Summary
استخدام الثقافات المجسمة ثلاثية الابعاد لتصور المورفولوجية والعلامات الوظيفية للغده اللعابية قد توفر رؤى جديده في أليات تلف الانسجه بعد الإشعاع. الوصف هنا هو بروتوكول للقسم ، والثقافة ، والإشعاع ، وصمه عار ، وصوره 50-90 μm الغدد اللعابية سميكه الأجزاء قبل وبعد التعرض للإشعاع المؤين.
Abstract
يخلق التهاب الجفاف والتهابات الفموية مضاعفات مزمنة في الفم تقلل من نوعيه الحياة في مرضي سرطان الراس والرقبة الذين يعالجون بالعلاج بالاشعه. وقد ركزت النهج التجريبية لفهم أليات الخلل في الغدد اللعابية والترميم علي في نماذج الجسم الحي ، والتي تعوقها عدم القدرة علي الشاشة بشكل منهجي المرشحين العلاجية والكفاءة في النقل القدرة علي التلاعب الجينات محدده. والغرض من هذا البروتوكول الثقافة العضوية الغدد اللعابية لتقييم الوقت القصوى للحياة الثقافية وتميز التغيرات الخلوية بعد العلاج الإشعاعي السابق فيفو. استخدمنا تلطيخ النيون المناعي والمجهر البؤري لتحديد متى السكان خليه محدده وعلامات موجودة خلال فتره الثقافة 30 يوما. الاضافه إلى ذلك ، يتم تقييم العلامات الخلوية التي تم الإبلاغ عنها سابقا في نماذج الإشعاع المجرية في الثقافات التي يتم المشع السابقة الجسم. المضي قدما ، وهذا الأسلوب هو منصة جذابة للتقييم السريع السابق الجسم البشري من murine والإنسان الغدد اللعابية الاستجابات الانسجه للعوامل العلاجية التي تحسن وظيفة اللعابية.
Introduction
وظيفة الغدة اللعابية السليمة ضرورية لصحة الفم ويتم تغييرها بعد علاج سرطان الراس والرقبة مع المعالجة الاشعاعيه1. في 2017 ، تم الإبلاغ عن ما يقرب من 50,000 حاله جديده من سرطان الراس والرقبة في الولايات المتحدة2. بسبب الآثار الضارة للانسجه والتي لا رجعه فيها في كثير من الأحيان من العلاج الإشعاعي علي الانسجه الطبيعية المحيطة مثل الغدد اللعابية ، وغالبا ما تترك المرضي مع الآثار الجانبية الحاده وانخفاض نوعيه الحياة2،3، 4- المضاعفات الشائعة الناجمة عن الاضرار الاشعاعيه تظهر في اعراض مثل جفاف (الشعور الذاتي للفم الجاف) ، تسوس الأسنان ، ضعف القدرة علي مضغ وابتلاع ، وضعف الكلام ، والاصابه بالميكروبات الدقيقة عن طريق الفم2، 3 , 4. هذه الاعراض مجتمعه يمكن ان تؤدي إلى سوء التغذية وضعف البقاء علي قيد الحياة في الافراد المتضررين5. في حين ان خلل الغدد اللعابية في هذا العدد من السكان قد تم توثيقها جيدا, وقد تم التنازع أليات الكامنة وراء الاضرار التي لحقت خلايا اسينار, وهناك القليل من التكامل بين النماذج الحيوانية المختلفة6,7.
الأساليب الحالية لدراسة وظيفة الغدة اللعابية والاضرار الناجمة عن الإشعاع تشمل استخدام في نماذج الجسم الخلوي ، وخطوط الخلايا الخلد ، وثنائيه الابعاد (2-د) الثقافات الخلية الاوليه ، وثلاثي الابعاد (3-D) ساليسفيري الثقافات8، 9،10،11،12. تقليديا ، ونماذج ثقافة الخلية من خطوط الخلايا الخلد والثقافات ثنائيه الابعاد تنطوي علي خلايا أحاديه الطبقات مثقف علي الأسطح المسطحة وقيمه للتجارب سريعة وسهله وفعاله من حيث التكلفة. ومع ذلك ، فان ظروف ثقافة الخلايا الاصطناعية يمكن ان تغير حاله التمايز والاستجابات الفسيولوجية للخلايا المعرضة لظروف مختلفه ، وغالبا ما تفشل النتائج في الترجمة إلى نماذج الكائنات الحية كلها14،15. الاضافه إلى ذلك ، تتطلب ثقافات الخلايا الخلده تحويرا للنشاط p53 ، وهو أمر بالغ الاهميه لاستجابه الغدة اللعابية لتلف الحمض النووي16،17.
ساليسفيري ثقافات ثلاثية الابعاد للخلايا الجذعية والسلف في الوقت المبكر في الثقافة وكانت مفيده لفهم الحساسية الاشعاعيه لهذه المجموعة الفرعية من خلايا الغدد اللعابية9,18. ومن القيود الحاسمة لجميع هذه النماذج الثقافية انها غير فعاله في تصور الهيكل ثلاثي الابعاد للغده اللعابية ، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتفاعلات خلايا الخلايا علي مختلف الطبقات ، والتي تعتبر حاسمه في تحوير اللعابية إفراز15. الحاجة إلى طريقه التي تشمل سلوك الانسجه ككل ولكن يمكن أيضا ان يتم التلاعب بها في ظل الظروف المختبرية لدراسة اثار العلاج ضروري لمزيد من اكتشاف أليات الكامنة وراء الغدة اللعابية الناجمة عن الإشعاع الخلل.
وقد تم توثيق الانسجه الحية والثقافة في السابق19,20 وغالبا ما تستخدم لدراسة التفاعلات الانسجه الدماغ21. في الدراسات السابقة ، تم تقسيم نكفي (PAR) انسجه الغدد اللعابية من الفئران في ما يقرب من 50 μm ومثقف لتصل إلى 48 h ، وتحليل القدرة علي البقاء ، وموت الخلايا ، ووظيفة تم تنفيذها بعد ذلك19. Su et al. (2016) توسعت علي هذه المنهجية عن طريق زراعه الغدد فك الإنسان (SMGs) مقسمه علي 35 μm أو 50 μm لمده 14 يوما20. الطريقة المقترحة هي التقدم في انه يشمل كلا من الغدد اللعابية نكفي و فك في 50 μm و 90 μm وتقييم الثقافات لمده 30 يوما. القدرة علي قطع مجموعه من سماكه الانسجه أمر مهم في تقييم التفاعلات خليه خليه وخليه-ECM التي هي ذات الصلة للعمليات الخلوية بما في ذلك قطبيه الاساسيه الرمزية واللعاب لإفراز. وعلاوة علي ذلك ، تعرضت شرائح الغدد اللعابية للإشعاع اثناء وجودها في الثقافة لتحديد جدوى هذا النموذج الثقافي لدراسة تلف الغدد اللعابية المستحث بالإشعاع.
