Medicine

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

Published: December 16, 2019 doi: 10.3791/59419

Lauren S. Sherman^1,2, Alexandra Condé-Green³, Yahaira Naaldijk¹, Edward S. Lee³, Pranela Rameshwar^1,2

¹Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, ²Rutgers School of Graduate Studies at New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, ³Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה נטולת אנזימים לבידוד תאי גזע mesenchymal מ מתיחת בטן ודגימות ליפוף באמצעות שיטת החקור. העדר אנזימים קשים או צעדים צנטריפוגה מספק תאי גזע רלוונטיים קלינית שניתן להשתמש בהם למחקרים בתוך מבחנה או להעביר חזרה למרפאה.

Abstract

תאי גזע של mesenchymal (MSCs) הם אוכלוסיה של תאים רב-עוצמה שניתן לבודד מרקמות מבוגרים ועוברי שונות, כולל רקמת אדיפוז. כסוג תא רלוונטי קלינית, יש צורך בשיטות אופטימליות כדי לבודד ולהרחיב תאים אלה בתוך מבחנה. רוב השיטות לבידוד MSCs נגזרות (ADSCs) מסתמכות על אנזימים קשים, כגון קולגן, כדי לעכל את הרקמה האדיפוז. עם זאת, בעוד יעיל בפירוק רקמת האדיפוז ומניב שחזור ADSC גבוה, אנזימים אלה הם יקרים יכול להיות השפעה מזיקה על ADSCs-כולל את הסיכונים של שימוש ברכיבים xenoic ביישומים קליניים. פרוטוקול זה מפרט שיטה לבידוד ADSCs מדגימות מחדש ומתיחת בטן ללא אנזימים. בקצרה, שיטה זו נשענת על פירוק מכני של כל רקמת בתפזורת ואחריו מערכת תרבות סוג הסבר. ADSCs מותר לנדוד מתוך הרקמה אל צלחת תרבות הרקמה, לאחר מכן ADSCs יכול להיות תרבותי והתרחב בתחום החוץ עבור כל מספר של מחקר ו/או יישומים קליניים.

Introduction

תאי גזע של mesenchymal (MSCs) הם מחלקה של תאי גזע בוגרים רב-עוצמה, הניתנים לבידוד מרקמות מבוגרות ועוברי שונות, לרבות מרקמת אדיפוז. תאים אלה הם סוג תא אטרקטיבי הן מחקר בסיסי יישומים קליניים בשל הפלסטיות שלהם כדי להבדיל לתאים של כל שכבות הנבט בתחום החוץ, מחסומים האלוגנאית הצלב, הבית לאזורים של דלקת, ולדכא דלקת (נבדקו בשרמן, ואח '¹). אדיפוז-נגזר MSCs (ASCs) הם מושכים במיוחד בשל קלות הבידור שלהם, כמו רקמת האדיפוז נחשב בדרך כלל רקמת המחיקה בעקבות שאיבת שומן שגרתית וניתוח מתיחת בטן. עם זאת, לאחר שהושג, הדגימות הן בדרך כלל בתנאים קשים – או במצב אנזימטי או צנטריפוגה-כדי לבודד את ה-ascs²^,³. שיטה זו ממחישה הליך פשוט לבידוד של ASCs באמצעות שיטת הבדיקה, בהיעדר שלבים אנזימטיים או צנטריפוגה קשים.

השיטה השכיחה ביותר לבידוד ASCs כוללת שטיפת מדגם אדיפוז, לעכל את המדגם עם הקולגן, לתפרידו את המדגם, ולבסוף לשיר את תאי הדם האדומים לפני הקריאה של ASCs⁴. בעוד שהוא יעיל בבידוד תשואה גבוהה של ascs, השימוש ברכיבים xenog (למשל, העיכול האנזימטי עם הקולגן) נחשב ליותר מאשר "מניפולציות מינימלית" על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני, ועלול להוות סיכונים כגון תגובה חיסונית, האוסר על שימוש בתאים במרפאה⁵^,⁶. כדי למזער את הסיכונים של הרכיבים הקסנוגנניים, קבוצות רבות הציעו שאינן בעלי חיים נגזרות, ומייצרים אנזימים כדי לעכל את הרקמה האדיגית. עם זאת, אנזימים אלה עדיין קשים, והוא יכול לשנות את התא פנוטיפ⁷.

