-3 Stock con 3.000 mL ACN 0.2
25x-1 Combine 1.000 mL 25x-2 Stock con 3.000 mL ACN 0.049

Tabla 1: Preparación de 25 medias de me-IPA en ACN (en viales de vidrio ámbar de 8 ml).

Concentración (g/mL)
Id me-IPA et-IPA
4x-7 0.200 mL 25x-7 + 0.200 mL 25x Suplente + 0.850 mL ACN 32 1.6
4x-6 0.200 mL 25x-6 + 0.200 mL 25x Suplente + 0.850 mL ACN 8 1.6
4x-5 0.200 mL 25x-5 + 0.200 mL 25x Suplente + 0.850 mL ACN 2 1.6
4x-4 0.200 mL 25x-4 + 0.200 mL 25x Suplente + 0.850 mL ACN 0.5 1.6
4x-3 0.200 mL 25x-3 + 0.200 mL 25x Suplente + 0.850 mL ACN 0.12 1.6
4x-2 0.200 mL 25x-2 + 0.200 mL 25x Suplente + 0.850 mL ACN 0.031 1.6
4x-1 0.200 mL 25x-1 + 0.200 mL 25x Suplente + 0.850 mL ACN 0.008 1.6
4x-0 0.200 mL 25x Suplente + 1.050 mL ACN 0 1.6

Tabla 2: Preparación de 4 poblaciones de IPA en ACN (en viales de automuestrador de 2 ml).

Concentración (g/mL)
Id me-IPA et-IPA
Std 7 0.200 mL 4x-7 + 0.600 mL DI agua 8 0.4
Std 6 0.200 mL 4x-6 + 0.600 mL DI agua 2 0.4
Std 5 0.200 mL 4x-5 + 0.600 mL DI agua 0.5 0.4
Std 4 0.200 mL 4x-4 + 0.600 mL DI agua 0.13 0.4
Std 3 0.200 mL 4x-3 + 0.600 mL DI agua 0.03 0.4
Std 2 0.200 mL 4x-2 + 0.600 mL DI agua 0.0078 0.4
Std 1 0.200 mL 4x-1 + 0.600 mL DI agua 0.002 0.4
Std 0 0.200 mL 4x-0 + 0.600 mL DI agua 0 0.4
Blanco 0.200 mL ACN + 0.600 mL DI agua 0 0

Tabla 3: Preparación de las normas me-IPA en agua 75/25/ACN (en viales de automuestradedor de 2 ml).

Concentración (g/ml) en suero
Id me-IPA et-IPA
Control negativo 0.050 mL 25x Suplente + 0.950 mL Diluyente 0 10
Baja Fortificación 0.050 mL 25x Suplente + 0.020 mL 25x-4 + 0.930 mL Diluyente 1.2 10
Fortificación media 0.050 mL 25x Suplente + 0.030 mL 25x-6 + 0.920 mL Diluyente 30 10
Alta Fortificación 0.050 mL 25x Suplente + 0.020 mL 25x-7 + 0.930 mL Diluyente 80 10

Tabla 4: Fortificación de muestras de control de calidad (preparación en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml).

Cromatografía líquida:
Columna: C18, 2,1 x 50 mm, tamaño de partícula de 2,5 m
Temperatura de la columna: 70 oC
Volumen de inyección: 5 l
Caudal: 0.800 mL/min
Fase móvil: Disolvente A: 0.1% ácido fórmico en agua
Disolvente B: 0.1% ácido fórmico en ACN
Programa de degradado:
Tiempo (min): 0 0.25 2.25 2.26 3.4 3.41 4.75
% B: 40 40 55 100 100 40 40
Lavado con aguja: ACN, 3 s
Fuente MS/MS: ESI (modo negativo)
Temperatura del gas: 300 oC
Flujo de gas: 5 L/min
Nebulizador: 45 psi
Capilar: -4000 V
Tensión de la boquilla: -500 V
Temperatura del gas de la vaina: 250 oC
Flujo de gas de vaina: 7 L/min
Transiciones MRM:
Analito Ion precursor (m/z) Ion del producto (m/z) * Fragmentador (V) Energía de colisión (V) Tiempo de permanencia (ms) Segmento de tiempo
Me-IPA 556,6 428.7 74 12 60 2
126.9 65 60
126.8 61 60
Et-IPA 570.7 442.7 87 16 60
Segmentos de tiempo:
Segmento Inicio (min) Fin (min) Tipo Desviador Delta EMV Polaridad Datos almacenados
1 0 0,6 Análisis MS2 Para desperdiciar 0 Negativo No
2 0,6 2 Mrm A la Sra. -100 Negativo Sí
3 2 4.75 Escaneo MS2 Para desperdiciar 0 Positivo No
* Las transiciones del cuantificador están ennegrita.

