Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße

Zusammenfassung

Mit Hilfe eines zuvor entwickelten Geräts zur mechanischen Belastung von Anbauzellen beschreibt dieser Beitrag eine neu gestaltete Substratum-Geometrie und ein maßgeschneidertes Gerät zur hochauflösenden Einzeller-Abbildung von angespannten Zellen mit einem 100x Öl-Immersionsziel.

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass eine technische Belastung für zellphälenförmige Reaktionen eine physiologische Relevanz in mehreren Gewebesystemen hervorruft. Um die Wirkung der aufgetragenen extrazellulären Zugbelastung auf die Zellpopulationen in vitro durch biochemische Assays zu erfassen, wurde zuvor ein Gerät entwickelt, das einfach hergestellt werden kann und klein genug ist, um Inkubatoren der Gewebekultur zu integrieren, sowie darüber hinaus Mikroskop-Stufen. Die bisherige Gestaltung des Polydimethylsiloxan-Substratums erlaubte jedoch keine hochauflösende subzelluläre Bildgebung über Öl-Immersionsziele. Diese Arbeit beschreibt eine neu gestaltete Geometrie des polydimethylsiloxanen Substrats und eine maßgeschneiderte Bildgebung, die zusammen eine hochauflösende subzelluläre Bildgebung lebender Zellen unter Auftragen der Last ermöglichen kann. Dieses Substrat kann mit dem gleichen, früher entworfenen Gerät verwendet werden und hat somit die gleichen Vorteile wie oben aufgelistet, zusätzlich zu einer hochauflösenden optischen Bildgebung. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substratums kann durch die Einbettung eines Gitters verbessert werden, das die Verfolgung der gleichen Zelle vor und nach der Anwendung der Belastung erleichtert. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine hochauflösende Zeitraffer-Abbildung von fluoreszierend beschrifteten Kernen in angespannten Zellen, die mit der hier beschriebenen Methode erfasst werden. Diese Daten der nuklearen Dynamik geben Einblicke in den Mechanismus, durch den die angewandte Zugbelastung die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen fördert.

Einleitung

Zellen und Gewebe im Körper werden verschiedenen mechanischen Ketten ausgesetzt, darunter auch Zugstämme. Die Auswirkungen dieser Hinweise auf die Biologie neuronaler Zellen sind jedoch noch nicht umfassend untersucht und vollständig verstanden worden. Im zentralen Nervensystem sind die Quellen der mechanischen Belastung das Entwicklungswachstum^{von 1,}2^,3,4, physiologische Prozesse wie Rückenmarksbiegung, Blut und Hirnspinalflüssigkeit. Pulsierung und pathologische Zustände wie Trauma, Axonschwellung, Gliollennarbung oder Tumorwachstum^5,6,7,8. Es lohnt sich zu untersuchen, wie sich Zugbelastung auf die Differenzierung von Oligodendrozyten und die anschließende Myelination von Axonen auswirkt, was ein kritischer Prozess im Wirbelsäulenmittelnervensystem ist. Mit Hilfe eines maßgeschneiderten Dehnungsgerätes und einer elastomeren Multiwell-Platte haben frühere Arbeiten9,10^gezeigt , dass statische Einblutungsstrapazen die Oligodendrozytendifferenzierung durch globale Veränderungen der ^{Genexpression erhöhen können. 10}. Um ein weiteres Verständnis der Mechanismen der Dehnungsmechanotransduktion in diesen Zellen zu gewinnen, muss der bisherige Experimentalapparat so umgestaltet werden, wie er hier beschrieben wird, um eine hochauflösende Fluoreszenz-Abbildung der nuklearen Dynamik im Leben zu ermöglichen. Zellen unter Belastung. Konkret wird eine einfallsbringende Polydimethylsiloxan-Platte entwickelt, und die Bildkonfiguration wird neu gestaltet, um die Zeitraffer-Abbildung lebender Zellen unter Belastung durch eine 100x Öl-Tauchlinse zu ermöglichen. Um die negativen optischen Effekte von Polydimethylsiloxan im Lichtweg zu eliminieren, werden Zellen nicht durch die Polydimethylsiloxan-Platte, sondern in der umgekehrten Position durch das Deckglas abgebildet, das das Zellfach bedeckt. Mit diesem neuen bildgebenden Design werden hunderte von hochauflösenden Zeitraffer-Filmen aufgenommen, von einzelnen Zellkernen innerhalb intakter, anhaftierter Zellen, in denen Chromatin durch die Markierung von Histon H2B auf grünes fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wird. Diese Filme zeigen, dass Zugstrapazen Veränderungen in der Chromatin-Struktur und-Dynamik induzieren, die mit dem Fortschreiten der Oligodendrozyten-Differenzierung im Einklang stehen.