שיטות אחרות של בידוד ASCs כוללות צנטריפוגה במהירות גבוהה, באמצעות כוחות גבוה כמו 1,200 x g, ו vortexing כדי לבודד את ascs⁸. אפילו כוחות נמוך כמו 400 x g היו מספיקים בבידוד בעלי קיימא⁹. בעוד תאים אלה מייצרים כמות גדולה של תאים קיימא, פרוטוקולים רבים לא הצליחו להתרבות מעבר 14 ימים⁸. עוד, בידוד מכני מניב תאים פחות משוחזרים מאשר עיכול אנזימטי, אך חלק גבוה יותר של תאים מבודדים היו ASCs לעומת תאים אחרים אנדוגניים לרקמת האדיפוז במעבר 0¹⁰.

בידוד של אוכלוסייה טהורה ומעשית יותר של ASCs בפחות זמן, ביחד עם העלות והסיכונים של רכיבים xenoic, הופך את העיכול האנזימטי פחות ופחות מושך לתרגום למרפאה. בעוד בידוד מכני היא בתחילה גישה חיובית, יש פער משמעותי בשיטות המשמשות, ואת נפח הרקמה מעובד מוגבל לגודל של יחידות צנטריפוגלי המקצועית, והוא יכול להיות תלוי עקביות מפעיל².

בעוד העיכול האנזימטי והצנטריפוגה מפיקות במהירות נפח גבוה של ASCs, התאים הבודדים האלה מציגים שינויים פנוטיתיים, מניבים שאלות על התנהגותם כאשר הם חוזרים למטופל². השיטה המבוססת על הדרך לבידוד עולה, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, מועסק על-ידי חלק מהקבוצות, ולפיה הארגון יוצא מפיסות קטנות של רקמת אדיפוז מוצקה³^,¹¹^,¹². הגירה זו עשויה להיות השפעה של התאים הנמשכים למדיה העשירה התזונתיים. כמו אוכלוסיות אחרות של MSCs, ASCs לדבוק פלסטיק, ולשרוד ולהתרבות בתוך מדיה תרבותית רקמה משומשים (רכיבים להלן), המתיר הבידוד שלהם משאר סוגי התא מן הרקמה האדיפוז. בעוד תאים פחות הם התאושש בתחילה-לעתים קרובות לוקח > 1 שבוע עד התאים גלויים על הלוח התרבות רקמה-מניפולציות אלה ascs יהיה להתרבות בתוך מבחנה, המתיר התרחבות של התאים לכרכים רלוונטיים קלינית¹¹^,¹²^,¹³.

Protocol

השימוש בדגימות ניתוח מתיחת בטן ובניתוח שטרם אושרה על-ידי לוח הסקירה המוסדי (IRB) של אוניברסיטת רטגרס-קמפוס ניוארק.

1. הכנת מדיה לתרבות רקמות

Sterilely להכין 500 mL של מדיה תרבות רקמות לפני בידוד ASCs. כדי להכין את התקשורת התרבותית, להוסיף 10% סרום עגל העוברי (FCS) ו-פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/100 mL) למדיה חיוניים מינימלית של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז גבוה 2 מ"מ L-גלוטמין. התקשורת יכולה להיות מאוחסנת ב-4 ° צ' עד 3 שבועות, ויש להשתמש בה תמיד חם (בין טמפרטורת החדר עד 37 ° c).
1. אם מדיה אחרת מועדפת לתרבות של תאי הגזע, הכינו במקום זאת את המדיה.