والغرض من هذا البروتوكول الثقافة العضوية الغدد اللعابية لتقييم الوقت القصوى للحياة الثقافية وتميز التغيرات الخلوية بعد العلاج الإشعاعي السابق فيفو. لتحديد الحد الأقصى من المقاطع الزمنيه التي هي قابله للحياة بعد تشريح ، تريلون الأزرق تلطيخ ، الحية تلطيخ الخلية ، و مناعي تلطيخ للموت الخلية تم تنفيذها. واستخدم المجهر البؤري المجهري وتلطيخ النيون المناعي لتقييم مجموعات الخلايا المحددة ، والهياكل المورفولوجية ، ومستويات الانتشار. كما تعرضت ثقافات قسم الانسجه للإشعاع المؤين لتحديد اثار الإشعاع علي علامات مختلفه في هذا النموذج ثلاثي الابعاد. وتمت مقارنه التحريض علي موت الخلايا ، واضطراب السيتوكيلميتال ، وفقدان علامات التمايز ، والانتشار التعويضي في ثقافات الجسم السابق المشعة بالدراسات السابقة للنماذج المجرية. وتوفر هذه المنهجية وسيله للتحقيق في دور تفاعلات الخلايا الخلوية بعد الاضرار الاشعاعيه وتوفر نموذجا تجريبيا لتقييم فعاليه التدخلات العلاجية بكفاءة (التلاعب بالجينات أو العوامل الدوائية ) التي قد تكون اقل ملاءمة للنماذج المجرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد الذبذبات
- رذاذ مكونات للانفصال من الذبذبات بما في ذلك صينية العازلة ، شفره المرفقات ، والعفن كتله الاغاروز ، والفيلم المختبر مع 70 ٪ الايثانول ، ثم الاشعه فوق البنفسجية تعقيم لمده لا تقل عن 30 دقيقه.
- وضع وتامين ورقه اضافيه من الفيلم المختبري علي الدرج العازلة لمنع الجليد من الوقوع فيها.
- ملء غرفه الجليد مع سحق الجليد ، وأزاله الفيلم المختبر من علبه العازلة ، وملء صينية العازلة مع 100 mL من الجليد الباردة 1x الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) حل تستكمل مع 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين-امبيسلين (PSA).
- وضع شفره الحلاقة الفولاذ المقاوم للصدا في حامل النصل. استخدام مفك البراغي لتشديد/تخفيف وتغيير زاوية النصل.
2. اعداد عينه من الانسجه في كتله اجنشا والتماس باستخدام الذبذبات
- الاوتوكلاف جميع الاداات اللازمة تشريح والتعقيم بما في ذلك ملقط ، مقص ، والرسام.
- اعداد 3 ٪ نقطه انصهار منخفضه اجنشا في 1x العقيمة والميكروويف حتى يذوب في محلول. تاكد من ان الحل لا يغلي فوق ودوامه الزجاجة بشكل دوري لخلط.
ملاحظه: منع المنخفضة ذوبان اجنشا من ترسيخ من خلال إبقائه في حمام الماء الدافئ. والسوائل منخفضه الذوبان هي السائل عند 37 درجه مئوية وتحدد في 25 درجه مئوية. ومع ذلك ، يجب ان يكون حمام المياه أدناه 40 درجه مئوية من أجل صب الاجثار حول الانسجه في درجه الحرارة الفسيولوجية. - عزل الغدد اللعابية ووضع الانسجه تشريحها في 2 مل الجليد الباردة 1x تلفزيوني تستكمل مع 1 ٪ PSA في العقيمة ، 30 ملم طبق الثقافة.
- باستخدام ملقط الاوتوكلاف ، وأزاله الغدد اللعابية من 1x تلفزيوني + 1 ٪ PSA الحل والموقف في الجزء السفلي من العفن التضمين. ملء العفن مع السائل 3 ٪ نقطه انصهار منخفضه اجنشات لتغطيه الانسجه.
- باستخدام ملقط ، وضبط الانسجه إلى منتصف كتله ووضع الغدة اللعابية في الطائرة المناسبة. أفضل المقاطع العرضية لفك والغدد النكفية هي في الطائرة العمودية.
- مكان اجبرز كتله علي الجليد لمده 10 دقيقه لتتصلب.
- بعناية تشغيل شفره الحلاقة حول الحافة الخارجية من اجنشا لتخفيف والسماح للكتلة تنزلق علي الفيلم المختبر الاشعه فوق البنفسجية تعقيمها من الخطوة 1.1.
- استخدام شفره الحلاقة لقطع مربع اجبرز التي تحتوي علي الغدة اللعابية. تاكد من ان الطائرة من القسم مستقيمة وموازيه للجانب المعاكس من كتله (السطح الذي سيتم لصقها أسفل). منذ الاغاروزها لا يتسلل الانسجه ، لا تقليم قباله الكثير من اجنشا حول الانسجه بحيث سيتم دعم الانسجه بشكل جيد.
- استخدام الغراء الفائق لإرفاق كتله إلى سطح القطع.
- القسم في 50 μm أو 90 μm سمك بواسطة الذبذبات بسرعة 0.075 مم/ثانيه وتردد 100 هرتز.
ملاحظه: اعداد الذبذبات علي اعلي تردد وادني سرعه شفره يوفر شرائح الأمثل. - جمع المقاطع في طبق ثقافة الانسجه 24 حسنا التي تحتوي علي ~ 1 مل الجليد الباردة لكل بئر باستخدام الاوتوكلاف ، فرشاه الشعر الطبيعي ، ووضع الفرشاة في 70 ٪ الايثانول بين مجموعات شريحة للحفاظ علي العقم.
3. مقاطع الخياطة
- الاوتوكلاف ملعقة صغيره وملقط.
- جعل الأوراق المالية الثقافة الذبذبات مع أو بدون مصل البقري الجنينية: DMEM/F12 وسائل الاعلام تستكمل مع 1 ٪ PSA ، 5 ميكروغرام/مل ترانسفيرين ، 1.1 μM هيدروكورتيزون ، 0.1 μM حمض الريتينويك ، 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، 80 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة ، 5 ملم L-الجلوتامين ، 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين كبريتات ، و 10 μL/mL خليط عنصر الأثر. أضف مبلغا مناسبا لهذا الأمر لجعل 0% ، 2.5% ، 5.0% ، أو 10% حلول.
- قبل التماس ، أضافه 300 μL من وسائل الاعلام قبل تسخينها ووضع 12 ملم قطرها ، 0.4 μm المسام حجم الغشاء ادراج في كل بئر من لوحه ثقافة الانسجه 24 جيدا. يجب ان تصل وسائل الاعلام إلى أسفل الغشاء لإنشاء واجهه سائله للثقافة.
- وضع برفق المقاطع اللعابية علي راس الغشاء ادراج باستخدام ملعقة صغيره والثقافة في 37 درجه مئوية في ترطيب 5 ٪ CO2 و 95 ٪ الهواء الغلاف الجوي حاضنه.
