Summary
L'uso di colture organotipiche tridimensionali per visualizzare la morfologia e i marcatori funzionali delle ghiandole salivari può fornire nuove intuizioni sui meccanismi del danno tissutale dopo la radiazione. Qui di seguito è riportato un protocollo per sezioni, colture, irraggiamento, macchia e immagini di 50 – 90 μm di spessore di sezione della ghiandola salivare prima e dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.
Abstract
Iposalivazione e xerostomia creano complicanze orali croniche che diminuiscono la qualità della vita nei pazienti affetti da tumore della testa e del collo che sono trattati con la radioterapia. Approcci sperimentali per la comprensione dei meccanismi di disfunzione e restauro della ghiandola salivare si sono concentrati su modelli in vivo, che sono portatori di handicap dall'incapacità di schermo sistematicamente candidati terapeutici ed efficienze in trasfezione capacità di manipolare geni specifici. Lo scopo di questo protocollo di coltura organotipica della ghiandola salivare è quello di valutare il tempo massimo di vitalità della cultura e caratterizzare i cambiamenti cellulari dopo il trattamento delle radiazioni ex vivo. Abbiamo utilizzato la colorazione immunofluorescente e la microscopia confocale per determinare quando specifiche popolazioni di cellule e marcatori sono presenti durante un periodo di coltura di 30 giorni. Inoltre, i marcatori cellulari precedentemente segnalati nei modelli di radiazioni in vivo sono valutati in colture che sono irradiate ex vivo. In futuro, questo metodo è una piattaforma attraente per una rapida valutazione ex vivo delle risposte del tessuto della ghiandola salivare murina e umana agli agenti terapeutici che migliorano la funzione salivare.
Introduction
La corretta funzione della ghiandola salivare è essenziale per la salute orale e viene alterata dopo il trattamento del cancro della testa e del collo con la radioterapia1. In 2017, quasi 50.000 nuovi casi di cancro alla testa e al collo sono stati segnalati negli Stati Uniti2. A causa degli effetti dannosi del tessuto e spesso irreversibili della radioterapia sui tessuti normali circostanti come le ghiandole salivari, i pazienti sono spesso lasciati con gravi effetti collaterali e diminuita qualità della vita2,3, 4. per la Complicazioni comuni causate da danni da radiazioni si manifestano in sintomi come xerostomia (la sensazione soggettiva di secchezza della bocca), carie dentali, alterata capacità di masticare e deglutire, disturbi del linguaggio, e microbiomi orali compromessi2, 3 il , 4. questi sintomi collettivamente possono portare alla malnutrizione e la sopravvivenza alterata in individui colpiti5. Mentre la disfunzione della ghiandola salivare in questa popolazione è stata ben documentata, i meccanismi di fondo del danno alle cellule di acinare sono stati contestati, e c'è poca integrazione tra i diversi modelli animali6,7.
I metodi attuali per studiare la funzione della ghiandola salivare e i danni causati dalle radiazioni includono l'uso di modelli in vivo, linee cellulari immortalate, colture cellulari primarie bidimensionali (2-D) e colture di salisphere tridimensionali (3-D)8, 9,10,11,12. Tradizionalmente, i modelli di colture cellulari provenienti da linee cellulari immortalate e culture 2-D coinvolgono singole celle a strati coltivate su superfici piane e sono preziosi per sperimentazioni rapide, semplici e convenienti. Tuttavia, le condizioni di coltura delle cellule artificiali possono alterare lo stato di differenziazione e le risposte fisiologiche delle cellule esposte a varie condizioni, e i risultati spesso non riescono a tradursi in interi modelli di organismo14,15. Inoltre, le colture cellulari immortalate richiedono la modulazione dell'attività di p53, che è fondamentale per la risposta della ghiandola salivare ai danni del DNA16,17.
le colture di salisphere 3-D sono arricchite per le cellule staminali e progenitrici nei primi momenti della cultura e sono state utili per comprendere la radiosensibilità di questo sottoinsieme di cellule della ghiandola salivare9,18. Una limitazione critica di tutti questi modelli di coltura è che sono inefficaci nella visualizzazione della struttura 3D della ghiandola salivare, tra cui la matrice extracellulare (ECM) e le interazioni cellulare-cellula su vari strati, che sono cruciali nella modulazione salivare secrezione15. La necessità di un metodo che comprenda il comportamento del tessuto nel suo complesso, ma può anche essere manipolato in condizioni di laboratorio per studiare gli effetti del trattamento è necessario per scoprire ulteriormente i meccanismi di base della ghiandola salivare indotta da radiazioni Disfunzione.