2. בידוד של הפקולטה לרקמה מאדיפוז

השג ליפופה או דגימת מתיחת בטן. לאחר אישור IRB, לקבל דגימות כאלה כמו למחוק רקמות בעקבות הליכים כירורגיים שונים. העברת הליחות למעבדה בכלי הניתוח שהמנתח הסיר את הרקמה; מתיחת בטן בחדר ניתוח או במיכל.
אחסן את המדגם (ים) בטמפרטורת החדר עבור עד 6 מעלות צלזיוס או ב-4 ° צ' עד 24 שעות אם לא מעבדים באופן מיידי. דגימות רקמות מעובדות מעבר למועדים הנ ל צפוי להיות התשואה התאים פחתה. שמרו דגימות מתיחת בטן לחות על-ידי תוספת תמיסת מלח באגירה סטרילית מבית 1x.
מנקודה זו ואילך, המשך את כל הצעדים בתוך כיסוי הזרימה המבינארי בתנאים אספטי. לבש כפפות להגנה אישית. לשמור על 10% אקונומיקה, 70% אתנול, ומגבות נייר סמוך כדי לנקות במהירות כל דליפת ביולוגי. נפטר מרקמה עודפת. כפסולת ביו-רפואית
האוהב את הדגימות לתוך < חתיכות 1 מ"מ. אם בלוק ניתוח הבטן גדול מכדי לעבוד עם, לחתוך גודל של רקמות להיות מחוץ לבלוק לפני המינסינג. העבר את רקמת מתיחת הבטן למכסה של צלחת 100 מ"מ סטרילית. השתמש מחט סטרילית להחזיק פיסת הרקמה במקום ולהשתמש אזמל סטרילי כדי לחזק את החלקים על ידי חיתוך או בעדינות גריסה של רקמות בצובר.
1. שלב זה אינו נדרש בדרך כלל עבור ליפופי. עם זאת, אם נתחי רקמות גדולים הם נצפו בתוך ליפוף, להסיר חתיכות כאלה עם מלקחיים סטרילי תהליך כמו לעיל.
להעביר את הרקמה לצינור טרי להפוך או לנער את המדגם 5 – 6 פעמים כדי להבטיח ערבוב של כל השכבות. אופציונלי: אם ליפוף התיישבו במלואו, להסיר ולמחוק את שכבת הנפט לפני ערבוב.
העברה 2.5 – 5 מ ל של רקמות לצלחת העיבוד פלזמה של 100 mm גז ואקום (טבלת חומרים). למדוד את נפח המדגם על ידי לשפוך לתוך צינור צנטריפוגה טרי. אם יש צורך, השתמשו במרית סטרילית כדי לסייע בהעברת הרקמה.
הוסף נפח שווה ערך של מדיית תרבות הרקמה לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת לערבב את התוכן.
מודקת את פאטה ב 37 ° צ' ב 5% CO₂ עד מספר מספיק של תאים נראים על בסיס הצלחת. עם הזמן, התאים יועברו מתוך הרקמה על פני השטח צלחת, ובנקודה זו הם לדבוק פלסטיק. כאשר הם יוצאים הרקמה, התאים יופיעו כאשכולות קטנים סביב חתיכות הרקמה.
כל 24 שעות, להסיר כמה שיותר נוזלי ולהחליף עם כמות דומה של מדיה. השאירו את פיסות הרקמה במקום, אם אפשר.
לאחר מספר מספיק של תאים מצוין על הצלחת (> 10 אשכולות של > 15 – 25 תאים על הצלחת) או לאחר 7 ימים, לפי מוקדם יותר, להסיר את כל החלקים הנותרים של רקמות.
התרבות ASCs במדיה התרבות רקמות עד שהם מגיעים 70% השטף או עד האשכולות להיות צפוף (> 5 אשכולות צפופים של תאים על הלוח, כל אחד עם קוטר של כ > 500 μm), ובשלב זה התאים הם להיות החוצה.

3 התרבות של ASCs

העבר את ה-ASCs כאשר לוחית ההורה מגיע כ 70% שליטה. שמור על עצמך להימנע משטף של התרבויות עולה.
שטפו בעדינות את הצלחת עם מלוחים באגירה של 1 x פוספט וטריזיציזציה לתאים החסיד. לטריזיסיזציה של התאים, מוחלק את תמיסת המלח באגירה ומוסיפה 1 מ ל טריפסין עם 0.25% EDTA לכל צלחת ו מודרת ב 37 ° c עבור 5 דקות. לאחר 5 דקות, אשרו הדבקות במיקרוסקופיה. אם התאים עדיין מחסיד, להחזיר את התאים לחממה עבור 5 דקות נוספות.
הוסיפו כמות קטנה של מדיה (כ -25% מכמות הטריפסין הכוללת) לצלחת לבטל את הטריפסין, ולשטוף בעדינות את בסיס הצלחת באמצעות המדיה/טריפסין. כדי לשטוף את הצלחת, החזיקו את הצלחת בזווית קלה ומצנקת בעדינות את המדיה/טריפסין מראש הלוחית כלפי מטה, ומתרופפות כל תא שבועי מהצלחת. התאים יכולים להיות מצופה מחדש ביחס 1:3 או הנזרע בצפיפות של 120000 – 500000 תאים לכל צלחת.
1. אם זריעה מבוסס על ספירת תאים, להעביר את טריפסין/מדיה מן הצלחת לתוך צינור צנטריפוגה חרוט, ואת הגלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 7 דקות. להשעות את התאים במדיה של תרבות רקמות (כ 1 מ"ל לכל לוחית הראשונית) ולספור את התאים לפני זריעה. כדי לספור את התאים, להעביר 10 μL של ההשעיה התא לתוך ה, ולספור את התאים הנמצאים 4 x 4 הרביע בכל פינה של הרשת. ממוצע ערכים אלה יחד והכפל את הערך ב-10⁴ כדי לחשב את מספר התא.
2. הוסף מדיה ללוח לפני זריעת התאים. להוסיף את התאים באופן dropwise ולאחר מכן מערבולת את הצלחת כדי להבטיח הפצה אפילו על פני הצלחת.
  הערה: לאחר 3 מעברים, התאים החסיד אמורים להופיע א-סימטרי וצורת ציר. פנוטיפ עולה והתנהגות ניתן לאשר באמצעות הזרמת cy, לנסות בידול.
אישור של פנוטיפ והתנהגות באמצעות הזרמת cy, ובידול מוסר
1. ציטומטלי זרימה
  1. איסוף והגלולה התאים כמתואר לעיל. לשטוף את הפלטד עם מלוחים 1x פוספט באגירה ולתייג את התאים עם מומלץ ליצרן כרכים של נוגדן. פרוטוקול מפורט להזרמת cy, הליך מעבדה נפוץ, ניתן למצוא כאן¹²^,¹⁴^,¹⁵.
  2. בחר לוחות סמן משטח מתוך הפעולות הבאות כדי לאשר את הפנוטיפ עולה: שלילי עבור CD14, CD31, CD34, CD45 וCD106; וחיובי לCD29, CD36, CD44, CD73, CD90 ו-CD105¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. הנוכחות של CD36 והיעדרות של CD106 להבחין ASCs מ מח עצם-נגזר MSCs²⁰.
2. בידול אספאומר: לאשר בידול רב שושלת באמצעות ערכת בידול MSC. ערכות זמינים מיצרנים מרובים כדי לאשר אדיפוגניים, אוסטגניים, כונדרוגניים קיבולת הבידול. לשנות את ערכת המדיה סיפק כל 3 – 4 ימים לפי הפרוטוקולים של היצרן עבור 3 שבועות או עד מורפולוגית הבידול הוא נצפתה.
מתרבות תאים למעברים מרובים; מספר המעברים הדרושים יהיה תלוי ביישום (ים). בכל מעבר, לאשר את מורפולוגיה התא MSC ופנוטיפ באמצעות סמני פני השטח התא הנ ל, ולהבטיח קיבולת בידול רב השושלת לא אבדו. בעוד הפוטנציאל ההתרחבות שונה בין תורמים, רוב הדגימות ניתן להרחיב עד 6-9 מעברים.
קריופלקס התאים ולאחסן בחנקן נוזלי לשימוש עתידי.

4 הקריוגנית של ASCs

הכינו 10 מ ל של פתרונות הקפאה A ו-B.
1. עבור פתרון הקפאה A, להוסיף 20% FCS כדי DMEM זיכרון עם גלוקוז גבוה.
2. עבור פתרון הקפאה B, להוסיף 20% FCS ו 20% diמתיל גופרתי (DMSO) ל-DMEM זיכרון עם גלוקוז גבוה.
גלולה התאים על ידי תפרידו ב 300 x g עבור 5 דקות. השהה מחדש את התאים בנפח קטן של פתרון הקפאה a ולספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר כמו בשלב 3.3.1.
חשב את אמצעי האחסון הסופי שבהם התאים יהיו מושעים מחדש כדי להגיע לריכוז התא הסופי של 500000 – 1000000 תאים/mL. השתמש בפתרון הקפאה A כדי להשעות מחדש את הגלולה ב 50% של הכרך הסופי. הוסיפו באיטיות את הנפח השווה של פתרון ההקפאה B בזמן שהוא מתחשל בצינור כדי להגיע לריכוז התא הסופי.
הקפא מיד את התאים ב-1-2 מ ל קריובקבוקונים. הקפא את הקריובקבוקונים במקפיא בקצב מבוקר או במיכל קפוא הממוקם ב-80 ° c, המקטין את הטמפרטורה ב-1 ° c/min. בעקבות ההקפאה מבוקרת (לילה עבור מכולה קופא), להעביר את התאים חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