- أضافه تقريبا 300 μL وسائط الثقافة الاساسيه في البئر وقطرات قليله في ادراج الغشاء (تقريبا 40 μL) كل يوم أو حسب الحاجة. وأظهرت الزراعة السليمة ان الخلايا قادره علي البقاء علي قيد الحياة والحفاظ عليها لمده تصل إلى 30 يوما الجسم الحي السابق.
4. تشعيع أقسام الغدد اللعابية
- معالجه المقاطع بجرعة واحده من الإشعاع (5 غراي) باستخدام الكوبالت-60 (أو ما يعادلها) المشع.
- أقسام النقل إلى منشاه المشع باستخدام حاويه الستايروفوم مغطاه لتجنب التقلبات في درجه الحرارة. الاضافه إلى ذلك ، يجب توخي الحذر اثناء النقل مره أخرى إلى الحاضنة المختبرية للتاكد من ان وسائل الاعلام لا دفقه علي غطاء الثقافة والحث علي التلوث.
- وضع لوحه 24 بئر تحتوي علي أقسام الغدد اللعابية 80 سم من مصدر الإشعاع ، في وسط 32 "س 32" حقل الإشعاع. وسوف تختلف حسابات الجرعة الاشعاعيه والوقت المناظر في المبرد بواسطة الاداه والكوبالت-60 تسوس.
- مواصله رصد وزراعه هذه الأقسام علي النحو المبين في القسم 3.
5. القدرة علي البقاء تلطيخ
- يستنشق وسائل الاعلام القديمة وغسل شرائح مرتين مع معقمه ، قبل الإحماء 1x تلفزيوني.
- الأقسام وصمه عار مع صبغ الأزرق التريلون.
- استخدم ملعقة صغيره لتحريك الشريحة من الثقافة إلى شريحة زجاجيه.
- أضف 0.4% من المحلول الأزرق التريبين إلى شريحة الذبذبات مع حجم كاف لتغطيه الانسجه (10 – 20 μL).
- احتضان الشرائح في درجه حرارة الغرفة (RT) في التريتان الأزرق لمده 1 – 2 دقيقه لصبغ لاختراق الانسجه. الخلايا غير القابلة للحياة ستكون ملطخه باللون الأزرق ، ستكون الخلايا القابلة للحياة غير ملطخه.
- المقاطع وصمه عار مع calcein ، AM صبغ الخلية الحية.
- أضافه كميه كافيه من وصمه عار لتغطيه القسم في بئر واحده من 24 جيدا-لوحه (200-300 μL).
- احتضان الشرائح في RT لمده 15 دقيقه للسماح باختراق الصبغة.
- قم بازاله المقطع بعناية من البئر ووضعه علي شريحة زجاجيه. جبل شرائح مع 1 قطره من وسائل الاعلام المتصاعدة.
- مقاطع الصورة علي المجهر الفلورسنت في الاثاره/الانبعاثات الموجية من 488 نانومتر و 515 nm.
6. الأجسام المضادة تلطيخ المقاطع الذبذبات
ملاحظه: يوفر التالية بروتوكول تلطيخ الأجسام المضادة العامة المحددة ل Ki-67; ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع اي الأجسام المضادة. يتم اجراء جميع يغسل في RT ما لم يذكر خلاف ذلك.
- في طبق ثقافة الانسجه متعددة الآبار ، يستنشق قباله وسائل الاعلام ويغسل 2x علي الأقل مع 1x العقيمة تلفزيوني.
- إصلاح المقاطع باستخدام 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
- يستنشق قباله 4 ٪ PFA ويغسل 3x مع PBT [1x تلفزيوني ، 1 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) ، 0.1 ٪ تريتون X-100].
ملاحظه: يمكن تخزين المقاطع في 1x تلفزيوني في 4 درجه مئوية والملون في وقت لاحق. الحد الأقصى لوقت التخزين الذي تم اختباره في هذه المخطوطة هو 3 أسابيع. وقت تخزين أطول سوف تحتاج إلى الأمثل من قبل المستخدم الفردي إذا كان ذلك مطلوبا. - يتخلل المقاطع باستخدام 0.3 ٪ تريتون X-100 في 1x تلفزيوني لمده 30 دقيقه.
ملاحظه: يمكن تعديل هذه الخطوة وتحسينها لتلطيخ الأجسام المضادة المحددة والتغلغل. - Pipet قباله حل التغلغل.
- غسل شرائح 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني ، 1 ٪ بوسنيا ، و 0.1 ٪ تريتون X-100 (PBT).
- منع الشرائح مع عامل الحجب مع 1 ٪ المصل الماعز العادي لمده 1 ساعة.
- غسل الشرائح 3x لمده 5 دقائق مع PBT.
- احتضان الشرائح بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية مع 500 μL المضادة لKi67 أرنب الأضداد الاحاديه الجسم المخفف في 1 ٪ جيش الصرب البوسنيين في 1x تلفزيوني.
ملاحظه: لتلطيخ phسبائك ، تخطي الخطوة 6.9 والمضي قدما باستخدام بروتوكول لل phمسبوك معينه المستخدمة. لمضاد الحمض النووي ، انتقل إلى الخطوة 6.15. - يستنشق المضادة لKi67 أرنب الأجسام الأضداد الاحاديه.
- غسل الشرائح 6x لمده 5 دقائق في 1x تلفزيوني.
- احتضان الشرائح في 500 μL من فلوريسسينتلي مترافق الأجسام المضادة الثانوية متوافقة مع الأجسام المقاومة لKi67 المخفف في 1 ٪ جيش صرب الجمهورية في 1x تلفزيوني في RT ل 1.5 h مغطاه من الضوء.
ملاحظه: استنادا إلى الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة ، يمكن زيادة تحسين وقت الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية من قبل المستخدم الفردي. الاضافه إلى ذلك ، فان الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء. يجب ان يتم تنفيذ جميع يغسل اللاحقة في الظلام. - يستنشق الأجسام المضادة الثانوية.
- غسل شرائح ل 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني.
- غسل الشرائح لمده 5 دقائق في الماء منزوع الأيونات.
- شرائح مضاده للبقع مع DAPI (1 ميكروغرام/مل) لمده 20 دقيقه في RT.
- غسل الشرائح (مره واحده) لمده 5 دقائق في الماء منزوع الأيونات.
- شرائح الجبل مع قطره واحده (~ 40 μL) من وسائل الاعلام المتصاعدة. لتجنب الفقاعات الزائدة ، ضع المشبك ببطء علي الوسائط المتصاعدة علي الشريحة ، بدءا من زاوية 45 درجه.
- لمنع سحق المقاطع سميكه مع coverslip ، جبل كل شريحة مع فاصل. يمكن إنشاء فاصل عن طريق وضع حافه من الشحوم فراغ في مربع حول القسم الانسجه.