Die Live-Zell-Bildgebung unter aufgesetzter Belastung ist technisch anspruchsvoll und erfordert ein mit dem Mikroskop-System kompatibles Gerätedesign. Das hier beschriebene individuelle Design stellt eine kostengünstige Alternative zu kommerziellen Lösungen dar. Seine Abmessungen ermöglichen den Einbau auf Mikroskop-Stufen und Live-Zell-Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung während der aufgetragenen Belastung. Das bildgebende Setup soll die Bildgebung von lebenden Zellen mit einer 100-fach-Öltauchlinse mit höchster Klarheit durch das Deckglas erleichtern, nicht durch die Schicht der Polydimethylsiloxan-Platte, die sonst die Bildqualität verringert und in den meisten Fällen üblich ist. Bildgebende Setups unter Belastung. Das Gerät, mit einer montierten Platte, die Zellen enthält, lässt sich auch einfach im Inkubator lagern. Dieses Gerät ist so konzipiert, dass es Substraten, die die anhaftende Zellkultur erleichtern und eine stabile und gleichmäßige Belastung über mehrere Tage hinweg erhalten, uniaxiale Belastung aufträgt. Das hier beschriebene Setup kann für die hochauflösende Abbildung verschiedener anhaftender Zelltypen unter Belastung genutzt werden, was es für Mechanotransduktionsstudien in vielen Bereichen der Zellmechanobiologie geeignet macht.

Protokoll

1. Design der Einbrunnen-Polydimethylsiloxan-Form für hochauflösende Bildgebung

Hinweis: Die Form zur Herstellung von Polydimethylsiloxan-Platten ist mit folgenden Eigenschaften ausgestattet, um eine Bildgebung mit einer 100x Öltauchlinse und einer korrekten Passform in die maßgeschneiderte Dehnungsvorrichtung (Abbildung 1A, B) zu ermöglichen.

1. Halten Sie die gesamten Plattenmaße so, dass sie in die Klemmen der Dehnungsvorrichtung passen.
   Achtung: Hier sind sie 60 mm x 73 mm.
2. Machen Sie ein Zellfach oder einen Brunnen, der deutlich kleiner ist als die seitlichen Abmessungen der ganzen Platte, um zu vermeiden, dass sich die Wirkung (außerhalb des Flugzeugs), die an den ungeklemmten Kanten der Polydimethylsiloxan-Platte während der aufgetragenen Belastung passieren, abspielt.
   Hinweis: Hier wurde das Fach als 23 mm x 23 mm Quadrat konzipiert.
3. Halten Sie die Tiefe des Zellfaches so minimal wie möglich (nicht mehr als 80 μm), damit die Fokussierung mit der 100x Öltauchlinse durch das Deckglas auf dem Oberfach des Faches platziert wird, aber ausreichend genug, um Medien zu enthalten und zu vermeiden, dass Kontakt oder Die Zellen quetschen.
4. Heben Sie das Zellfach auf ein Quadrat mit einer Höhe von 3 mm, um die Zellen näher an die Linse im umgekehrten Mikroskop-Setup zu bringen, um eine einfache Fokussierung zu ermöglichen.
   Hinweis: Formen mit den oben genannten Eigenschaften können mit vielen Techniken hergestellt werden, wie zum Beispiel gefrästes Aluminium. Alternativ können auch Meisterformen mit Acrylplatten mit einem Laserschneider, Deckglas #0 für das Zellfach und Superkleber zusammengesetzt werden. Diese Meisterform wird zur Herstellung eines Polydimethylsiloxan-Aufdrucks verwendet, der dann mit einem Gießharz für die Herstellung von Arbeitsformen verwendet wird.

