Methodenartikel

Lipidomik und Transkriptomik bei neurologischen Erkrankungen

DOI:

10.3791/59423

⸱

18. März 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel stellt ein modulares Protokoll für Gewebelipidomik und Transkriptomik sowie Plasmalipidomik in Mausmodellen für neurologische Erkrankungen vor, die auf Lipide abzielen, die Entzündungen und neuronaler Aktivität zugrunde liegen, Membranlipide, nachgeschaltete Botenstoffe und mRNA-kodierende Enzyme / Rezeptoren, die der Lipidfunktion zugrunde liegen. Probenahme-, Probenverarbeitungs-, Extraktions- und Quantifizierungsverfahren werden beschrieben.

Zusammenfassung

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Lipide dienen als primäre Schnittstelle zu Hirnverletzungen oder Reizen, die neurologischen Erkrankungen förderlich sind, und sind ein Reservoir für die Synthese von Lipiden mit verschiedenen Signal- oder Ligandenfunktionen, die den Beginn und das Fortschreiten von Krankheiten unterstreichen können. Lipide, die sich oft auf präsymptomatischer Ebene verändern, sind eine aufstrebende Quelle für Wirkstoffziele und Biomarker. Viele neurologische Erkrankungen weisen Neuroinflammation, Neurodegeneration und neuronale Erregbarkeit als häufige Kennzeichen auf, die teilweise durch spezifische Lipidsignalsysteme moduliert werden. Die Interdependenz und Wechselbeziehung der Synthese verschiedener Lipide führt zu einer Multilipid-, Multienzym- und Multirezeptoranalyse, um die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten neurologischer Kontexte abzuleiten und die Entschlüsselung mechanistischer Aspekte des Krankheitsbeginns und -verlaufs zu beschleunigen. Die Zuschreibung von Lipidrollen an verschiedene Hirnregionen fördert die Bestimmung des molekularen Lipidphänotyps und der Morphologie im Zusammenhang mit einer neurologischen Erkrankung.

Hier wird ein modulares Protokoll vorgestellt, das für die Analyse von Membranlipiden und nachgeschalteten Lipidsignalen zusammen mit mRNA von Enzymen und Mediatoren, die ihrer Funktionalität zugrunde liegen, aus diskreten Hirnregionen extrahiert wird, die für eine bestimmte neurologische Erkrankung und / oder Erkrankung relevant sind. Um ein genaues vergleichendes lipidomisches Profiling zu gewährleisten, wurden die Arbeitsabläufe und Betriebskriterien optimiert und standardisiert für: i) Gehirnprobenahme und Dissektion von Regionen von Interesse, ii) Co-Extraktion mehrerer Lipidsignale und Membranlipide, iii) duale Lipid/mRNA-Extraktion, iv) Quantifizierung durch Flüssigkeitschromatographie Multiple Reaction Monitoring (LC/MRM) und v) Standard-mRNA-Profiling. Dieser Workflow ist für die geringen Gewebemengen geeignet, die durch die Probenahme der funktionell diskreten Hirnunterregionen (d.h. durch Hirnstanzen) erhalten werden, wodurch Verzerrungen in der multimolekularen Analyse aufgrund von Gewebeheterogenität und/oder Tiervariabilität verhindert werden. Um periphere Konsequenzen neurologischer Erkrankungen aufzudecken und translationale molekulare Auslesungen neurologischer Krankheitszustände zu etablieren, werden auch periphere Organentnahmen, -verarbeitungen und deren anschließende lipidomische Analyse sowie Plasmalipidomik verfolgt und beschrieben. Das Protokoll wird an einem Mausmodell für akute Epilepsie demonstriert.

Einleitung

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Jüngste Fortschritte in der Funktion von Lipiden und ihrer Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten neurologischer Erkrankungen eröffnen neue Forschungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für neue therapeutische Ziele und die Aufklärung von Krankheitsmechanismen1. Dokumentierte Unterschiede in der Lipidzusammensetzung in verschiedenen Hirnregionen, die durch moderne molekulare Bildgebungsverfahren wie Massenspektrometrie-Bildgebung und fortschrittliche Massenspektrometrie-Profilierung betont werden, verschieben das Paradigma der Lipiduntersuchung vom gesamten Gehirn hin zu funktionell unterschiedlichen und diskreten Hirnregionen. Die Tatsache....

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Versuchsverfahren entsprechen der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 22. September 2010 (2010/63EU) und wurden vom örtlichen Tierausschuss des Landes Rheinland-Pfalz genehmigt (Aktenzeichen: 23 177-07/G16-1-075).

1. Tiermodell der akuten und prophylaktisch behandelten KA-induzierten Epilepsie

  1. Führen Sie Anfallsinduktion, Behandlung und Verhaltensbewertung durch.
    1. Getrennte Mäuse (mindestens n = 6 Mäuse pro Gruppe) in Einzelkäfigen.
    2. Herstellung einer Anfallsinduktionsinjektionslösung und des entsprechenden Vehikels (siehe Tabelle 1) sowie der Behandlungs....

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Ergebnisse

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Der Satz der beschriebenen Protokolle kann auf verschiedenen Ebenen zielspezifisch kombiniert werden, z. B. wahlweise des Tiermodells, Probenahmeweg, Extraktionsmethode und Profilerstellung (Abbildung 1).

Um Lipidspiegeländerungen im Gehirn und in der Peripherie über einen bestimmten Verlauf eines akuten epileptischen Anfallszustands zu bestimmen und die potenzielle antiepileptische

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Diskussion

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Die hier beschriebene neurolipidomische und transkriptomische Methodik ist ein praktikables Mittel, um jede Krankheit oder gesunde Entwicklung bei hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in peripheren Organen zu untersuchen. Aufgrund der optimierten Plasmaprobenahme- und Handhabungsverfahren kann die Plasmalipidomanalyse auch von denselben Tieren durchgeführt werden, die für die Gewebelipidomik und Transkriptomik geopfert wurden, wodurch die Zuverlässigkeit der molekularen Korrelate von Gewebeblut und der .......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Wir widmen diesen Artikel Dr. Ermelinda Lomazzo. Während der Fertigstellung dieses Manuskripts verstarb Dr. Ermelinda Lomazzo. Sie ist die Verkörperung der Leidenschaft für die Wissenschaft und des selbstlosen Engagements in der Teamarbeit, um einen sinnvollen Forschungszweck zu erfüllen. Sie träumte immer davon, einen sinnvollen Beitrag zum größeren Wohlergehen der Menschen zu leisten. Ihre gutherzige Natur wurde nie durch die anstrengenden Wege der Wissenschaft und des Lebens beeinträchtigt. Sie wird von unschätzbarem Wert und für immer in unseren Herzen bleiben.

Julia M. Post wurde durch das Focus Program for Translational Neuroscience (....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12(S)-HETEBiomolCay10007248-25Lipid Std
12(S)-HETE-d8BiomolCay334570-25Lipid Std
1200 Serie LC SystemAgilentInstrumentation/LCMS
2100 BioanalyzerAgilentInstrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8BiomolCay 334230Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR CyclerApplied BiosystemsInstrumentierung/qPCR
Acetonitril LC-MS Chroma SolvHoneywell9814920Solvent/LCMS
Amber Eppendorf RöhrchenEppendorfProbenvorbereitung
Analyst 1.6.2 SoftwareAB SCIEX, DarmstadtSoftware
AnalysenwaageMettler ToledoInstrumentierung/Probenvorbereitung.
Arachidonsäure-d8 MS StandardBiomolCay-10007277Lipid Std
Bessmann GewebepulverisiererSpectrum Laboratories, Inc. (Breda, Niederlande)Instrumentierung/Probenvorbereitung.
BinoZeissMikroskopie
, gespaltener Caspase-3-AntikörperCellsignaling9661SMikroskopie-Kryostat
, Leica CM3050 S,Leica BiosystemsInstrumentierung/Probenvorbereitung.
CTC HTC PAL AutosamplerCTC Analytics AGInstrumentation/LCMS
Dumont Curved Pinzette Dumoxel #7FST11271-30Chirurgische Instrumente
Dumont Pinzette Superfeine Spitze #5SF (x2)FST11252-00Chirurgische Werkzeuge
EDTA 1000 A Rö hrchenKabe Labortechnik078001Probenvorbereitung
EP-1 EconoPumpBioRAD700BR07757Instrumentierung/Probenvorbereitung
Feine Pinzette HochglanzFST11412-11Chirurgische Werkzeuge
Feine Irisschere gerade scharfFST14094-11Chirurgische Werkzeuge
Feine Schere Wolframkarbid geradeFST14568-09Chirurgische Werkzeuge
IrisspatelFST10094-13Chirurgische Werkzeuge
KainsäureAbcamab120100Epileptikum
Lipid Software anzeigenAB SCIEX, DarmstadtSoftware
LPC 17:0Avanis Polaris855676PLipid Std
LPC 18:0Avanis Polaris855775PLipid Std
Luna 2,5µ m C18(2)- HAST 100A LC-SäulePhenomenex00D-4446-B0Instrumentierung/LCMS
LupenlampeMaul GmbHInstrumentierung/Probenvorbereitung
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%Honeywell9814920Solvent/LCMS
Motic CamaraMoticMicroscopy
MTBEHoneywell 34875-1LSolvent/LCMS
MultiQuant 3.0 QuantifizierungssoftwarepaketAB SCIEX, DarmstadtSoftware
NanoDrop 2000c SpektralphotometerThermo ScientificInstrumentierung/qPCR
PA 16:0-18:1Avanis Polaris840857PLipid Std
PA 17:0-14:1AvanisPolaris LM-1404Lipid Std
Palmitoyl EthanolamideBiomolCay90350-100Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5BiomolCay9000573-5Lipid
Std PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipid Std
PC 16:0-18:1Avanis Polaris850457PLipid Std
PC 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1004Lipid Std
PE 16:0-18:1Avanis Polaris850757PLipid Std
PE 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1104Lipid Std
PG 16:0-18:1Avanis Polaris840457PLipid Std
PG 17:0-14:1AvanisPolaris LM-1204Lipid Std
PI 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1504Lipid
Std Precelleys 24PeqlabInstrumentierung/Probenvorbereitung.
Precellys Keramik-Kü gelchenPeqlab91-pcs-ck14pProbenvorbereitung.
Precellys Stahlkugeln 2,8mmPeqlab91-PCS-MK28PProbenvorbereitung.
Precellys-keramik-kit 1,4 mmVWR91-PCS-CK14Probenvorbereitung
Prostaglandin D2BiomolCay 12010Lipid Std
Prostaglandin D2-d4BiomolCay 312010Lipid Std
Prostaglandin E2BiomolCay10007211-1Lipid Std
Prostaglandin E2-d9BiomolCay10581-50Lipid Std
PS 17:0-14:1Avanis PolarisLM-1304Lipid Std
Q Trap 5500 Triple-Quadrupole Linear Ion Trap MSAB SCIEXInstrumentation/LCMS
Real Time PCR SystemAppliert BiosystemInstrumentation/qPCR
Resolvin D1BiomolCay10012554-11Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)Qiagen79254Probenvorbereitung
Security Guard VorsäulePhenomenexInstrumentation/LCMS
Shandon AbdeckplattenThermo Fisher72110017Mikroskopie
Shandon Objektträger und DeckelThermo Fisher73310017Microscopy
SM 18:0Avanis Polaris860586PLipid Std
SM d18:1/12:0Avanis PolarisLM-2312Lipid Std
Standard Pinzette gerade glattFST11016-17Chirurgische Werkzeuge
Chirurgische Schere ToughCut Standard PatternFST14130-17Chirurgische Werkzeuge
T3000 ThermocyclerBiometraInstrumentation/qPCR
Thromboxan B2BiomolCay19030-5Lipid Std
Thromboxan B2-d4BiomolCay319030-25Lipid Std
Tissue Lyser IIQiagen/ Retsch12120240804Instrumentierung/Probenvorbereitung.
Tissue TekSakura Finetek4583Mikroskopie
ToluidinblauRoth0300.2Mikroskopie
VapothermBarkey4004734Instrumentierung/Probenvorbereitung.
Wasser LC-MS Chroma SolvVWR9814920Solvent/LCMS
, , AU111609004

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L.

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Schlagwörter

GehirndissektionLC MRM Analyseduale Lipid RNA ExtraktionEndocannabinoid AnalysePhospholipid ProfilingBrain PunchingEpilepsie Mausmodell

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