Tabla 5: Parámetros LC-MS/MS. Los iones de producto de Quantifier están en negrita.

Objetivo Observado Por ciento
Id Día me-IPA me-IPA Recuperación
QC-1 1 0 Nd N/A
QC-2 1 0 Nd N/A
QC-11 2 0 Nd N/A
QC-12 2 0 Nd N/A
QC-21 3 0 Nd N/A
QC-22 3 0 Nd N/A
QC-31 4 0 Nd N/A
QC-32 4 0 Nd N/A
QC-3 5 0 Nd N/A
QC-4 5 0 Nd N/A
QC-13 1 1.25 1.26 101% Ave (10) 102%
QC-14 1 1.25 1.23 98,40% SD ? 3,50%
QC-23 2 1.25 1.26 101% % RSD ? 3,40%
QC-24 2 1.25 1.28 102%
QC-33 3 1.29 1.3 101%
QC-34 3 1.29 1.25 96,90%
QC-5 4 1.29 1.37 106%
QC-6 4 1.29 1.41 109%
QC-15 5 1.29 1.3 101%
QC-16 5 1.29 1.34 104%
QC-25 1 30.1 30.2 100% Ave (10) 103%
QC-26 1 30.1 31.2 104% SD ? 1,80%
QC-35 2 30.1 31.1 103% % RSD ? 1,70%
QC-36 2 30.1 31.1 103%
QC-7 3 31 31,6 102%
QC-8 3 31 31.4 101%
QC-17 4 31 32.5 105%
QC-18 4 31 32.8 106%
QC-27 5 31 31,7 102%
QC-28 5 31 32.1 104%
QC-37 1 80.2 77.8 97.00% Ave (10) 101%
QC-38 1 80.2 78.9 98,40% SD ? 2.30%
QC-9 2 80.2 81.8 102% % RSD ? 2.30%
QC-10 2 80.2 79.8 99,50%
QC-19 3 82.7 83.5 101%
QC-20 3 82.7 84 102%
QC-29 4 82.7 84.7 102%
QC-30 4 82.7 87.2 105%
QC-39 5 82.7 83 100%
QC-40 5 82.7 84.1 102%

Tabla 6: Resultados de qc para me-IPA en suero de mangosta (g/ml).

Objetivo y-IPA (g/mL) N Media (%) SD (%) % RSD
0 21
1.3 12 103 4.5 4.3
13 9 91.7 1.4 1.5
32 12 106 2.4 2.3
85 12 105 5.8 5.6
170 9 106 1.1 1.1

Tabla 7: Resultados de control de calidad para et-IPA en suero de mangosta (g/ml).

Tipo de cebo y concentración de cebo IPA etílico (g/ml)
Período de tiempo 0.4% - Blister 1.0% - Blister 0.14% - Matriz Control
Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N
Día 0 Nd 5 Nd 4 Nd 6 Nd 3
Día 1 13.7 (10.9) 2 11.2 (10.4) 4 20.6 (17.3) 2 Na Na
Día 7 11.5 (6.3) 6 9.9 (9.6) 4 21.4 (10.9) 6 Nd 3
Día 14 10.2 (5.2) 6 5.7 (2.5) 3 17.8 (10.2) 6 Nd 3
Día 21 8.9 (4.1) 4 10,0 (9,5) 4 23.8 (5.3) 3 Nd 2
Día 28 8.5 (3.9) 5 11.1 (10.6) 3 17.7 (9.3) 4 Nd 3
Día 35 17.0 (NA) 1 9.1 (9.0) 4 21.7 (9.3) 2 Nd 1
Día 42 Na 0 8.4 (8.5) 4 16.5 (NA) 1 Nd 2
Día 49 10.2 (5.8) 2 8.1 (8.4) 4 17.5 (4.7) 2 Nd 2
Día 56 10.9 (5.4) 2 3.8 (1.1) 3 17.6 (6.1) 2 Nd 2