Representative Results

באמצעות השיטה המפורטת כאן, ASCs מבודדים בהצלחה מדגימות ליפוף ומתיחת בטן (איור 1). לאחר שלושה מעברים, נמצאו התאים המבודדים הינם בעלי מורפולוגיה של MSC (א-סימטרי, צורת ציר) ופנוטיפ, בדומה למצב של מעקב אחר העיכול האנזימטי (איור 2). מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו ואחרים הראו ascs אלה להבדיל לתוך אדיפוציטים, אוסטאופציטים, ונוירונים כמו MSCs אחרים, כולל ascs מבודדים על ידי אמצעים אחרים¹¹^,²¹.

ברוב המקרים, הגירה ASCs על צלחת תרבות הרקמה יכול להיות דמיינו בתוך 3-5 ימים על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. עם זאת, במקרים מסוימים, רק תאים דלילים יהיו גלויים לאחר 7 ימים. במקרים נדירים, התאים לא יועברו אל הצלחת ו/או לא להתרבות עד המעבר השלישי. תוצאה זו מהווה בדרך כלל הקשר עם עיכוב בעיבוד דגימת הרקמה.

איור 1: ייצוג סכמטי של בידוד באמצעות מתיחת בטן ודגימת ליפוף. מתיחת בטן ודגימות ליפוחות הושגו כרקמה מחיקת הליכים כירורגיים שגרתיים. ניתוח מתיחת בטן היתה מגורעת, ולאחר מכן או מתיחת בטן או ליפוף הדגימות היו מצופה כאקסוצמחים במדיה של תרבות הרקמה. ה-ASCs היגרו מתוך הרקמה, לכיוון התקשורת העשירה התזונתיים. לאחר 1 שבוע, explants הוסרו ו ASCs תרבותי עבור ניסויים במורד הזרם ו/או יישום קליני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ASCs מבודדים עם מורפולוגיה MSC ופנוטיפים. ASCs בודד על ידי שיטת ההסבר ללא אנזים, יש מורפולוגיה ופנוטיפים במעבר 3. (א) כמו MSCs אחרים, בעלי מדעי הבית הללו הינם בעלי צורת ציר א-סימטרית, בין אם מבודדים בשיטת ההסבר או האנזימטית (למשל, קולגנאז). ה-ASCs המבודד באמצעות שיטת האנזים מהניב מורפולוגיה ארוכה וצרה יותר לעומת ה-ASCs המבודד; השני קרוב יותר דומה MSCs נגזר שיטות אחרות בידוד נטול אנזימים, כגון מח עצם נגזר-MSCs. (ב) כמו MSCs אחרים, ascs מבודדים מבודדת הם שליליים עבור CD45 וחיובי עבור CD73, CD90, ו CD105. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ASCs הם מקור אטרקטיבי של MSCs בשל גישה קלה של הרקמה. עבור יישומים קליניים ומחקר הן, מדענים חייבים לשאת השתנות תורמים המוח כאשר בידוד ו culturing תאים אלה. מטעמים שטרם הובהר, MSCs מתורמים שונים מציגים יכולות שונות להתרבות בתוך מבחנה, אשר ישפיעו לאחר מכן על הגירה של עולה מתוך היכולת לחקור ולהפצה. בעוד השונות יכולה להיות נצפתה בזמן שלוקח את ה-ASCs מבודדים מן האלה האנזים נטול אנזימים כדי להגיע לשטף, זה היה נדיר למדגם לא להתרבות בתוך מבחנה.

מעבר לשונות התורמים, המקור הסביר ביותר של כישלון התאים לנדוד מתוך הרקמה ו/או ההתרבות בתוך מבחנה הוא משך הזמן שבו הרקמה היתה מאוחסנת לפני העיבוד. כאשר הורשו לשבת במשך > 12 שנים לפני העיבוד או לא הוחזקו לחות בין קציר ועיבוד, הגירה עניים ושיעורי התפשטות נצפו. הדגימות היחידות, כי לעתים קרובות נכשל להתרבות היו מתיחת בטן דגימות שלא נשמרו לח עם פתרון מלוחים: במקרים אלה, הרקמה במרכז בלוק הרקמה היה לעתים קרובות לח מספיק כדי לעבד, אבל היה צורך להיפטר מדי פעם. זה קריטי ולכן כדי לשמור על הרקמה לחות מזמן הקציר באמצעות עיבוד.

