Det här protokollet beskriver generationen av blandade murina benmärgen chimärer med spontana autoimmuna stilbildande centrum, i vilka autoreaktiva lymfocyter bär photoactivatable grönt fluorescerande protein (PA-GFP) reporter. Detta ger möjligheten att länka cellulära läge i vävnader med nedströms molekylära och funktionella analyser.
Autoimmuna sjukdomar presentera en betydande hälsobörda. Grundläggande frågor om utveckling och progression av autoimmun sjukdom förblir obesvarade. Ett krav för framsteg i vår förståelse av de bakomliggande sjukdomsmekanismerna och cellulära dynamics är exakta kopplingen av microanatomical platsen för cell undergrupper med nedströms molekylär eller funktionella analyser; ett mål som har traditionellt varit svårt att uppnå. Utvecklingen av stabila photoactivatable biologiska fluorophores och deras integrering i reporter stammar har nyligen aktiverat exakt microanatomical märkning och spårning av cellulära delmängder i murina modeller. Här beskriver vi hur förmågan att analysera autoreaktiva lymfocyter från enda stilbildande centrum kan bidra till att ge nya insikter i autoimmunitet, med kombinationen av en roman chimära modell av autoimmunitet med en photoactivatable reporter som exempel . Vi visar ett förfarande för att generera blandat chimärer med spontana autoreaktiva stilbildande centrum befolkat av lymfocyter som transporterar photoactivatable grönt fluorescerande protein reporter. Använda i vivo märkning strategier, kan enda stilbildande centrum visualiseras i explanterad lymfvävnad och deras cellulära beståndsdelar photoactivated av 2-foton mikroskopi. Photoactivated lymfocyter från enda stilbildande centrum sedan kan analyseras eller sorterade flöde cytometrically, som enstaka celler eller i bulk, och kan bli föremål för ytterligare nedströms molekylära och funktionella analyser. Detta tillvägagångssätt kan direkt tillämpas för att ge förnyade insikter inom autoimmunitet, men förfarandet för att generera benmärgen chimärer och ljusaktivering förfarandet kan dessutom finner bred tillämpning i studier av smittsamma sjukdomar och tumören metastaser.
Incidensen av autoimmun sjukdom har ökat snabbt under de senaste decennierna, särskilt i västerländska samhällen. Idag, autoimmun sjukdom rankas tredje på listan över vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet i västvärlden1. Grundläggande frågor om utveckling och progression av autoimmun sjukdom förblir obesvarade. Ett krav för framsteg i vår förståelse av de bakomliggande sjukdomsmekanismerna och cellulära dynamics är exakta kopplingen av microanatomical platsen för cell undergrupper med nedströms molekylär eller funktionella analyser. Det senaste decenniet har har utvecklingen av ett antal stabila photoconvertible, photoactivatable eller photoswitchable biologiska fluorophores och deras integrering i reporter stammar möjliggjort den exakta microanatomical märkning och spårning av cellular undergrupper i murina modeller.
Kaede, en photoconvertible fluorescerande protein med ursprung från en stenig korallrev, genomgår irreversibla photoconversion från grön fluorescens till röd fluorescens vid exponering för violett eller ultraviolett ljus2. Initialt sysselsatt att följa enskilda celler i utveckla organotypic hjärnan skivor3dynamiska beteende, tillämpades generering av en Kaede inpressning mus därefter tillåtet övervakning cellulära rörelse i vivo och systemet till analyser av immunceller migration till och från lymfkörtlar4. Detta tillvägagångssätt var därefter raffinerade med en andra generationens reporter5. En liknande reporter är Kalopsida6, som användes nyligen till att spåra lymfkörtel metastaser i vivo7.
Första photoactivatable proteinet utvecklat var ett grönt fluorescerande protein (GFP) konstruerad med en enda punkt mutation (T203H), leder till en mycket låg absorbans i våglängdsområdet från 450 till 550 nm8. Efter ljusaktivering av ultraviolett ljus, detta photoactivatable grönt fluorescerande protein (PA-GFP) växlar absorption maximala från ~ 400 till ~ 500 nm, vilket ger en ungefärlig 100-faldig intensitet ökar när glada med en våglängd av 488 nm. Generering av transgena möss där alla hematopoetiska celler uttrycker PA-GFP tillåtna, för första gången, djupgående analyser av B cellmarkeringen i anatomiskt definierade ljusa och mörka zoner av germinal center9.