- عند وضع المشبك ، يمكن ختم حواف المشبك بالشحوم الفراغية. اضغط لأسفل علي حواف المشبك مع الإبهام لتلتزم بحزم علي الشريحة. بدلا من ذلك ، ختم كوفيرسليب علي شريحة المجهر باستخدام طلاء الأظافر واضحة.
7. التصوير المقاطع الذبذبات
- صوره الشرائح الملونة في غضون 5 أيام من تلطيخ.
- الحصول علي أقسام بصريه من شرائح الذبذبات الملونة باستخدام المجهر البؤري. مع المجهر البؤري ، الحصول علي z-كومه في حجم خطوه محدده أو اتخاذ الصور الفردية اعتمادا علي تصميم المستخدم التجريبية. يمكن فحص الصور علي اي شاشه كمبيوتر بعد التجميع البؤري.
ملاحظه: نظرا لسماكه شرائح الذبذبات ، فمن المستحسن ان يتم استخدام المجهر البؤري أو نطاق مع القدرة علي المكدس z لتصور التفاصيل داخل العينات. للصور المستخدمة في هذه المخطوطة ، تم استخدام هدف النفط 63x ؛ ومع ذلك ، يمكن تصميم هذا وتعديله بشكل أكبر من قبل المستخدم الفردي والنطاق المحدد المستخدم. تم استخدام دقه البكسل الموصي بها لكل عامل الهدف والتكبير/التصغير مع أخذ عينات نيكويست المفترضة من 2.5 بكسل في X و Y لأصغر بنيه قابله للحل البصري. ومع ذلك ، يقترح بعض المعلقين 2.3 بكسل ، بينما يقترح آخرون 2.8 بكسل. يرجى الرجوع إلى دليل المجهر البيولوجي البؤري22 للحصول علي مزيد من التفاصيل حول كيفيه اجراء هذه الحسابات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تزرع الثقافات الاساسيه ثنائيه الابعاد في مصل الأبقار الجنيني (الذي تمت الاضافه اليه) في حين يتم استزراع الثقافة الاساسيه ثلاثية الابعاد ساليسفيري عاده في الظروف الخالية من المصل10,11. بالاضافه إلى ذلك ، فان الدراستين السابقتين باستخدام ثقافات الذبذبات من الغدد اللعابية المستزرعة في أقسامها في 0 ٪ أو 10 ٪ من المواد الاعلاميه المكملة19،20. وقد تم تقسيم شرائح الماوس فك بسماكة 50 μm باستخدام الذبذبات وتم تحديد الظروف الثقافية المثلي باستخدام سلسله من تركيزات الفارين (0 ٪ ، 2.5 ٪ ، 5.0 ٪ ، و 10 ٪). لتحديد خصائص البقاء علي قيد الحياة ، تم التقاط صور المجهر الساطع في الأيام الثقافية 1 و 4 و 7 و 14 و 30 بعد التقسيم (الشكل 1). بالاضافه إلى ذلك ، كانت ملطخه المقاطع الغدة مع 0.4 ٪ تريبان صبغ الأزرق والذين يعانون من المجهر مشرق حقل في 40x في النقاط الزمنيه المشار اليها (الشكل 2A). وكانت الخلايا غير القابلة للحياة ملطخه باللون الأزرق وظلت خلايا قابله للحياة واضحة.
المثل ، لتحديد خصائص البقاء علي الحياة من شرائح سمكا في 90 μm ، وقد اتخذت الصور المجهر الميداني مشرق مع وبدون تلطيخ الأزرق في اليوم 30 في الثقافات تستكمل مع 2.5 ٪ من الطراز الثاني (الشكل 2 ب). نظرا لسماكه شريحة ، 90 μm المقاطع الملونة مع الصبغة الزرقاء التريكان الكامل ثم قطع في النصف من أجل تقييم مركز شريحة (الشكل 2B). وكتاكيد لذلك ، استخدم صبغ الخلايا الحية لتقييم بقاء الخلية في ظروف مختلفه لزراعه الخلايا (الشكل 2 ج). وفي صور الحقول الساطعة ، لوحظت مستويات عاليه من الخلايا الشفافة المتبقية في الانسجه في كل من 50 ميكرومتر و 90 ميكرومتر. ومن المثير للاهتمام ، أصبحت الأقسام أكثر قتامة وعموما الانسجه المنطقة التي تتكثف مع مرور الوقت في الثقافة ، ومع ذلك جزء كبير من القسم يبدو ان البقاء علي قيد الحياة فتره الثقافة 30 يوما (الشكل 1 ، الشكل 2). وكان هذا التكثيف الأكثر وضوحا في الشروط 0 ٪ و 10 ٪ من الحالات التي تم فيها. ولوحظت الخلايا الايجابيه الزرقاء من التريكان علي محيط جميع الأقسام بغض العامة عن ظروف الذبح ، وكانت هناك زيادة في منطقه الخلايا الموجبة الزرقاء في التريكان في الظروف الثقافية بنسبه 0 في المائة بالمقارنة مع الظروف العالية للذبح (الشكل 2 ا) ، 2 ب).
وباستخدام البقع الخلوية الحية ، أظهرت المقاطع المستزرعة في 0% ادني كميه من التلطيخ ، وأديت أضافه القطاع إلى وسائل الاعلام الثقافية إلى تحسين كميه الخلايا الحية. ومعا ، أظهرت الأقسام المستزرعة في 0% انها تكثف الانسجه المرئية ، والمناطق الزرقاء الملونة المرتفعة ، وادني مستويات تلطيخ الخلايا الحية. وقد ادي أضافه 2.5% إلى الثقافات إلى تحسين كميه الانسجه الشفافة ، وتقليل المنطقة الموجبة الزرقاء ، وزيادة مستويات تلطيخ الخلايا الحية. ولا يبدو ان الزيادات الاضافيه في تركيز العمليات التي تقوم بها الخلايا تحسن قدره الانسجه علي البقاء ؛ ولذلك ، فان 2.5 في المائة من وسائط الاعلام الذبذبات كان التركيز الأمثل لهذا الشكل واستخدم كشرط للثقافة لجميع التجارب اللاحقة.
لتحديد القدرة علي البقاء لفك السابقة الانسجه المجرية شرائح بعد تشريح ، وقيمت علامات التكاثري والخلايا الشحمية في الأيام 1 ، 3 ، 7 ، 14 ، و 30 في الثقافة. وتم تقييم النشاط التكاثري بواسطة Ki67 المناعية في مجموعه فرعيه من شرائح الثقافة (الشكل 3 ا). Ki67 لوحظت خلايا ايجابيه في جميع النقاط الزمنيه التي تم تقييمها واستمرت في الحضور في اليوم 30 في الثقافة ، مع الحد الأدنى من الاختلافات بين النقاط الزمنيه. المثل ، تم تقييم درجه المبرمج من قبل المحصنة caspase-3 المناعية في مجموعه فرعيه منفصلة من الأقسام (الشكل 3B). ولوحظ مستوي منخفض من الخلايا الايجابيه caspase-3 في جميع الأوقات حتى اليوم 14 في الثقافة ، في حين ان الظروف اليوم 30 يبدو ان لديها زيادة صغيره في عدد الخلايا الموجبة caspase-3 المشقوقة في بعض المناطق. لم التقييم من حواف الانسجه لا تكشف عن مستويات اعلي من المشقوق caspase-3 ، والتي لا تلخص التلطيخ الأزرق التريان (الشكل 2). وعموما ، تشير هذه النتائج إلى ان العظات المتعلقة بالانتشار والقدرة علي البقاء لا تزال موجودة في ثقافات الذبذبات خلال فتره التقييم التي تستغرق 30 يوما.
الثقافات السميكة المقطع الذبذبات تسمح الفرصة لتقييم التفاعلات بين المكونات الخلوية للانسجه معينه علي عمق يتضمن أكثر من واحد من سمك الخلايا الظهاريه في كل اتجاه. الاضافه إلى ذلك ، من المهم ان تكون قادره علي الثقافة علي حد سواء الغدد اللعابية الرئيسية ، كما انها تختلف في تكوين البروتينات اللعابية المنتجة ، والهندسة النسيجية ، والحساسية الاشعاعيه ، وغيرها من الميزات الهامه. لتحديد السكان الخلوية المختلفة في ثقافات الغدد الفكه ، كانت ملطخه المقاطع فك مع البريد-cملتصقون (e-cad) للكشف عن الخلايا الظهاريه ، السلس العضلات الاكتين (SMA) للكشف عن الخلايا العضلية ، وخيوط الاكتين (phمسبوك) إلى الكشف عن الهياكل خلوي خلال 30 يوما في الثقافة (الشكل 4a).
ولوحظ تلطيخ الكترونيه علي اغشيه غالبيه الخلايا والكشف عنها طوال فتره الثقافة 30 يوما. تم الكشف عن الخلايا SMA + طوال فتره الثقافة ، مع مستويات مماثله في كل نقطه زمنيه. [Cytoskeletal] بدا تنظيم من [اكتين] خيوط أيضا ان يكون حافظت في كل وقت نقطه يقيم. وعلي النقيض من ذلك ، كانت هناك علامات خلوية لم يتم الاحتفاظ بها باستمرار خلال فتره التقييم بأكملها ، وشملت هذه العلامات CD31 (الاوعيه الدموية) ، TUBB3 (الخلايا العصبية) ، و اكوابورين-5 (Aqp-5 ، علامة اكينار) (الشكل 4 ب). ولوحظت بوضوح هياكل الاوعيه الدموية من خلال المكدسات المحورية في اليومين 1 و 3 بعد الثقافة ؛ ومع ذلك ، يبدو ان هذه الهياكل مجزاه في اليوم 7. المثل ، كانت عمليات الخلايا العصبية سليمه خلال اليوم الأول من الثقافة ، وبدا تضاءل في اليوم 3 ، وفقدت في وقت لاحق في اليوم 7 في الثقافة. Aqp5 + ولوحظت الخلايا في الأيام 1, 3, 7, و 14 في الثقافة; وان كان ، في اليوم 14 ، بدا مستوي تلطيخ الشاملة لخفض ، مع تشابه أكثر الحبيبية في الخلايا الايجابيه المتبقية. وتشير هذه البيانات إلى ان الثقافات فك تحتوي علي تنوع مكونات الانسجه مع الحفاظ علي أنواع الخلايا الوعائية والعصبية لفترات الثقافة أقصر ، وأنواع الخلايا الظهاريه وميوبيثيليال لفترات الثقافة أطول.
في حين تم الإبلاغ عن الثقافات الذبذبات-التي تم ذكرها سابقا للغده اللعابية النكفية ، تم الحفاظ علي الثقافات ل 48 h ، مما يحد من الإطار الزمني الذي يمكن دراستها. من أجل تحديد ما إذا كان يمكن الحفاظ علي الغدد نكفي لفتره أطول ، تم تقسيم الغدد نكفي murine ومثقف لمده 1 ، 3 ، 7 ، أو 14 يوما. تم الحصول علي عدد اقل من المقاطع من الغدة النكفية بسبب صغر حجمها في الفئران. لذلك ، لم تتم محاولة فتره الثقافة لمده 30 يوما. تم تقييم الشرائح للانتشار عن طريق تلطيخ النيون المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد Ki67. وعلي غرار الثقافات الفكه ، لوحظت Ki67 خلايا ايجابيه في جميع النقاط الزمنيه ، مما يشير إلى ان الخلايا تحتفظ بدرجه من الانتشار في الثقافة (الشكل 5 ا).
الاضافه إلى ذلك ، تم تقييم الحفاظ علي علامات اسينار وظيفية (α الاميليز و Aqp5) ، وعلامة الظهاريه (E-cad) ، والاوعيه الدموية (CD31) والخلايا العصبية (TUBB3) خليه السكان. الاميليز هي واحده من البروتينات الأكثر وفره التي تنتجها الخلايا الظهاريه نكفي المتمايزة وكثيرا ما فقدت خلال الذبح 2-د من الخلايا النكفية الاساسيه. في الثقافات الذبذبات ، لوحظ الاميليز في خلايا اكينار واستبعد من الخلايا الاقنيه طوال فتره الثقافة 14 يوما (الشكل 5 ب). علي غرار الثقافات الفكه ، كانت Aqp5 + الخلايا موجودة في الثقافات النكفية في كل نقطه زمنيه ، مع اليوم 14 الثقافات التي تظهر مستويات منخفضه مقارنه بالنقاط الزمنيه السابقة (الشكل 5C). وأبقيت المستويات الكترونيه أيضا علي اغشيه غالبيه الخلايا خلال فتره الثقافة التي استمرت 14 يوما (الشكل 5 د). ويبدو ان هياكل الخلايا العصبية قد حافظت عليها خلال فتره الثقافة التي استمرت 7 أيام ولم يتم تقييمها في وقت لاحق (الشكل 5 هاء). وعلي النقيض من ذلك ، ظهرت هياكل الاوعيه الدموية سليمه خلال اليوم الأول في الثقافة ، وكانت الهياكل الصغيرة فقط حاضره في اليومين 3 و 7 في الثقافة (الشكل 5 واو). وتشير هذه البيانات إلى ان الثقافات النكفية تحافظ علي قدراتها التكاثرية وقدراتها الوظيفية لمده 7-14 يوما في الثقافة ويحتمل ان تظهر هيكلا أكثر سلامه للانسجه لفتره زمنيه أطول.
وعولجت الفائدة الوظيفية لنموذج الثقافة الذبذبات بمعالجه نكفي أو فك الثقافات بجرعة واحده من الإشعاع (الشكل6، الشكل 7، الشكل 8). وقد ركزت الاعمال السابقة في نماذج الماوس المشع علي الغدة النكفية وأظهرت التحريض من المبرمج ان قمم في 24 ح, التعريفي للانتشار التعويضي بدءا من اليوم 5, اضطراب خيوط الاكتين بدءا من اليوم 5, وفقدان علامات التمايز (علي سبيل المثال ، الاميليز) في اليوم 1423،24،26. تشعيع الثقافات النكفية الذبذبات ادي إلى زيادات في المبرمج في اليوم 1 ، والزيادات في الانتشار في اليوم 7 ، واضطراب خيوط الاكتين في اليوم 7 ، والتخفيضات في الاميليز في اليوم 7 (الشكل 6). تشعيع الثقافات الفكه الذبذبات ادي إلى زيادات في المبرمج في الأيام 1 و 3 ، والزيادات في الانتشار في اليوم 7 ، واضطراب خيوط الاكتين في اليوم 7 (الشكل 7). [ا-كتكت] ظهر مستويات سليمه نسبيا في كلا [نكفي] وفك ثقافات, اي كان مماثله إلى في [فيفو] ملاحظات26. الوظيفية اسينار علامات الخلية aqp-5 في أقسام الغدة فك و الاميليز في أقسام الغدة نكفي انخفض في اليوم 14 ، مقارنه مع النقاط الزمنيه غير المعالجة المقابلة (الشكل 8). وتشير هذه البيانات إلى ان التغيرات في الانسجه الناجمة عن الإشعاع التي لوحظت في الجسم الآخر لوحظت أيضا في ثقافات الذبذبات المشعة.
الشكل 1: مشرق حقل المجهر الصور من 50 μm فك الأقسام. تم تشريح الغدد فك من الفئران FVB الإناث (4-8 أسابيع من العمر) ، مقسمه إلى 50 μm سمك ، ومثقف علي ادراج ثقافة الخلايا العضوية لمده 1 ، 4 ، 7 ، 14 ، و 30 يوما بعد تشريح في 0 ٪ ، 2.5 ٪ ، 5.0 ٪ ، و 10 ٪ الجنين البقري المصل (الدم) في وسائل الاعلام تحديد خصائص الثقافة وتحسين ظروف الثقافة. قضبان المقياس = 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صبغ القدرة علي البقاء فك الأقسام. (ا) صور المجهر الميداني الساطع من 50 μm فك تشريح من 4 إلى 8 أسابيع الفئران fbv الإناث القديمة وملطخه باللون الأزرق التريبان (0.4 ٪) في 1 ، 3 ، 7 ، 14 ، و 30 يوما في الثقافة مع وسائل الاعلام التي تحتوي علي 2.5 ٪ الجنين البقري المصل (المعرض). (ب) صور المجهر الميدانية الساطعة لأقسام فك ميكرومتر (اللوحة اليسرى) ، ملطخه باللون الأزرق التريبين (اللوحة الوسطي) ، مقطعه إلى نصفين وملطخه باللون الأزرق التريبين (اللوحة 90 اليمني) ، ثم مثقف إلى 30 يوما بعد تشريح في وسائل الاعلام التي تحتوي علي 2.5 ٪. (ج) الصور الفلورية التي تبلغ 50 ميكرومتر من الأقسام الفكه المستزرعة في مختلف تركيزات القطاعات (0 في المائة ، 2.5 في المائة ، 5 في المائة ، 10 في المائة) ملطخه مع calcein AM للاشاره إلى الخلايا الحية (الأخضر) في اليوم الثقافي 7. قضبان المقياس = 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم العلامات التكاثرية والتي تنشر في فك شرائح النسيج العضوي. تم تشريح الغدد فك من الفئران FVB الإناث (4-8 أسابيع من العمر) ، وشرائح إلى 50 μm سمك ، ومثقف في وسائل الاعلام تستكمل مع 2.5 ٪ من الخلية علي ادراج ثقافة الخلايا العضوية لمده 1 ، 3 ، 7 ، 14 ، و 30 يوما بعد تشريح. وفي النقاط الزمنيه المشار اليها ، كانت الشرائح ثابته وملطخه بعلامات التكاثر (Ki67) وعلامات ابوتوتيك (المشقوقة-3). (ا) تلطيخ النيون المناعي للخلايا الموجبة لKi67 (الأخضر) والنواة (الأزرق). (ب) تلطيخ النيون المناعي للخلايا المشقوقة-3-postive (الأحمر) والنواة (الأزرق) من وجهي نظر من شريحة. تعرض لوحه الصف العلوي الخلايا الموجبة caspase-3 المشقوقة علي حافه شريحة ، وتعرض لوحه الصف السفلي الخلايا الموجبة لانزيم caspase-3 من منتصف الشريحة. تم اختيار الصور المنسقة التمثيلية من عده مكدسات z لكل نقطه زمنيه. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: وجود الهياكل الخلوية في فك شرائح النسيج العضوي . وقد تم تشريح الغدد فك من الفئران FVB الإناث (4-8 أسابيع من العمر) ، وشرائح إلى 50 μm سمك ، ومثقف في وسائل الاعلام تستكمل مع 2.5 ٪ من الخلية علي ادراج ثقافة الخلايا العضوية لمده 1 ، 3 ، 7 ، 14 ، أو 30 يوما بعد تشريح. وفي النقاط الزمنيه المشار اليها ، كانت الشرائح ثابته وملطخه بالعلامات المطابقة مع النواة (الأزرق). (ا) تم تقييم الأقسام الفكه في الأيام 1 و 7 و 14 و 30 بعد التشريح لمستويات المواد الكترونيه ، والعضلات الملساء (SMA) ، و (phسبائك). (ب) تم تقييم أقسام فك في الأيام 1 و 3 و 7 لمستويات CD31 (الاوعيه الدموية) و TUBB3 (الخلايا العصبية). تم تقييم اكوابورين-5 (Aqp5) في الأيام 1 و 3 و 7 و 14. تم اختيار الصور المنسقة التمثيلية من عده مكدسات z لكل نقطه زمنيه. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييم العلامات التكاثرية والوظيفية في شرائح النسيج العضوي الاسمي. وقد تم تشريح الغدد نكفي من الفئران FVB الإناث (4-8 أسابيع من العمر) ، وشرائح إلى 50 μm سمك ، ومثقف في وسائل الاعلام تستكمل مع 2.5 ٪ من الخلية علي ادراج ثقافة الخلايا العضوية لمده 1 ، 3 ، 7 ، أو 14 يوما بعد تشريح. وفي النقاط الزمنيه المشار اليها ، كانت الشرائح ثابته وملطخه بالعلامات المطابقة مع النواة (الأزرق). (A) تلطيخ النيون المناعي للخلايا Ki67-الايجابيه (الأخضر). (B) تلطيخ النيون المناعي للخلايا الايجابيه الاميليز (الأحمر). (ج) تلطيخ النيون المناعية من اكوابورين-5 (Aqp5)-الخلايا الايجابيه (الأخضر). (D) تلطيخ النيون المناعي للخلايا الموجبة (الحمراء) الايجابيه. (ه) تلطيخ النيون المناعي للخلايا العصبية التي أشارت اليها TUBB3 (المغنطيسية) خلايا ايجابيه. (F) تلطيخ النيون المناعي للاوعيه الدموية المشار اليها بواسطة خلايا ايجابيه CD31 (احمر). تم اختيار الصور المنسقة التمثيلية من عده مكدسات z لكل نقطه زمنيه. قضبان المقياس = 30 μm; د = الخلايا الانبوبيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التغيرات الخلوية بعد تشعيع شرائح الانسجه العضوية النكفية. وقد تم تشريح الغدد نكفي من الفئران FVB الإناث (4-8 أسابيع من العمر) ، وشرائح إلى 50 μm سمك ، ومثقف في تكمله 2.5 ٪ من الخلية علي ادراج ثقافة الخلايا العضوية. في اليوم 1 بعد تشريح, تعرضت مجموعه فرعيه من الشرائح إلى 5 غراي الإشعاع والحفاظ علي 2, 4, أو 8 أيام بعد تشريح (يتوافق مع أيام 1, 3, و 7 بعد الإشعاع). تلطيخ المناعية من الأقسام نكفي غير المعالجة والمشعة لتحديد مستويات (A) Ki67 (الأخضر)-الخلايا الايجابيه ، (B) المشقوق كاسباس 3 (الأحمر)-الخلايا الايجابيه ، (ج) phمسبوكه (سماوي)-الخلايا الايجابيه ، (D) الاميليز (الأحمر)-الخلايا الايجابيه ، و (ه) الكترونيه الملتصقة (الأحمر) الخلايا الايجابيه. جميع تلطيخ النووية المستخدمة DAPI (الأزرق). تم اختيار الصور المنسقة التمثيلية من مكدس z متعددة لكل نقطه زمنيه. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التغيرات الخلوية بعد تشعيع شرائح الانسجه العضوية الفكه. وقد تم تشريح الغدد فك من الفئران FVB الإناث (4-8 أسابيع من العمر) ، وشرائح إلى 50 μm سمك ، ومثقف في وسائل الاعلام تستكمل مع 2.5 ٪ من الخلية علي ادراج ثقافة الخلايا العضوية. في اليوم 1 بعد تشريح, تم المشع مجموعه فرعيه من شرائح مع 5Gy والحفاظ علي 2, 4, أو 8 أيام بعد تشريح (يتوافق مع أيام 1, 3, و 7 بعد الإشعاع). تلطيخ المناعية من الأقسام فك غير المعالجة والمشعة لتحديد مستويات (A) Ki67 (الأخضر)-الخلايا الايجابيه ، (B) المشقوق كاسباس 3 (الأحمر)-الخلايا الايجابيه ، (ج) phمسبوكه (سماوي)-الخلايا الايجابيه ، (D) اكوابورين 5 (Aqp5) (الأخضر)-الخلايا الايجابيه ، و (ه) الكترونيه الملتصقة (الأحمر) الخلايا الايجابيه. جميع تلطيخ النووية المستخدمة DAPI (الأزرق). تم اختيار الصور المنسقة التمثيلية من مكدس z متعددة لكل نقطه زمنيه. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: علامات اكينار الوظيفية في النكفي المشعة وشرائح الانسجه الفكه العضوية. وقد تم تشريح فك والغدد نكفي من الفئران FVB الإناث (4-8 أسابيع من العمر) ، وشرائح إلى سمك 50 μm ، ومثقف في وسائل الاعلام تستكمل مع 2.5 ٪ من الخلية علي ادراج ثقافة الخلايا العضوية. في اليوم 1 بعد تشريح ، تم المشع مجموعه فرعيه من الشرائح مع 5Gy والحفاظ عليها لمده 14 يوما بعد التشعيع. واستخدمت تلطيخ المناعية من الأقسام غير المعالجة (UT) والمشع (IR) لتحديد مستويات (ا) اكوابورين-5 (Aqp5) (الأخضر)-خلايا ايجابيه و (B) الاميليز (الأحمر)-ايجابيه) الخلايا. جميع تلطيخ النووية المستخدمة DAPI (الأزرق). تم اختيار الصور المنسقة التمثيلية من مكدس z متعددة لكل نقطه زمنيه. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت أبحاث الغدد اللعابية عددا من النماذج الثقافية ، بما في ذلك الثقافات الدفينة ثنائيه الابعاد ، والثقافات الاساسيه ثنائيه الابعاد ، والثقافات ساليسفيري ثلاثية الابعاد ، وثقافات الأعضاء ثلاثية الابعاد من المفسرين الجنينيين للتاكد من الاسئله حول علم الاحياء وقد أثمرت هذه النماذج الثقافية معلومات ثاقبه عبر مجموعه متنوعة من الاسئله البحثية ستظل أدوات هامه في البحوث اللعابية. وتشمل القيود المفروضة علي هذه النماذج الثقافية تحوير نشاط p53 اثناء الخلود ، والاستمرارية العابرة للثقافات الاوليه ، وفقدان التمايز ، والبروتينات السيكريتوريه في الثقافة ، وعدم القدرة علي تقييم خلايا الخلية ، والخلية-ECM والقطبية التفاعلات في انسجه الكبار. وقد نشرت أول ثقافة الشريحة العضوية ثلاثية الابعاد (الثقافات التي تم تقسيمها بالاهتزاز) في 2008 الغدد اللعابية18؛ غير ان هذه التقنية لم تستغل بشكل كبير في هذا المجال علي الرغم من كثرة استخدامها في مجالات أخرى. العمل مثقف نكفي أقسام ل 48 h ، والذي يحد من القدرة علي دراسة هذه الأقسام للآثار المزمنة بعد العلاج الإشعاعي أو الاستفادة من بروتوكولات التحويل أو المحولة للتاثيرات الظاهرية بعد التلاعب بجينات محدده. وقد تم تحسين الطريقة الموصوفة هنا للسماح لفتره أطول في الثقافة ، والغلة صور عاليه الدقة من خلال المجهر البؤري ، وتوفير طريقه لدراسة ديناميات داخل وبين الخلايا علي قسم ثلاثي الابعاد ، وتقييم التغيرات الناجمة عن الإشعاع خلال فتره ثقافيه لا تقل عن 14 يوما.