2. Herstellung von Einbrunnen Polydimethylsiloxan-Platten und quadratischen Fächern

1. Polydimethylsiloxan-Basis und Härtungsmittel im Verhältnis von 20:1 (nach Gewicht) in einem Einwegbecher mischen. Wiegen insgesamt 20 g Polydimethylsiloxan pro Form (für die Herstellung einer Polydimethylsiloxan-Platte) und 150 g Polydimethylsiloxan pro 150 mm-in-durchmessende Kunststoffschale (für die Herstellung einer Charge quadratischer Fächer).
2. Lassen Sie die Polydimethylsiloxan-Mischung in einem Vakuum-Degasser bei-0,8 bar für 30 min (oder bis alle Blasen entfernt sind).
3. Die Polydimethylsiloxan-Mischung in die Formen (für Teller) oder in 150 mm Plastikschalen (für quadratische Fächer) geben.
4. Entfernen Sie in dieser Phase zusätzliche Blasen, entweder durch Blasluft (durch den Mund) oder durch Entgasung der polydimethylsiloxan gefüllten Formen/Gerichte wieder bei-0,8 bar Vakuum für 30 min.
5. Lassen Sie die geschmolzenen/Gerichte in einem 80 ° C-Ofen auf einem Nivelliertisch für 2 Stunden.
6. Die Molds/Schalen vorsichtig aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Das ausgehärtete Polydimethylsiloxan nach sorgfältigem Schneiden der Kanten mit einer Klinge vorsichtig ausziehen (Abbildung 1C).
7. Auf dem 150 mm großen Polydimethylsiloxan zeichnen Sie ein 2 cm x 2 cm Gitter mit einem Marker. Ziehen Sie innerhalb jedes Quadrats ein 1 cm x 1 cm Quadrat, so dass ein Rand von 0,5 cm auf allen Seiten. Mit einer Klinge, sorgfältig entlang der Linien geschnitten, um quadratische Fächer zu erhalten (Abbildung 2A).
8. Reinigen Sie die polydimethylsiloxanen Platinen/.
9. Legen Sie die Platinen auf Paraffin-Folien-Backpapier (nicht die Paraffin-Folie, sondern das Papier) in eine Plastikschüssel mit einem Durchmesser von 150 mm (Abbildung 2C).
10. Die Polydimethylsiloxan-Platte im 80 ° C-Ofen 4 Stunden trocknen lassen.
11. Die 150 mm großen Geschirr mit Polydimethylsiloxan-Platten und Containerquadraten mit Paraffinfolie versiegelt und bis auf Weiteres in einem kalten Raum lagern.

3. Funktionalisierung von Polydimethylsiloxan-Platten

1. Die Paraffinfolie entfernen, die Abdeckung der Kunststoffschale entfernen und die Polydimethylsiloxan-Platten und quadratischen Fächer 30 min unter UV-Licht stellen.
2. Plasma-treat (bei 150 W für 5 min) die Polydimethylsiloxan-Platten (mit dem Zellfach nach oben) ohne die quadratischen Fächer, um die Kulturfläche hydrophil zu machen.
3. Die quadratischen Fächer sofort auf die Plasma-behandelte Fläche legen (Abbildung 2B) und manuell drücken, um die beiden vorübergehend zu kleben.
   Hinweis: Behandeln Sie die quadratischen Fächer nicht Plasa, sonst haften sie stark an der Polydimethylsiloxan-Platte und werden nicht leicht abfallen, wenn sie während der Bildgebung abgeschält werden müssen.
4. 200 μL von 100 mM (3-Aminopropyl) Triethoxysilane für 2 h in den Brunnen geben, um – NH₂ Gruppen auf die Polydimethylsiloxan-Oberfläche einzuführen. Um eine 100-MM-Lösung zu machen, lösen Sie 234 μL reines (3-Aminopropyl) Ethoxysilane in 10 ml Wasser auf. Nach einer 2-h-Inkubation die Brunnen 3x mit deionisiertem Wasser waschen.
5. Wiegen Sie 2 mg des molekularen Crosslinkers Bissulfosuvinimidyl suberate und lösen Sie es in 700 μL von 1 M (4-(2-Hydroxyethyl) -1-Piperazineethan-Säure-Puffer (pH 8,0) und 2,8 ml Wasser auf.
   NOTE: Dies wird eine 1 mM Bissulfosuccinimidyl-Suberat-Lösung in 200 mM (4-(2-Hydroxyethyl) -1-Piperazineethan-Sulfonsäure-Puffer. Beachten Sie, dass auch ein 50-MM-Konzentrationspuffer gut funktioniert.
   1. 135 μL dieser Lösung und 15 μL von 1 mg/mL Fibronectin in jeder Polydimethylsiloxan-Platte für 4 h bei Raumtemperatur in den Brunnen geben.
6. 3x mit phosphatgepufferten Salzlösung waschen. Dem Brunnen werden 500 μL Phosphat-gepufferte Salzlösung zugegeben. Die 150 mm große Schale, die das Polydimethylsiloxan enthält, mit Paraffinfolie bedecken und bis auf weiteres in einem kalten Raum lagern.