Ljusaktivering är en irreversibel omvandling från ett icke-fluorescerande tillstånd till ett fluorescerande tillstånd, och photoconversion är en enkelriktad övergång från en våglängd till en annan, är photoswitchable proteiner kunna transferservice mellan båda villkoren10 . Denna sistnämnda kapacitet var nyligen utnyttjas för att ingenjör optisk kontroll av protein aktivitet11.
Utnyttja den PA-GFP reportern, kännetecknas vi nyligen B cell repertoarer av enda stilbildande centrum i romanen modell av spontana lupusliknande autoimmunitet12. Denna modell är baserad på blandade chimärer med 1 del benmärgen härbärgerat en autoreaktiva B-cells receptor inpressning med specificitet för ribonuclear-proteinkomplex (564Igi13,14) kombinerat med 2 delar benmärg från någon önskad givare. På cirka 6 veckor post beredning uppnås homeostatiska villkor i vilka spontana autoreaktiva stilbildande centrum är närvarande i mjälten och kutan lymfkörtlarna. Särskilt, germinal center B cell befolkningen är nästan uteslutande (~ 95%) består av celler som härrör från icke-564Igi facket, och dessa wild-type-härledda B-celler har blivit autoreaktiva. Modellen kan därför en ‘plug-and-play’ metod för analyser av autoreaktiva germinal center B-celler med olika transgener, knock-outs och reportrar. Här beskriver vi proceduren för att skapa blandade chimärer med spontana autoreaktiva stilbildande centrum befolkat av lymfocyter som transporterar PA-GFP reportern. Använda i vivo märkning strategier, kan enda stilbildande centrum visualiseras i explanterad lymfvävnad och deras cellulära beståndsdelar photoactivated med två-foton Mikroskop. Photoactivated lymfocyter från enda stilbildande centrum kan därefter analyseras med flödescytometri eller sorterade efter fluorokrom-aktiverad cell sortering (FACS) och utsätts för ytterligare nedströms molekylära och funktionella analyser. Förmågan att analysera autoreaktiva lymfocyter från enda stilbildande centrum kan direkt tillämpas för att ge förnyade insikter inom autoimmunitet, men de tekniker och metoder som beskrivs kan dessutom hitta relevanta applikationer i studier av infektionssjukdomar och tumören metastaser.
Det finns ett stort antal murina modeller av autoimmunitet, varav många närvarande med spontana stilbildande centrum16. Men hysa många av de tillgängliga modellerna komplexa genetiska bakgrunder eller mutationer i centrala regulatorer av lymfocyter spridning eller aktivering, gör dem dåligt lämpade för intercrossing med reporter linjer och studier av normala lymfocyter beteende i autoimmunitet, respektive. Den nuvarande modellen, tvärtom gör en ‘plug-and-play’ strategi för fördjupade analyser av autoreaktiva wild-type-härledda germinal center B celler med valfri önskad kombination av transgener, knock-outs och reportrar, i förevarande fall företrädd av photoactivatable god Jordbrukarsed. Använda i vivo märkning strategier, kan enda stilbildande centrum visualiseras i explanterad lymfvävnad och deras cellulära beståndsdelar photoactivated med två-foton Mikroskop. Photoactivated lymfocyter från enda stilbildande centrum sedan kan analyseras eller sorterade flöde cytometrically, som enstaka celler eller i bulk. Dessa celler kan därefter genomgå ytterligare nedströms molekylära och funktionella analyser att ge förnyade insikter inom autoimmunitet.
Det finns några kritiska steg för framgångsrika resultat av proceduren. Som framgår av de representativa resultat, bestrålning (1.100 Rad) och givarens benmärg beredning framgångsrikt ersätta mottagarens benmärgen facket ger nästan komplett chimärism i B cell facket. Detta är en viktig punkt, som resterande mottagare-derived B-celler skulle göra en delmängd av befolkningens germinal center ‘mörk’. Oavsett källa används för bestrålning har dos/tidpunkten för bestrålning ska optimeras för att ge maximal myeloablativ effekt med minimal säkerheter vävnadsskada djuren. För beredning har av ben-crush protokoll och beredning med 20 miljoner givarnas totala celler befunnits kraftfullt ge hög beredning grader. Arbeta sterilt och kalla på is för benmärg utvinning säkerställer hög bärkraft donatorns benmärg. För att nå önskad donatorns benmärg nyckeltal, är det viktigt att iaktta stor försiktighet när räknar alikvoter av cellerna, både för den inventering själv och när du tar ut delprov i benmärgen för inventering. Blandning och samtidig pelletering av givare Sallater, i stället för centrifugering och omblandning separat och sedan blanda, tjänar till att förhindra någon skev i givaren kvot för cell räkna.