במקרים שבהם החברה לא נצפתה על הצלחת בסימן השבוע 1, הצמחים האדיפוז עדיין צריכים להיות מוסרים מלוחות התרבית של הרקמה שמא נמק ברקמות. לפעמים יש מעט מדי תאים כדי לזהות בקלות, אבל אלה תאים מעטים יהיה מסוגל להרחיב בתוך מערכת התרבות. אם התאים עדיין אינם מצופים בשלושה שבועות, יש להחשיב את הבידוד ככשל.

במקרים מסוימים, במיוחד של ניתוח מתיחת בטן, לא ניתן להשיג דגימת אספטי באמת בשל המגבלות בתוך הזירה הכירורגית. אם לא ניתן להשתמש בכלי סטרילי כדי להעביר את הרקמה מחדר הניתוח למכסה זרם למינארי, הסרת החיצוני 1 ס מ של הרקמה הוא בדרך כלל מספיק כדי למנוע זיהום מיקרואורגניזם. אם דגימת ניתוח מתיחת הבטן מחוברת לעור, ניתן לנגב את העור באמצעות 70% אתנול כדי לעקר את פני השטח לפני שהיא מתחמנת את רקמת השומן.

במהלך תהליך מועט, זה קריטי כי הרקמה היא כתוש לחתיכות קטנות, בסדר. אם האקסוצמחים גדולים מדי, לא יהיה שטח המשטח מספיק עבור ASCs לנדוד מתוך הרקמה על הצלחת. יתר על כן, הוא קריטי כי הרקמה אינה נשארת בצלחת יותר מאשר הכרחי שמא הרקמה הופכת נמק.

הגבלה של שיטה זו היא השימוש באנזים (בפרוטוקול המתואר, טריפסין) כדי לנתק את ה-ASCs במהלך תהליך תרבות הרקמה. לעומת זאת, ניתן להחליף את האנזימים שאינם בעלי החיים הנגזרים, כגון האקומאז, כדי להסיר את הצורך במוצרים שמקורם בבעלי חיים, ואולם, זה יגדיל את העלות של תרבות הרקמה. מסיבה זו, בין היתר, קבוצות רבות בודקים שיטות שאינן ממדיות לתרבות הרקמה הדו, כגון ביוריאקטורים ומערכות מבוססות פיגום להגברת פוטנציאל הצמיחה של MSC תוך מזעור הצורך לנתק את התאים מהמצע שלהם²².

בעת העברת ASCs למרפאה, מגבלה מרכזית של שיטת בידוד ההסבר היא ההסתמכות על מתקן הייצור הטוב של הרקמה ברמה (GMP), אשר מרכזים רפואיים רבים חסרים. במקרים אלה, כל אחת מהשיטות הקיימות בתחום המסחרי הזמין באופן מסחרי או צנטריפוגה, תצטרך להיות מועסק. עם זאת, כאשר מתקני GMP נעשים נפוצים יותר, אפקט זה צפוי להיות מוגבל. בינתיים, אפילו מתקנים כאלה חסר מתקני התרבות של רקמת GMP יכול לשקול שימוש בשיטת ההסבר לחקר ASCs ב מבחנה: המניפולציות פחות, יותר תאים אלה הם להיות שלהם vivo עמיתיהם¹¹.

שיטה זו מספקת דרך פשוטה לבידוד של מחשבי ה-i cs מרקמת אדיפוז-הן ליפוחות ומתיחת בטן-בהעדר אנזימים קשים או צעדים צנטריפוגה. בעוד שהתשואה הראשונית של ASCs נמוכה מזו של שיטות אחרות, ה-ASCs מתרבים בתוך מבחנה, מזעור ההשפעה של התשואה הראשונית הנמוכה. העדר מניפולציה מוגזמת או בעלת עוצמה גורמת לבידוד מבודד באופן הרלוונטי במיוחד, שכן יש פחות שאלות (כלומר, האם ההשפעות המובחנות הן בשל התאים עצמם או לטיפול בתאים במהלך תהליך הבידוד ).

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgments

למחברים אין תודות

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 tissue culture plates	Corning	Corning
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	serum is batch tested to ensure it supports MSC growth
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049