Il sezionamento e la coltura dei tessuti vivi sono stati documentati in precedenza19,20 ed è spesso usato per studiare le interazioni cervello-tessuto21. Negli studi precedenti, il tessuto della ghiandola salivare parotide (PAR) dai topi è stato sezionato a circa 50 μm e coltivato fino a 48 h, e l'analisi della vitalità, della morte cellulare e della funzione è stata eseguita successivamente19. Su et al. (2016) ha ampliato questa metodologia coltivando ghiandole sottomandibolari umane (SMG) sezionate a 35 μm o 50 μm per 14 giorni20. Il metodo proposto è un progresso in quanto comprende sia le ghiandole salivari parotide che sottomandibolare sezionate a 50 μm e 90 μm e la valutazione delle colture per 30 giorni. La capacità di tagliare una gamma di spessore del tessuto è importante per valutare le interazioni cellula-cella e Cell-ECM che sono rilevanti per i processi cellulari, tra cui la polarità apicale-basolaterale e l'innervazione per la secrezione. Inoltre, le fette di ghiandola salivare sono state irradiate mentre in coltura per determinare la fattibilità di questo modello di coltura per studiare il danno della ghiandola salivare indotta da radiazioni.
Lo scopo di questo protocollo di coltura organotipica della ghiandola salivare è quello di valutare il tempo massimo di vitalità della cultura e caratterizzare i cambiamenti cellulari dopo il trattamento delle radiazioni ex vivo. Per determinare le sezioni temporali massime che sono vitali post-dissezione, la colorazione blu Trypan, la colorazione delle cellule vive e la colorazione immunoistochimica per la morte delle cellule sono state eseguite. La microscopia confocale e la colorazione immunofluorescente sono state utilizzate per valutare popolazioni cellulari specifiche, strutture morfologiche e livelli di proliferazione. Le colture di sezione tissutale sono state esposte anche a radiazioni ionizzanti per determinare gli effetti delle radiazioni su vari marcatori in questo modello 3-D. L'induzione della morte delle cellule, la rottura del citoscheletro, la perdita di marcatori di differenziazione e la proliferazione compensatoria nelle colture ex vivo irradiate sono state confrontate con studi precedenti di modelli in vivo. Questa metodologia fornisce un mezzo per indagare il ruolo delle interazioni delle cellule cellulari dopo il danno da radiazioni e fornisce un modello sperimentale per valutare in modo efficiente l'efficacia degli interventi terapeutici (manipolazioni genetiche o agenti farmacologici ) che possono essere meno adatte per i modelli in vivo.
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Protocol
1. preparazione del VIBRATOME
- Spruzzare componenti staccabili del VIBRATOME compreso il vassoio tampone, attacco della lama, muffa blocco di agarosio, e pellicola di laboratorio con 70% etanolo, poi UV-sterilizzare per almeno 30 min.
- Posizionare e fissare un foglio aggiuntivo di pellicola di laboratorio sul vassoio tampone per evitare che il ghiaccio cada.
- Riempire la camera di ghiaccio con ghiaccio schiacciato, rimuovere la pellicola di laboratorio dal vassoio tampone e riempire il vassoio tampone con 100 mL di soluzione salina tampone di ghiaccio-fredda 1x tamponata (PBS) integrata con 1% di penicillina-streptomicina-ampicillina (PSA).
- Inserire una lama di rasoio in acciaio inossidabile nel portalama. Utilizzare il cacciavite per stringere/allentare e cambiare l'angolazione della lama.
2. preparazione del campione di tessuto in blocco di agarosio e sezionamento utilizzando il VIBRATOME
- Autoclave tutti gli strumenti di dissezione e sezionamento necessari tra cui pinze, forbici e pennelli.
- Preparare 3% basso punto di fusione agarosio in sterile 1X PBS e forno a microonde fino a quando l'agarosio si dissolve in soluzione. Assicurarsi che la soluzione non bollire e ruotare periodicamente il flacone per miscelare.
Nota: evitare di solidificare l'agarosio a bassa fusione mantenendolo in un bagno d'acqua caldo. L'agarosio a bassa fusione è fluido a 37 ° c e si imposta a 25 ° c. Tuttavia, il bagno d'acqua dovrebbe essere inferiore a 40 ° c al fine di versare l'agarosio intorno al tessuto a temperatura fisiologica. - Isolare le ghiandole salivari e posizionare il tessuto dissezionato in 2 mL di ghiaccio-freddo 1X PBS completati con 1% PSA in un piatto di coltura sterile da 30 mm.
- Utilizzando pinze autoclavate, rimuovere le ghiandole salivari da 1X PBS + 1% PSA soluzione e posizione nella parte inferiore di uno stampo di incorporamento. Riempire lo stampo con liquido 3% basso punto di fusione agarosio per coprire il tessuto.
- Utilizzando le pinze, regolare il tessuto al centro del blocco e posizionare la ghiandola salivare nel piano appropriato. Le migliori sezioni trasversali per le ghiandole sottomandibolari e parotidi sono nel piano verticale.
- Posizionare il blocco di agarosio sul ghiaccio per 10 minuti per indurire.
- Eseguire con cautela una lama di rasoio intorno al bordo esterno dell'agarosio per allentare e lasciare che il blocco scivoli sul film di laboratorio sterilizzato UV dal passo 1,1.
