一种分离和扩增人类脂肪衍生的美源性干细胞的无酶方法

Summary

该协议提供了一种无酶方法，用于使用外植方法从腹肌成形和脂质酶样本中分离中质性干细胞。没有苛刻的酶或离心步骤提供了临床相关的干细胞，可用于体外研究或转回诊所。

Abstract

中位干细胞 （MSCs） 是一种多能细胞，可以从各种成人和胎儿组织（包括脂肪组织）中分离出来。作为临床相关的细胞类型，需要最佳方法在体外分离和扩展这些细胞。大多数分离脂肪衍生MSCs（ADSCs）的方法都依赖于苛刻的酶，如胶原酶，来消化脂肪组织。然而，虽然这些酶能有效地分解脂肪组织并产生高ADSC回收率，但价格昂贵，可能对ADSC产生不利影响，包括临床应用中使用异种基因成分的风险。该协议详细说明了从没有酶的新鲜脂化和腹肌成形样品中分离ADSCs的方法。简单地说，这种方法依赖于任何散装组织的机械分离，然后是外植型培养系统。ADSC 允许从组织迁移到组织培养板上，之后 ADSC 可在体外培养和扩展，用于任意数量的研究和/或临床应用。

Introduction

中位干细胞 （MSCs） 是一类多能的成人干细胞，可以从各种成人和胎儿组织（包括脂肪组织）中分离出来。这些细胞是一个有吸引力的细胞类型，无论是基础研究和临床应用，由于其可塑性，分化成所有生殖层在体外细胞，跨越异体屏障，家炎症区，并抑制炎症（在谢尔曼等人^1）。脂肪衍生的MSCs（ASCs）特别有吸引力，因为它们易于获得，因为脂肪组织通常被认为是在常规抽脂和腹肌成形术后丢弃组织。然而，一旦获得，样品通常受到苛刻的条件 - 或酶条件或离心 - 以隔离ASCs^2，3。此方法说明了在没有苛刻的酶或离心步骤的情况下，使用外植方法隔离 ASC 的简单过程。

分离ASC的最常见方法包括清洗脂肪样品，用胶原酶酶酶消化样品，使样品离心，最后在培养ASCs⁴之前裂解红血球。虽然有效隔离高产量的ASC，使用异种基因成分（例如，酶消化胶原酶）被认为是超过"最小操纵"由美国食品和药物管理局，并可能构成风险，如免疫反应，禁止在诊所^5，6使用细胞。为了尽量减少异种性成分的风险，许多小组建议非动物衍生的，制造酶来消化脂肪组织。然而，这些酶仍然是苛刻的，并可以改变细胞表型^7。

其他隔离ASC的方法包括高速离心，使用高达1，200 x g的力，以及涡旋来隔离^ASC8。即使低至400 x g的力也足以隔离可行的ASCs^9。虽然这些细胞确实产生大量的活细胞，但许多协议未能在14^天8之后增殖。此外，机械分离产生的恢复细胞比酶消化少，但与其他细胞内源性到脂肪组织在通过^{0 10}时，分离细胞的ASCs比例更高。

在更纯净、更可行的ASC种群的隔离，加上异种成分的成本和风险，使得酶消化对临床的翻译的吸引力越来越小。虽然机械隔离最初是一种有利的方法，但所使用的方法存在显著差异，加工的组织体积仅限于专用离心单元的大小，并且可能取决于操作员的一致性²。

虽然酶消化和离心都迅速产生大量的ASCs，这些孤立的细胞显示型板状变化，产生关于他们的行为的问题，当返回到患者^2。因此，一些群体采用一种基于植物的ASC分离方法，即ASC从小块固体脂肪组织^3、11、12中迁移出来。这种迁移可能是细胞被吸引到营养丰富的介质的影响。与其他MSC种群一样，ASC坚持使用塑料，在用过的组织培养基（下称成分）中存活和增殖，允许它们从其他细胞类型与脂肪组织分离。虽然最初恢复的细胞较少——通常需要>1周，直到细胞在组织培养板上可见——这些未操纵的ASC将在体外增殖，允许细胞扩展到临床相关卷^{11、12、13。}