4. Funktionalisierung von Kunststoffschalen und-Flasken

1. Inkubate Plastikschalen und-Flappen mit einer 5 μg/mL-Lösung aus Poly-D-Lysin (PDL, In sterilem Wasser) für 1 Stunde. 1,5 ml dieser Lösung (Ligand) pro 35 mm Durchmesser Schüssel, 3 ml davon pro 60 mm-Durchmesser Schüssel und 10 ml pro 75 cm 2 Kulturflasche.
2. Waschen Sie die Geschirr und Flaschen 2x mit sterilem Wasser.
3. 1 Stunde (oder bis trocken) im Kiosschutzschrank trocknen lassen und bis zur Weiterverwendung im kalten Raum bei 4 ° C aufbewahren.

5. Proliferation und Differenzierungsmedium für Murin-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

1. Bereiten Sie 50 mL von 100x Lösungen des Vermehrungs-und Differenzierungsmediums vor, machen Sie Aliquote von 2,5 mL und lagern Sie sie bei-80 ° C.
   NOTE: Die Zusammensetzung des Proliferationsmediums ist 0,1 mg/mL Rinder-Serum Albumin, 62 ng/mL Progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL Insulin, 50 μg/mL holo-transferrin, 5 ng/mL Natriumselenite, 1x Penicillin-Streptomycin, 10 ng/mL platelet-derived growth Faktor, und 10 ng/mL Fibroblast-Wachstumsfaktor in Dulbecco es modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) mit hoher Glukose und Pyruvat. Während Rinder-Serum Albumin, Progesteron, Putreszin und Natriumselenit bei 100x konstituiert und gelagert werden können, müssen bei der Zubereitung der 1x-Lösung frische hinzugefügt werden. Die Wachstumsfaktoren müssen bei 10 μg/mL gebildet werden und täglich frisch in die Zellen (1 μL/mL des Mediums) eingefügt werden. Die Zusammensetzung des Differenzierungsmediums beträgt 0,1 mg/mL Rinder-Serum albumin, 62 ng/mL Progesteron, 16 μg/mL putrescine, 5 μg/mL Insulin, 50 μg/mL holo-transferrin, 5 ng/mL Natriumselenite, 1x Penicillin-Streptomycin, 400 ng/mL triiodothyronine, 400 ng/mL L-Schilddrüse, und 0,5% fetales Rinderserum in DMEM mit hoher Glukose und Pyruvat. Triiodothyronin und L-Schilddrüse können mit anderen Reagenzien gebildet und bei 100x gelagert werden. Insulin, Holo-transferrin und Penicillin-Streptomycin müssen bei der Vorbereitung der 1x-Lösung frisch hinzugefügt werden.
2. Für die Zubereitung von 50 ml 100x Proliferationsmedium, lösen Sie 510 mg Rinder-Serum Albumin in 17 mL Dulbecco Medium, 310 μg Progesteron in 31 μL Ethanol, 80 mg Putreszin in 500 μL Dulbecco-Medium, 25 μg Natriumselenit in 10 μL Dulbecco es Medium , und volle DMEM bis zu 50 mL
3. Für die Zubereitung von 50 mL 100x Lösung des Differenzierungsmediums zusätzlich 2 mg Triiodothyronin in 40 μL Natriumhydroxid und 2 mg L-thyroxin in 40 μL Natriumhydroxid auflösen, dann die Lösung mit Dulbecco-Medium auf 50 mL auffüllen. Filtern Sie die Lösung durch eine sterile Einwegfiltereinheit, Aliquot, und speichern Sie die Aliquots bei-80 ° C.
4. Für die Zubereitung von 250 mL 1x Proliferation/Differenzierungsmedium, mischen Sie 2,5 mL von 100x Lösung von Proliferation/Differenzierungsmedium mit 12,5 mg Holo-transferrin, 125 μL von 10 mg/mL Insulin und 2,5 mL von 100x Penicillin-Streptomycin. Füllen Sie die Lösung auf 250 mL mit dem Dulbecco-Medium auf und filtern Sie sie durch eine sterile Einwegfiltereinheit.
   NOTE: Die Wachstumsfaktoren müssen frisch und direkt in die Zellkultur aufgenommen werden, nicht in die ganze Gruppe des rekonstituierten Mediums.

6. Zellkultur

1. Beginnen Sie mit Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die im Proliferationsmedium aufgehängt sind. Saatgut diese Zellen mit einer Dichte von 35.000 Cells/2 auf PDL-beschichtete Kunststoffoberflächen (Geschirr oder Flaschen, siehe Abschnitt 4). Das Volumen des Proliferationsmediums auf 3 ml pro 10 cm 2 der Oberfläche des Kunststoffsubstrats anpassen; Ein geringeres Medium kann zu einer Zellklemme führen, die durch Oberflächenspannungskräfte entsteht, während ein höheres Medium im Geschirr zu Verschmutzungen führen kann.
2. Fügen Sie jeden Tag Wachstumsfaktoren (platelet-abgeleiteter Wachstumsfaktor und Fibronektin Wachstumsfaktor) hinzu, halten Sie ihre Konzentration bei 10 ng/mL aufrecht und verändern Sie die Hälfte des Proliferationsmediums an wechselnden Tagen.
3. Am dritten Tag die Zellen mit einer sanften Zellablösungslösung (z.B. Akkutase) von der Kunststoffoberfläche abtrennen: Das Medium entfernen, 1x mit phosphatgepufferter Salzlösung waschen, 1 mL Loslösung pro 20 cm 2-Bereich hinzufügen, die Unehre verlassen In einem Inkubator bei 37 ° C für 10 min, und sanft tippen Sie es, bis alle Zellen sich gelöst haben (siehe unter einem Mikroskop).
4. Pipette mit einer 200 μL-Spitze, um Klumpen in einzelne Zellen zu zerlegen, sie auf ein 50 mL-Rohr zu übertragen, sie im Proliferationsmedium zu verdünnen, bei 0,2 x g für 10 Minuten zu drehen, das Supernatant abzulegen und das Pellet-Medium im Proliferationsmedium wieder zu verlegen, um ein Gesamtvolumen von 1 mL zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen mit einem Zytometer.
5. Die Fibronektin-Funktionalisierten Polydimethylsiloxan-Platten 2x, 15 min pro Wäsche, mit Proliferationsmedium waschen.
6. Saatgut 35.000 Zellen pro Polydimethylsiloxan-Platte in 700 μL Proliferationsmedium.
7. Fügen Sie ein Plasmid-Konstrukt von H2B-GFP zur Kennzeichnung von Histon H2B mit grünem Leuchtstoffprotein hinzu.
   Hinweis: Hier wurde jeder Platte 1,4 μL CellLight H2B-GFP BacMam2 Transfektionsmix zugesetzt (2 μL pro 50.000 Zellen).
8. Nach 24 Stunden die Polydimethylsiloxan-Proben mit Zellen montieren, die auf der uniaxialen Dehnungsvorrichtung gestreckt werden sollen (wie in Abbildung 2Dgezeigt). Ändern Sie das Medium in allen Proben in Differenzierungsmedium.
9. Um die Proben zu belasten, messen Sie die unbelastete Zellfresslänge (Abbildung 3A) und drehen Sie die Bühnenmikrometerschraube, um die Länge des Zellgedecks um die gewünschte Menge zu erhöhen (z.B. 10%, siehe Abbildung 3B). Lassen Sie die gestreckten und ungestreckte Polydimethylsiloxan-Proben im Inkubator bei 37 ° C bis zur Bildgebung.