Tabla 8: Media (desviación del soporte [SD]) concentración sérica etículo-IPA por tipo de cebo. ND - no detectado, NA - No aplicable.

Concentración de dosis y IPA metilo (g/ml)
Período de tiempo 0,04% 0,07% 0,14% Control
Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N
Día 0 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4
Día 1 7.8 (7.1) 4 22.2 (9.2) 4 29.1 (16.0) 4 ND (NA) 4
Día 7 4.4 (4.8) 4 14.4 (4.6) 4 21.3 (12.0) 4 ND (NA) 4
Día 14 5.7 (5.9) 4 12,0 (3,5) 4 19.6 (10.6) 4 ND (NA) 4
Día 21 4.9 (4.5) 4 12,0 (0,8) 3 18.3 (9.9) 4 ND (NA) 4
Día 28 5.4 (5.0) 4 9.8 (2.4) 4 16.4 (8.1) 4 ND (NA) 4

Tabla 9: Concentración sérica media (SD) metil-IPA por dosis. ND - No detectado, NA - No aplicable. Todas las concentraciones de IPA metilo se incorporaron a la matriz de cebo externo.

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Discussion

El método LC-MS/MS desarrollado para los estudios utilizó la selectividad de la monitorización de reacciones múltiples para cuantificar con precisión me-IPA y et-IPA en suero de mangosta. La selectividad de la detección de MS/MS también permitió un protocolo de limpieza simple que dependía únicamente de acetonitrilo para precipitar proteínas del suero antes del análisis.

Los ácidos iophenoxic son solubles en ACN pero son prácticamente insolubles en agua. Para excluir el agua de la extracción de ACN, se añadió cloruro de sodio para forzar una separación de fase de agua clara:ACN aumentando la fuerza iónica de la fase acuosa (suero). El ácido volátil ácido trifluoracético (TFA) también se añadió para asegurar que los ácidos iophenoxic fueron protonados durante la extracción y serían más fácilmente solubilizados en la fase ACN. El AFC se elimina durante el paso de secado antes del análisis de LC-MS/MS.

Los extraores de sangre de la mangosta fueron de aproximadamente 1 ml, produciendo 0,5 ml o menos de sueros. Para realizar análisis de réplica de cada muestra, se requirió un procedimiento de preparación de muestras a microescala que utilizara tubos de microcentrífuga en lugar de cristalería de laboratorio analítica típica, como pipetas volumétricas y matraces de clase A. Para lograr resultados precisos y precisos es necesario que los analistas sean competentes en el uso de jeringas de microlitros de vidrio y pipeteadores repetidos de desplazamiento positivo con puntas de tamaño microlitro.

Una limitación de este método es que requiere costosos instrumentos LC-MS/MS y analistas capacitados en su uso y mantenimiento. Sin embargo, debido a que me-IPA y et-IPA se resuelven en línea utilizando las condiciones de HPLC descritas, el método podría adaptarse potencialmente a un LCMS o HPLC de un solo cuadrúpolo con detector UV siempre que no se observaran interferencias.

La diferencia en las concentraciones séricas medias entre las mangostas que consumían cebos con et-IPA en el blíster y la matriz de cebo según la dosis de 2,8 mg sugiere derrame cuando el marcador está contenido en el blíster, en lugar de incorporarse a la matriz de cebo. Esto puede tener implicaciones con el propósito de estimar la vacuna en lugar de la aceptación de cebos. Por ejemplo, la incorporación del marcador en la matriz de cebo externa puede inflar la estimación de la cobertura de la vacuna si el animal come la matriz, pero la vacuna se derrama. Sin embargo, las restricciones reglamentarias pueden impedir la capacidad de mezclar un marcador biológico directamente con una vacuna dentro del blíster. En los casos en que se registró un consumo del <100%, tres casos fueron con cebos que contenían et-IPA en el blíster, dos de los cuales fueron la mayor concentración del 1%. Esto sugiere aversión al sabor potencial cuando et-IPA está en concentraciones más altas. Cuando los cebos que contenían 1% (20,0 mg) y-IPA incorporados en la matriz de cebos se ofrecieron a las mangostas, todos los animales rechazaron el cebo.

Las concentraciones medias de IpA para et- y me-IPA en el día 14 fueron de aproximadamente 17 y 19 g/ml, respectivamente. Investigaciones similares realizadas en el Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos, Ciudad Real, España, utilizando butilo y pentil-IPA encontraron concentraciones de día 14 de aproximadamente 45 y 10 g/ml en suero de mangosta cuando se entregan a la misma concentración y cebo formulación como en nuestro estudio. Estas diferencias sugieren que diferentes derivados de IPA pueden metabolizar a diferentes tasas en mangostas, que pueden ser útiles cuando la retención de marcadores (ya sea retención a corto o largo plazo) es una preocupación.

Las diferencias en la fisiología del sistema gastrointestinal pueden afectar la absorción y excreción de IPA en diferentes especies. La vida media de eliminación plasmática del IPA en gatos domésticos(Felis catus) cuando se administra a 1,5 mg/kg fue de 107 días, mientras que la tasa de zarigáceps de la cola de cepillo a la misma dosis fue de aproximadamente un día28. Cuando se administró IPA a cabras domésticas (Capra aegagrus hircus) a una tasa de dosis de 1,5 mg/kg, la vida media de eliminación terminal del IPA fue de 81 días, aunque los investigadores continuaron encontrando concentraciones elevadas de yodo hasta 160 días después de la administración 39. El sistema gastrointestinal de los miembros de Vivveridae (la familia a la que se habían asignado previamente las mangostas40)se describe como similar al del gato doméstico41,lo que puede explicar el tiempo de retención del IpA en Mangostas. La investigación también sugiere que el IPA puede metabolizarse de manera diferente en marsupiales, lo que permite una excreción más rápida que en la especie etériana29.

Ambos derivados del ITV evaluados en este estudio proporcionaron capacidad de marcado a largo plazo (4-8 semanas) en mangostas. El uso del IpA como marcador biológico en las mangostas debe tener en cuenta los objetivos del estudio y la duración deseada del marcado. En los casos en que los animales deben ser marcados desde los mismos sitios de estudio durante períodos de tiempo consecutivos, diferentes derivados del IPI podrían utilizarse para garantizar que los resultados de un evento de marcado no se confundan marcando durante eventos anteriores. Como parte de la ORV operativa para la vida silvestre en los Estados Unidos, el muestreo de las especies objetivo y las pruebas para la presencia de RVNA y biomarcador se lleva a cabo típicamente 4 a 6 semanas después de la distribución del ORV42. Desde un punto de vista práctico, parece que et- o me-IPA se pueden detectar fácilmente durante este período de tiempo. Sería útil una investigación futura para evaluar la función de descomposición de residuos en las mangostas ofrecidas a varias concentraciones de ambos congéneres de IPI evaluados en este estudio.

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Disclosures

Los autores AV y SO son empleados a tiempo completo de un fabricante de cebos de vacunas contra la rabia oral.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada en parte por el programa de investigación intramuros del Departamento de Agricultura, Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal de los Estados Unidos, Servicios de Vida Silvestre, Programa Nacional de Gestión de la Rabia y IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemania).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Inmunología e infección número 147 marcador biológico Herpestes auropunctatus ácido iophenoxic rabia mangosta india pequeña LC-MS/MS
Análisis de análogos de ácido iophenoxic en pequeña mangosta india (<em>Herpestes Auropunctatus</em>) Sera para su uso como un marcador biológico de vacunación de rabia oral
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Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

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