Protocol

罗格斯大学纽瓦克校区机构审查委员会（IRB）已批准使用脂吸性和腹肌成形性样品。

1. 组织培养的制备

1. 在隔离 ASC 之前，无菌地准备 500 mL 的组织培养培养。要制备培养基，在 Dulbeco 的最小必需介质 （DMEM） 中加入 10% 定义的胎儿小牛血清 （FCS） 和青霉素-链霉素 （10，000 U/100 mL）， 以及高葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺。介质可在 4°C 下存储长达 3 周，应始终使用加热（室温至 37°C）。
   1. 如果干细胞培养首选不同的介质，请改为准备该介质。

2. 从脂肪组织分离ASC

1. 获取脂吸量或腹肌成形样品。IRB批准后，按照各种外科手术获取丢弃组织等样本。将脂吸气者运送到实验室，无论外科医生在哪个容器内取出组织;在手术室标本袋或容器中运输腹肌切片。
2. 如果不立即处理，将样品在室温下储存长达 6 小时或 4°C，长达 24 小时。超过上述时间处理的组织样本可能会降低细胞产量。通过添加1x无菌磷酸盐缓冲盐水，保持腹膜成形样品湿润。
3. 从此时起，在无菌条件下，在层流罩中执行所有步骤。戴手套以进行人身保护。保持10%的漂白剂，70%的乙醇，和纸巾附近，以迅速清理任何生物泄漏。将任何多余的组织作为生物医学废物处理。
4. 将样品切成 < 1 mm 件。如果腹肌块太大，无法使用，则在切碎之前，将可管理的组织大小从块中切下。将腹肌整形组织转移到无菌 100 mm 板的盖子上。使用无菌针头将一块组织放在原位，并使用无菌手术刀将大块切碎，通过切割或轻轻切碎散装组织来切碎。
   1. 脂分子通常不需要此步骤。然而，如果在脂蛋白中观察到大组织块，用无菌钳子去除这些块，并按照上述处理。
5. 将组织转移到新鲜的管子中，将样品反转或摇动 5~6 次，以确保所有层的混合。可选：如果脂吸气已完全稳定，在混合前取出并丢弃油层。
6. 将2.5~5 mL的组织转移到100毫米真空-气体血浆处理的组织培养板（材料表）。通过倒入新的离心管测量样品的体积。如有必要，使用无菌铲子帮助转移组织。
7. 向板中加入同等体积的组织培养培养物。轻轻旋转板以混合内容物。
8. 在5%CO₂中孵育37°C的拍片，直到在板的底座上看到足够数量的细胞。随着时间的推移，细胞会从组织内迁移到板表面，此时它们会粘附在塑料上。当细胞离开组织时，细胞会以组织碎片周围的小簇出现。
9. 每 24 小时，清除尽可能多的液体，并更换具有类似数量的介质。如果可能，将组织块留在原位。
10. 一旦在板上记录到足够数量的细胞（>10组>15-25个细胞在板上）或7天后（以较早者为准），取出所有剩余的组织。
11. 在组织培养基培养基培养中培养ASC，直到它们达到70%的汇合，或直到簇变得致密（在板上有5个密集的细胞簇，每个细胞的直径约为>500 μm），此时细胞将被传递。

3 ASC 文化

1. 当母板达到约 70% 的汇合时，通过 ASC。注意避免 ASC 区域性的汇合。
2. 用1倍磷酸盐缓冲盐水轻轻冲洗盘子，并试穿粘附细胞。为了试穿细胞，吸出磷酸盐缓冲盐水，并在每个板中加入1 mL的0.25%EDTA的胰蛋白酶，并在37°C孵育5分钟。5分钟后，通过显微镜确认去粘坚持。如果细胞仍然粘附，将细胞返回到孵化器再延长5分钟。
3. 向板中加入少量介质（约占试金总体积的 25%），以停用胰蛋白酶，并使用介质/胰蛋白酶轻轻清洗板底。要洗净板，请以轻微角度握住板，然后轻轻地将介质/胰蛋白酶从板顶部向下移移，从板上松开任何每周连接的细胞。细胞可以以1：3的比例重新镀层，或以每板120，000-500，000个细胞的密度播种。
   1. 如果根据细胞计数进行播种，将胰蛋白酶/培养基从板转移到圆锥形离心管中，并在300 x g下离心7分钟，将细胞悬浮在组织培养基中（每个初始板约1 mL），并在播种前对细胞进行计数。要对细胞进行计数，将细胞悬浮液的 10 μL 转移到血细胞计中，并计算网格每个角落的 4 x 4 象限中的细胞。将这些值平均一起，并将该值乘以 10⁴以计算单元格数。
   2. 在播种细胞之前，向板中添加介质。以滴落的方式加入细胞，然后旋转板，以确保均匀分布在板上。
      注：在3个通道后，附着细胞应出现不对称和主轴形状。ASC表型和行为可以通过流式细胞测定和分化测定来确认。
4. 使用流式细胞测定和微分测定确认ASC表型和行为
   1. 流动细胞仪
      1. 如上所述，收集和颗粒细胞。用1倍磷酸盐缓冲盐水清洗颗粒，用制造商推荐的抗体量标记细胞。流动细胞学的详细方案，一种常见的实验室程序，可以在这里找到12，14，15。
      2. 从下面选择表面标记面板以确认 ASC 表型：CD14、CD31、CD34、CD45 和 CD106 的负极;CD29、CD36、CD44、CD73、CD90 和 CD105^{16、17、18、19}。CD36的存在和CD106的缺失从骨髓衍生的^MSCs20中分辨ASCs。
   2. 差别化检测：使用MSC分化试剂盒确认多系分化。多个制造商提供试剂盒，用于确认异质性、骨性和软骨性分化能力。根据制造商的协议，每 3⁄4 天更换一次套件提供的介质，为期 3 周或直到观察到形态分化。
5. 培养多个段落的细胞;所需的段落数量取决于应用程序。在每个段落中，使用上述细胞表面标记确认MSC细胞形态和表型，并确保多系分化能力没有丧失。虽然捐助者的扩张潜力不同，但大多数样本可以扩大至多6-9个段落。
6. 冷冻保存细胞并储存在液氮中，以供将来使用。

4 ASC 的冷冻保存

1. 准备 10 mL 的冷冻溶液 A 和 B。
   1. 对于冷冻溶液A，在高血糖的DMEM中加入20%的FCS。
   2. 对于冷冻溶液B，在高血糖的DMEM中加入20%的FCS和20%的二甲基硫化物（DMSO）。
2. 在300 x g下离心5分钟，将细胞悬浮在少量冷冻溶液A中，并使用血细胞计对细胞进行计数，如步骤3.3.1。
3. 计算细胞被重新悬浮的最终体积，最终细胞浓度达到500，000~1，000，000细胞/mL。使用冷冻溶液 A 将颗粒重新悬浮到最终体积的 50%。缓慢地加入相等体积的冷冻溶液B滴落，同时搅拌管达到最终细胞浓度。
4. 立即将细胞冷冻在1⁄2 mL冷冻室中。将冷冻液冷冻在受控速率的冰柜或置于-80°C的冷冻容器中，使温度降低1°C/分钟。在受控冷冻（冷冻容器过夜）后，将细胞转移到液氮中，以便长期储存。

Representative Results

使用此处详细介绍的方法，ASC 成功地从脂质和腹肌成形性样本中分离出来（图 1）。在三个通道后，分离的细胞被发现具有MSC形态（不对称，主轴形状）和表型，类似于酶消化后的ASC（图2）。我们小组和其他小组先前的研究表明，这些ASC与其他MSC一样分化成脂肪细胞、骨细胞和神经元，包括通过其他方法^{分离的ASCs11，21。}

在大多数情况下，ASC 迁移到组织培养板可以在 3-5 天内通过明亮的场显微镜进行可视化。但是，在某些情况下，只有稀疏的单元格在 7 天后可见。在极少数情况下，细胞不会迁移到板上和/或不会增殖，直到第三通道。这一结果通常与组织样本处理延迟相关。

图1：ASC分离与腹肌成形和脂量样品的原理表。在常规外科手术后，作为弃置组织获得腹肌和脂吸血样品。Abdominoplasty样品被切碎，之后在组织培养基中，将腹肌成形或脂花样作为外植。ASC 从组织中迁移出来，向营养丰富的介质迁移。1周后，去除外植，并培养ASCs，用于下游实验和/或临床应用。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：具有MSC形态和表型的隔离ASC。通过无酶、除植方法分离的ASCs在通道3处具有MSC形态和表型。（A） 与其他 MSC 一样，这些 ASC 具有不对称的主轴形状，无论是通过外植方法还是酶法（例如胶原酶）进行隔离。使用酶法分离的ASCs与分离的ASC相比，产生更长、更窄的形态;后者更接近于从其他无酶分离方法衍生的MSCs，如骨髓衍生MSCs.（B）与其他MSCs一样，分离的分离ASC对CD45为阴性，对CD73、CD90和CD105为正。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

ASC 是 MSC 的一个有吸引力的来源，因为组织易于访问。对于临床和研究应用，科学家在隔离和培养这些细胞时必须牢记捐赠者的变异性。由于尚未阐明的原因，来自不同捐助者的MSC表现出不同的体外增殖能力，这将随后影响ASC从脂肪外移和扩散能力中迁移。虽然从这些无酶外植株分离的ASCs达到汇合时间可以观察到变异性，但样品在体外不增殖的情况很少。

除了供体变异性之外，细胞在组织外迁移和/或体外增殖的最可能来源是组织在加工前储存的时间长度。当样品在加工前可坐至>12h时，或在收获和加工之间未保持湿润时，观察到较差的迁移和增殖率。唯一经常未能增殖的样本是未用盐水溶液保持湿润的腹肌分体样品：在这些情况下，组织块中心的组织通常足够潮湿，需要处理，但偶尔需要丢弃。因此，通过加工保持组织在收获时保持湿润至关重要。

在1周标记处未在板上观察到ASC的情况下，仍应从组织培养板中取出脂肪外植，以免发生组织坏死。有时，细胞太少，难以识别，但少数细胞能够在培养系统内扩展。如果细胞在3周内仍未观察到，隔离应视为失败。

在某些情况下，特别是腹肌整形，由于手术领域的局限性，不可能获得真正的无菌样品。如果无法使用无菌容器将组织从手术室运送到层流罩，则去除组织外部 1 厘米通常足以防止微生物污染。如果腹肌成形性样品附着在皮肤上，可以使用70%的乙醇擦拭皮肤，在切碎脂肪组织之前对表面进行消毒。

在切碎过程中，将组织切成小块，切成细碎，这一点至关重要。如果外植量过大，ASC 的表面面积将不足以从组织迁移到板中。此外，至关重要的是，组织不要留在板中任何时间超过必要的，以免组织成为坏死。

此方法的一个限制是使用酶（在所述协议中，胰蛋白酶）在组织培养过程中分离 ASCs。其他非动物衍生酶，如阿库塞酶，可以替代，以消除动物衍生产品的需求，然而，这将增加组织培养的成本。为此，许多团体正在研究非二维组织培养方法，如生物反应器和脚手架系统，以增加MSC的生长潜力，同时尽量减少从基质^{分离细胞22}的需要。

将 ASC 转移到诊所时，植物外移隔离方法的一个主要限制是依赖于良好的制造实践 （GMP） 水平组织培养设施，而许多医疗中心缺乏这种设施。在这些情况下，需要采用任何自封闭、基于酶或离心的方法。然而，随着GMP设施越来越普遍，这种影响预计会受到限制。同时，即使缺乏GMP组织培养设施的此类设施也可以考虑使用外植方法在体外研究ASCs：操作越少，这些细胞就越类似于体内的同类细胞^。

该方法提供了一种简单的方法，在没有苛刻的酶或离心步骤的情况下，将ASCs从脂肪组织（包括脂吸气和腹肌）中分离出来。虽然ASCs的初始产量低于其他方法，但ASC将在体外增殖，从而最大限度地减少初始产量降低的影响。缺乏过度或有力的操作使得ASCs以特别相关的方式被隔离，因为问题较少（即观察到的效果是细胞本身还是细胞在隔离过程中的操纵造成的).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 tissue culture plates	Corning	Corning
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	serum is batch tested to ensure it supports MSC growth
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049