7. Bildgebung

1. Schalten Sie das Mikroskop ein. Stellen Sie die Mikroskop-Inkubator-Temperatur auf 37 ° C.
2. Bringen Sie das zu verwendenden Objektiv (100x Öleintauchen) in die zentrale Position, da der objektive Turm später nicht mehr zugänglich ist. Das Objektiv abschrauben und mit einem Objektring (Abbildung 4A) zurückschrauben, damit das Objektiv näher an die Zellen herangeführt werden kann. Wenn hier ein Ölziel verwendet wird, fügen Sie bei diesem Schritt einen Tropfen Öl hinzu.
3. Synthesize vorher (durch 3D-Druck oder Bearbeitung) einen Kunststoff-oder Metallhalter, der zwei wichtige Merkmale — ein abgewinkeltes Fenster undeinen Schritt (Abbildung 4B) hat.
   Hinweis: Das Fenster unterstützt eine Dicke #0 Glaskappe, die das Medium hält, während sich das Dehnungsgerät in einem umgekehrten Zustand befindet. Der abgewinkelte Schnitt an den Fensterkanten (Abbildung 4D) ermöglicht es, das Objektiv näher an die Glasverkitzung heranzuführen. Der Schritt in den Halter ermöglicht es uns, das gestreckte Polydimethylsiloxan weiter unten, näher an das Ziel zu bringen.
4. Legen Sie eine Glaskitzel (Dicke #0, mit Abmessungen von 25 mm x 25 mm oder 35 mm Durchmesser) auf die Oberseite des Halters, indem Sie Vakuumfettander Peripherie des Fensters verteilen (Abbildung 4C), und binden Sie das Kunststofffenster auf die Mikroskop-Ebene ( Abbildung 4D und Abbildung 5A).
5. Eine z-Übersetzungsstufe auf die Mikroskop-Stufe schrauben und auf die oberste z-Position ( Abbildung 5A) verschieben.
6. Entfernen Sie 500 μL des Mediums aus der gestreckten Polydimethylsiloxan-Platte, um abgebildet zu werden, und fügen Sie dieses Medium auf die Glaskappe im weißen Kunststofffenster.
7. Mit sterilen Pinzetten wird das quadratische Fach von der Polydimethylsiloxan-Platte sorgfältig abgetrennt.
8. Halten Sie das Dehnungsgerät in einer aufrechten Position (Zellen nach oben) über dem weißen Kunststofffenster und drehen Sie die Dehnungsvorrichtung sorgfältig um, so dass ein zusätzliches Medium direkt in der Mitte des Glaskitzel abfallen kann (Abbildung 5B) (Zellennach unten).
9. Legen Sie den unteren Teil des Dehnungsgerätes mit dem doppelseitigen Band auf die z-Übersetzungsstufe (Abbildung 5C, D).
10. Beim Blick durch das Okular unter Brightfield langsam das Dehnungsgerät nach unten bringen (Abbildung 5E) (durch Absenkung der z-Übersetzungsstufe) und das Objektiv nach oben zu verschieben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren.
    1. Führen Sie diesen Schritt äußerst langsam, Schritt für Schritt. Wenn das Dehnungsgerät zu sehr auf den Kenterlip drückt, können die Zellen komprimiert werden (wodurch sie absterben), und wenn das Objektiv zu sehr auf den Kenterlip drückt, kann der Kenterlip brechen (wodurch das Medium austreten und auf das Objektiv ablaufen).
11. Scannen Sie die Polydimethylsiloxan-Platte in x-und y-Richtungen, um eine Zelle zu finden, die einen fluoreszierenden Kern (unter Epifluoreszenz mit 488 nm Wellenlängen-Anregung) und die entsprechende Zellmorphologie (unter Brightfield) hat.
12. Wenn die seitliche Verschiebung des Mikroskop-Stadions die vertikale Fokussierung nicht zu sehr beeinflusst, wählen Sie mehrere Interessensregionen mit einer Multipoint-Funktion auf der Software aus. Manchmal ist die Fokussierung sehr empfindlich auf jede seitliche Verschiebung der Bühne. In solchen Fällen eine Zelle nach der anderen. Markieren Sie die Positionen x-, y-und z-Positionenfür jede Zelle des Interesses.
13. Zeichnen Sie Weiterflächen-Bilder (oder Freiblöcken) des Kerns mit 488 nm Wellenlängen-Anregung und der Zelle mit Brightfield-Anregung in Abständen von 30 s pro Rahmen für eine Gesamtdauer von mindestens 30 min auf.