Den blanda benmärgen chimera generationen av protokollet kan stå ensam, och det gör generation av chimärer med autoreaktiva stilbildande centrum med önskad reporter, transgenens eller knock-out. Dock är en begränsning till detta behovet av att använda histologiskt givare. 564Igi stammen är på C57Bl/6J congenic bakgrund, och följaktligen, den andra donor(s) och mottagare bör ha en H-2b congenic bakgrund (eller alternativt 564Igi stammen bör vara backcrossed till önskad stammen och de autoimmun fenotypen verifierad på den nya bakgrunden). Förfarandet för bestrålning tenderar att gynna en tolerogena miljö17, och avvikelser i vissa mindre histocompatibility antigen kan tolereras. Dock bör denna aspekt noggrant övervägas, särskilt om blanda manliga och kvinnliga givare eller mottagare, på grund av potentialen för kvinnliga reaktivitet med hane-begränsad Y-antigener.
Likaså den ljusaktivering aspekten av protokollet kan stå ensam, och kan användas i många olika sammanhang. PA-GFP reportern är dock för närvarande endast tillgänglig med de promoveras av UBC som är aktiv i alla hematopoetiska härstamning celler, men inte i stromaceller. Som nämnts i inledningen, andra photoactivatable, photoswitchable eller photoconvertible reporter stammar finns, och PA-GFP, kan ersättas med lämplig justering experimentella betingelser.
Det är viktigt att undvika oavsiktlig ljusaktivering av oönskade områden, genom att upprätthålla lasern väl över 900 nm när imaging, som denna våglängd kommer inte photoactivate PA-GFP. Specifika inställningar, till exempel laser power och pixel dröjtiden, kommer att bero på djupet i vävnaden, de specifika vävnad som används och bildsystem för ljusaktivering själv, och varje program har ska optimeras för specifika imaging system används. Försiktighet bör iakttas inte till åldrad hud cellerna, men det är samtidigt viktigt att få effektiv ljusaktivering hela stacken, för att få en tillräcklig representation av aktiverade celler för nedströms analyser. Germinal center B celler utgör vanligen någonstans från 0,5% till ~ 2% av mjälten eller kutan lymfkörtel B celler, och som kan ses från de representativa resultat (figur 5), photoactivated enda germinal center B celler kan göra upp ~ 1% av totalen population som finns i ett enda mjälte segment. Framgångsrika analys eller sortering av ett betydande antal celler kräver därför behandlar ett stort antal händelser.
The authors have nothing to disclose.
SE Degn är Lundbeckfonden Fellow och en Carlsberg Foundation framstående kollega. Detta arbete var delvis dessutom stöds av en nnm biomedicinsk Grant (SE Degn).
Antibody, 9D11-A568 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255 | |
Antibody, 9D11-A647 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031 | |
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) | Biolegend | 144613 | |
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) | Biolegend | 142403 | |
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 | Biolegend | 102717 | |
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized | Fisher Scientific | 211766 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Conical tubes, 50 mL | Falcon | 352235 | |
Cover slip, square, 22×22 mm, 0.13-0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
Ethanol, 70% | VWR | 8301.360 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Flow cytometer, FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
Flow cytometer, LSRFortessa SORP | BD Biosciences | – | Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm) |
Grease, high vacuum, Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
Hemocytometer, Burker-Türk | VWR | 630-1544 | |
Isoflurane, IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) | Cedarlane | CL5035 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) | Sarstedt | 72.690.550 | |
Microscope, Two-photon | Prairie Technologies (now Bruker) | – | Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope |
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml | VWR | 410-0110 | |
NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
Needle, 18 gauge | BD Medical | 304622 | |
NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
PBS | Sigma | d8537 | |
Pestle homogenizer | VWR | 47747-358 | |
Pestle, unglazed, 175 mm | VWR | 410-0122 | |
Pipette, Serological, 10 ml | VWR | 612-3700 | |
Pipette, transfer, plastic | Sarstedt | 861,172,001 | |
Plastic paraffin film (Parafilm M) | Bemis | PM996 | |
Plate, 96-well | Falcon | 353910 | |
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91197-00 | |
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight | FST – Fine Science Tools | 91460-11 | |
Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
Syringe, 20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
Syringe, 5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
Syringe, Insulin, 0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml | MSD Animal health | 431577 | |
Trypan blue solution, 0.4% | VWR | K940-100ML | |
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |