Durch die Verwendung dreidimensionaler organotypischer Kulturen zur Visualisierung der Morphologie und funktionellen Marker von Speicheldrüsen können neue Einblicke in die Mechanismen von Gewebeschäden nach Strahlung gegeben werden. Hier wird ein Protokoll zu den Abschnitten, Kultur, Bestrahlung, Fleck und Bild 50 – 90 μm dicken Speicheldrüsenabschnitten vor und nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung beschrieben.
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Methodenartikel
Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hyposalivation und Xerostomia erzeugen chronische orale Komplikationen, die die Lebensqualität bei Kopf-und Nackenkrebspatienten, die mit Strahlentherapie behandelt werden, verringern. Experimentelle Ansätze zum Verständnis von Mechanismen der Speicheldrüsenfunktionsstörungen und Restaurationen haben sich auf in vivo-Modellen konzentriert, die durch die Unfähigkeit, therapeutische Kandidaten und Effizienz in der Transfektion systematisch zu untersuchen behindert werden, behindert werden. Fähigkeit, bestimmte Gene zu manipulieren. Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Wir haben die immunfluoreszierende Färbung und die konfokale Mikroskopie eingesetzt, um festzustellen, wann bestimmte Zellpopulationen und Marker während einer 30-tägigen Kulturperiode vorhanden sind. Darüber hinaus werden in vivo Strahlungsmodelle in Kulturen ausgewertet, die ex vivo bestrahlt werden. Diese Methode, die sich vorwärts bewegt, ist eine attraktive Plattform für die schnelle Ex-vivo-Bewertung von Murin-und menschlichen Speichelgewebe Reaktionen auf therapeutische Wirkstoffe, die Speichelfunktion verbessern.
Einleitung
Die richtige Speicheldrüsenfunktion ist für die Mundgesundheit von entscheidender Bedeutung und wird nach der Kopf-und Nackenkrebsbehandlung mit der Strahlentherapie1 verändert. 2017 wurden in den USA 2 knapp 50.000 neue Fälle von Kopf-und Nackenkrebsgemeldet. Aufgrund der gewebeschädigenden und häufig irreversiblen Auswirkungen der Strahlentherapie auf umgebende normale Gewebe wie Speicheldrüsen sind die Patienten oft mit schweren Nebenwirkungen und verminderter Lebensqualität2,3, 4. Platz Häufige Komplikationen, die durch Str....
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Protokoll
1. Zubereitung von Vibrationen
- Sprühbare, abnehmbare Bauteile des Vibratoms inklusive Puffertablett, Messerbefestigung, Acharo-Blockform und Laborfolie mit 70% Ethanol, dann UV-Sterilize für mindestens 30 min.
- Legen und sichern Sie ein zusätzliches Blatt Laborfolie über das Puffertablett, um zu verhindern, dass Eis hereinfällt.
- Füllen Sie die Eiskammer mit zerkleinertem Eis, entfernen Sie die Laborfolie aus dem Puffertablett und füllen Sie das Puffertablett mit 100 ml eiskalter 1x Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), ergänzt um 1% Penicillin-Streptomycin-Ampicillin (PSA).
- Legen Sie eine Edelstahl-Rasierklinge in den Messerhalte....
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Ergebnisse
Primär werden 2-D-Kulturen in fetalem Rinderserum (FBS) angebaut, die Medien ergänzen,währenddie primäre 3-D-Salisphere-Kultur typischerweise unter serumfreien Bedingungen10,11kultiviert wird. Darüber hinaus haben die beiden vorhergehenden Studien, die Vibratomkulturen aus Speicheldrüsen verwendeten, ihre Abschnitte in 0% oder 10% FBS kultiviert,dieMedien19,20ergänzt. Die .......
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Diskussion
Die Speicheldrüsenforschung hat eine Reihe von Kulturmodellen genutzt, darunter verewigte 2-D-Kulturen, primäre 2-D-Kulturen, 3-D-Salisphere-Kulturen und 3-D-Organkulturen von embryonalen Explanten, um Fragen zur zugrunde liegenden Biologie und Physiologie zu klären. Diese Kulturmodelle haben in einer Vielzahl von Forschungsfragen aufschlussreiche Informationen geliefert und werden auch in Zukunft wichtige Werkzeuge in der Speichelforschung sein. Zu den Grenzen dieser Kulturmodelle gehören die Modulation der p53-Aktivitä.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unter anderem durch die Pilotförderung unterstützt, die das Office of Research and Discovery and National Institutes of Health (R01 DE023534) an Kirsten Limesand zur Verfügung stellte. Der Cancer Biology Training Grant, T32CA009213, hat Wen Yu Wong unterstützt. Die Autoren danken M. Rice für seinen wertvollen technischen Beitrag.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratom zum Trennen |
| Doppelschneidigen Edelstahl-Rasierklingen | Elektronenmikroskopie Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-Well-Platte | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Sekundenkleber | Loctite | N/A | Gekauft im Baumarkt |
| Natural Red Sable Runde Pinsel | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicinsulfat | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-Glutatmin | Gibco | 25030-081 | |
| Spurenelemente | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermaler Wachstumsfaktor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortison | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinsäure | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Medien | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Zellkultureinsatz | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0,4 μm Porengröße für 24-Well-Platte |
| 0,4 % Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Nur verwendete LIVE-Farbstoffkomponente |
| Anti-Ki-67 Antikörper | Zellsignaltechnologie | 9129S | |
| Anti-E-Cadherin Antikörper | Zellsignaltechnologie | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antikörper | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antikörper | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-Amylase Antikörper | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antikörper | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antikörper | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antikörper Beschriftungskit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Rinderserumalbumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyd Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | Nicht mehr verkauft |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Eindeckmedien | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spektral Konfokal | Leica Biosystems | N/A | Für die konfokale Bildgebung |
| Leica DMIL Inverses Phasenkontrastmikroskop | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapie-Instrument | Atomenergie von Kanada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose-Blockform |
Referenzen
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians.
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Nachdrucke und Genehmigungen