8. Datenanalyse

1. Nukleare Schwankungen
   1. Öffnen Sie die Reihenfolge der Kernbilder (Abbildung 6A) in einer Bildanalyse-Software und schwellen Sie die Kernzeit-Lapse-Bilder ab (verwenden Sie zum Beispiel den Threshold-Befehl in ImageJ oder den Graythresh-Befehl in der Software MATLAB).
   2. Holen Sie sich den Kernbereich (in Pixel) als eine Funktion der Zeit, zeichnen Sie ihn in einer Datenplanungssoftware(Abbildung 6B), und passen Sie einen dritten Auftrag polynomial zu den Daten (Abbildung 6C) (zum Beispiel verwenden Sie die Analyse | Passend | Polynomiale Fit-Befehl in Origin oder der Polyfit-Befehl in der Software MATLAB).
   3. Subtrahieren Sie den Wert des eingebauten Polynomiums für jeden Zeitpunkt aus dem eigentlichen Bereich (in Pixel). Dieser korrigierte Bereich wird als Restfläche bezeichnet.
      Hinweis: Dieser Prozess entfernt jeden zunehmenden oder abnehmenden Trend in den Daten, die von instrumentalen Fehlern ausgehen und wird als Entgleiung bezeichnet.
      1. Berechnen Sie den Prozentsatz der Restfläche, indem Sie den Restbereich an jedem Zeitpunkt mit dem Wert des zu diesem Zeitpunkt eingebauten Polynomiums teilen (Abbildung 6D).
   4. Berechnen Sie die Standardabweichung der Restflächen-Zeitreihe. Diese Standardabweichung bezeichnet die Amplitude von nuklearen Schwankungen.
2. Datenplündern und statistische Analysen
   1. Berechnen Sie die Amplitude der nuklearen Schwankungen als Mittel von mindestens 20 Kernen pro Zustand.
   2. Führen Sie einen einseitigen Varianzstatistiktest mit Bonferroni-Korrektur durch, um festzustellen, ob es einen signifikanten Unterschied in der Amplitude der Schwankungen gibt, wenn es um die Bedingungen geht (zum Beispiel mit und ohne aufgetragene Belastung).

Ergebnisse

Jüngste Arbeiten, die darauf abzielten, die Wirkung von Zugbelastung auf Oligodendrozyten¹⁰ zu untersuchen, zeigten, dass eine 10% uniaxiale Zugbelastung die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch globale Veränderungen der Genexpression fördert. Der Mechanismus hinter diesen Veränderungen der Genexpression kann durch die Abbildung subzellulärer Parameter, wie der Zytoskelettstruktur, der Transkriptionsfaktor-Lokalisierung, der nuklearen Dynamik ...

Diskussion

Ein Gerät wurde zuvor¹ für den Einsatz von extrazellulärer Zugbelastung der anhaftenden Zellen entwickelt. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substrats, das für biochemische Untersuchungen geeignet war, sowie die niedrig auflösende Abbildung von gestreckten Zellen. In dieser Arbeit wurde das Substrat neu gestaltet und eine neuartige bildgebende Konfiguration eingeführt, die hochauflösende subzelluläre Live-Zell-Bildgebung ermöglicht. Die Vorteile dieses Systems sind vielfältig: Es kann im Labor mi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Primary cells			Primary Oligodendrozyten Vorläuferzellen, die aus neugeborenen Ratten isoliert wurden, wurden vom Labor von Dr. S. Y. Chew an der Nanyang Technological University zur Verfügung gestellt
Media
DMEM mit hohem   Glukosegehalt	Gibco	11996-065-500ml
Pen/Strep	Gibco	15070-063-100ml
FGF	Prospec	CYT-608-50ug
PDGF	Prospec	CYT-776-10ug
Media Lager Komponenten
BSA	Sigma	A9418-10G
Progesteron	Sigma	P8783-1G
Putrescine	Sigma	P5780-5G
Natriumselenit	Sigma	S5261-10G
Trijodthyronin	Sigma	T6397-100MG
Thyroxin	Sigma	T1775-100MG
Holo-Transferrin	Sigma	T0665-500MG
Insulin	Sigma	I9278
Form und PDMS-Platte
PDMS - Dow Corning Sylgard 184	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Mold - Flüssiger Kunststoff	Smooth-On	Smooth Cast 310 - Substratbeschichtungen
Poly-D-Lysin	Sigma	P6407-5MG
Fibronektin	Sigma	F1141-2MG
CellLigt H2B-GFP BacMam	Molekulare Sonden	C10594
Oberflächenfunktionalisierung
APTES	Sigma	A3648-100ml
BS3	Covachem	13306-100mg
HEPES Puffer pH 8,0	Alfa Aesar	J63578-AK-250ml
Zellablösung
Accutase	Invitrogen	A1110501-100ml