في حين ان كل خطوه مطلوبه لتنفيذ هذه التقنية ، فان بعض الخطوات حاسمه للنجاح في الصيانة والحفاظ علي الثقافة. وتشمل هذه قطع شرائح الغدد اللعابية ، والحفاظ علي شرائح في الثقافة ، وتلطيخ وتصوير الشرائح مع المجهر البؤري. ويطرح البروتوكول المعروض بعض التحديات التي تتطلب التحلي بالصبر والممارسة من أجل الحصول علي أفضل الشرائح للتحليل. ستساعد الاقتراحات التالية في تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح. من الضروري عزل الغدة اللعابية تماما عن النسيج الضام المحيط بعد التشريح. النسيج الضام المتبقية يسبب شفره الذبذبات لسحب الغدة من كتله اجنشا ويتطلب ان تكون الانسجه أعاده تضمينها في اجنشا. يمكن ان يكون هذا قيدا كبيرا لان أعاده الدمج المتعددة يمكن ان تزيد من فرص التلوث وتقلل من قابليه الشرائح للاستمرار. وهذا أمر حاسم بشكل خاص لزراعه الغدد النكفية ، لان الغدد النكفية هي أكثر الفصيصي في هيكل التالي أكثر عرضه للانسجه دخيله.
أضافه 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين-amphotericin ب (PSA) إلى جميع السوائل بما في ذلك علبه العازلة ، وطبق مجموعه شريحة ، ووسائل الاعلام الذبذبات يقلل من تلوث الشرائح بعد تشريح. تم استخدام الاختلاف من تركيز اجنشا لتحسين القطع الناجحة. ونظرا لكثافة الغدد اللعابية ، فقد كانت نسبه 1.9% منها طريه جدا ، وتم طرد الغدد بسهوله من الكتلة. وقد استخدمت الذبذبات الاهتزاز في مجالات أخرى 5.0 ٪ agarose; ومع ذلك ، تسبب هذا التخفيضات خشنه وشرائح كانت دون الأمثل. بعد اختبار العديد من الحالات النسبة المئوية التي نشات ، وكان 3 ٪ اغبرز الأكثر الأمثل لدعم الوزن والمتانة من الانسجه. وعلي وجه الخصوص ، كان التركيز الذي تم استخدامه في وارنر وآخرون و Su et al أيضا 3%19,20.
بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تعديل زاوية ، وتواتر الاهتزاز ، وسرعه التقدم من النصل علي أساس الانسجه التي سيتم تقسيمها. لفك ونكفي الغدد اللعابية ، وزاوية 15 درجه ، وسرعه 0.075 مم/ثانيه ، وتردد 100 هرتز كانت مناسبه للتماس. نظرا لنعومه الغدد اللعابية ، تتطلب ظروف القطع المثالية النصل للتقدم ببطء من خلال الانسجه في اهتزاز عالي. لتلطيخ النيون المناعي ، والتغلغل ، ومده الاحتضان ، وخطوات الغسيل ضرورية للبقع المثلي. إذا تلطيخ ايجابيه تظهر فقط في الطبقات الخارجية من شريحة الانسجه ، قد تكون هناك حاجه إلى تخلل أكثر صرامة مع بروتيداز K ، في حين تلطيخ متفاوتة أو تلطيخ خلفيه عاليه قد تتطلب تلطيخ اقل صرامة مع 0.2 ٪ تريتون X-100. تم تحسين أوقات الحضانة للاشاره العالية والخلفية المنخفضة ، والتي قد تحتاج إلى ان تكون مصممه خصيصا للأجسام المضادة الاوليه المحددة. تعد خطوات الغسيل الطويلة ضرورية في الحد من الخلفية العالية ، وقد تكون مصممه خصيصا للأجسام المضادة المحددة المستخدمة.
أحد التطبيقات الرئيسية لهذه المنهجية هو التحليل الحركي الموسع بعد تعرض الغدد اللعابية للإشعاع. وقد إنشات الاعمال السابقة علي حد سواء التغيرات الحاده والمزمنة المرحلة في الغدد اللعابية المشعة6،24،25،26، ونظام الثقافة الذبذبات يمكن ان يكون أداه قويه لتشريح الحرجة الاحداث الجزيئية في نقاط زمنيه محدده بعد العلاج. علي سبيل المثال, التغيرات الخلوية الناجمة عن الإشعاع في الغدة اللعابية التي تم الإبلاغ عنها في الأدبيات, بما في ذلك التخفيضات في الاميليز, موت الخلايا المبرمج للخلايا اكينار, التكاثر التعويضي للخلايا اكينار, فقدان القطبية والاضطرابات في هيكل خلوي. ولا سيما ، الثقافات المشعة الاشعه السابقة المجرية تظهر تعديلات مماثله في هذه العلامات.
الاضافه إلى ذلك ، فان استجابه المرحلة الحاده في الغدد اللعابية تتمحور حول p53 النشاط. ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما هو الدور الذي يلعبه p53 في وقت لاحق بسبب بقاء ~ 5 أيام من الثقافات الاساسيه. ومن شان هذا النظام ان يسمح الجسم السابق ، والإخلال بالسيطرة علي النشاط p53 في وقت لاحق النقاط والكشف عن دور في الاضرار المزمنة أو الاستجابات التجديدية. وعلاوة علي ذلك ، يبدا التصدي للانتشار التعويضي بعد خمسه أيام من العلاج الإشعاعي ، ومن الصعب تحديد الجهات التنظيمية الجزيئية لهذه الاستجابة في الثقافات الاوليه العابرة. ومن المرجح ان يشمل التطبيق الأكثر استخداما لهذه المنهجية التفاعلات الخلوية والخلوية والقطبية في انسجه البالغين. وقد أجريت دراسات مؤثره في الثقافات الجهاز ثلاثي الابعاد من الغدد الجنينية للكشف عن التفاعل المعقد بين تطوير الغدد اللعابية والخلايا العصبية أو شبكه الاوعيه الدموية27,28,29, 30و31.
الطريقة الموصوفة هنا تشير إلى ان هناك حاجه إلى مزيد من التحسين للعمل العصبي أو الوعائي في الثقافات الفكه وربما الثقافات النكفية. الاضرار الاشعاعيه أيضا يعطل المنظمين المنعطفات ، ويحفز ترسب الكولاجين ، ويغير منظمه اف-actin ، وينظم حبيبات سيكريتوري26،30،32. يتم أعاقه دراسات تجديد الغدد اللعابية بسبب عدم وجود نموذج الكبار لتقييم هذه التفاعلات. هذه الطريقة الثقافية العضوية يمكن ان توفر نظاما لتطبيق التقنيات الجزيئية المتقدمة ومواصله دراسة تنظيم هؤلاء الوسطاء في سياق ثلاثي الابعاد واكتشاف العلاجات الجديدة بكفاءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل جزئيا التمويل التجريبي الذي قدمه مكتب جامعه اريزونا للبحوث والاكتشاف والمعاهد الوطنية للصحة (R01 DE023534) إلى كريستين ليمسو. وقدمت منحه التدريب علي البيولوجيا السرطانية ، T32CA009213 ، دعما لمكافاه ون يو وونغ. ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا السيد رايس علي مساهمته التقنية القيمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