- Utilizzare una lama di rasoio per ritagliare una scatola di agarosio contenente la ghiandola salivare. Assicurarsi che il piano della sezione sia dritto e parallelo al lato opposto del blocco (la superficie che verrà incollata). Dal momento che l'agarosio non infiltrarsi nel tessuto, non tagliare troppo agarosio intorno al tessuto in modo che il tessuto sarà ben supportato.
- Utilizzare la supercolla per fissare il blocco alla superficie di taglio.
- Sezione a 50 μm o 90 μm di spessore con VIBRATOME ad una velocità di 0,075 mm/s e frequenza di 100 Hz.
Nota: l'impostazione del vibratoma alla massima frequenza e alla velocità della lama più bassa fornisce le porzioni ottimali. - Raccogli le sezioni in un piatto di coltura di tessuto 24-well contenente ~ 1 mL di PBS ghiacciato per pozzo utilizzando un pennello per capelli naturale, in autoclave, posizionando il pennello nel 70% di etanolo tra le collezioni di fette per mantenere la sterilità.
3. sezioni di coltura
- Autoclave una micro-spatola e pinze.
- Creare supporti di coltura vibratoma stock con o senza siero bovino fetale (FBS): media DMEM/F12 integrato con 1% PSA, 5 μg/mL di transferrina, 1,1 μM di idrocortisone, 0,1 μM di acido retinoico, 5 μg/mL di insulina, 80 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 5 mM L-glutam50 Mina di gentamicina solfato e 10 μL/mL di miscela di oligoelementi. Aggiungere una quantità appropriata di FBS per rendere 0%, 2,5%, 5,0%, o 10% soluzioni.
- Prima del sezionamento, aggiungere 300 μL di supporto pre-riscaldato e inserire un inserto di membrana di diametro di 12 mm, 0,4 μm, in ogni pozzetto di una piastra di coltura di tessuto a 24 ben. I supporti devono raggiungere il fondo della membrana per creare un'interfaccia liquido-aria per la cultura.
- Posare delicatamente le sezioni salivari sulla parte superiore dell'inserto della membrana utilizzando la micro spatola e la coltura a 37 ° c in incubatore di atmosfera d'aria 5% CO2 e 95% umidificata.
- Aggiungere circa 300 μL di media di coltura primaria nel pozzo e qualche goccia negli inserti a membrana (circa 40 μL) a giorni alterni o secondo necessità. Una corretta coltura ha dimostrato che le cellule sono in grado di sopravvivere ed essere mantenute fino a 30 giorni ex vivo.
4. irradiazione delle sezioni della ghiandola salivare
- Trattare le sezioni con una singola dose di radiazioni (5 GY) utilizzando cobalto-60 (o equivalente) irradiatore.
- Sezioni di trasporto per l'impianto di irradiatore utilizzando un contenitore di polistirolo rivestito per evitare fluttuazioni di temperatura. Inoltre, la cura deve essere presa durante il trasporto di nuovo all'incubatore di laboratorio per garantire che i supporti non spruzzi sul coperchio della coltura e indurre la contaminazione.
- Posizionare la piastra 24-well contenente le sezioni della ghiandola salivare 80 cm dalla sorgente di radiazione, al centro di un campo di radiazione 32 "x 32". I calcoli della dose di radiazione e il tempo corrispondente in irradiatore varieranno per strumento e decadimento cobalto-60.
- Continuare il monitoraggio e la coltura di queste sezioni come descritto nella sezione 3.
5. colorazione della redditività
- Aspirate vecchi media e lavare le fette due volte con sterile, pre-riscaldato 1X PBS.
- Sezioni di macchia con colorante blu Trypan.
- Utilizzare una Microspatola per spostare la fetta dalla cultura a una diapositiva di vetro.
- Aggiungere 0,4% trypan soluzione blu alla fetta di vibratoma con abbastanza volume per coprire il tessuto (10 – 20 μL).
- Incubare le fette a temperatura ambiente (RT) nel Trypan blu per 1 – 2 min affinché il colorante penetri nel tessuto. Le cellule non vitali saranno macchiate di blu e le cellule vitali non saranno macchiate.
- Colorazione delle sezioni con calceina, colorante AM Live-Cell.
- Aggiungere abbastanza volume di macchia per coprire la sezione in un pozzo di un 24 pozzetto (200 – 300 μL).
- Incubare le fette a RT per 15 minuti per consentire la penetrazione del colorante.
- Rimuovere con cautela la sezione dal pozzo e posizionarlo su uno scivolo di vetro. Montare le fette con 1 goccia di supporto di montaggio.
- Sezioni di immagine su un microscopio fluorescente a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488 nm e 515 Nm.
6. sezioni del vibratoma di colorazione anticorpale
Nota: il seguente fornisce un protocollo di colorazione anticorpale generico specifico per Ki-67; Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato con qualsiasi anticorpo. Tutti i Lavini sono condotti a RT se non diversamente indicato.
- Nel piatto di coltura del tessuto multi-well, aspirare i media e lavare almeno 2x con sterile 1X PBS.
- Fissare le sezioni utilizzando 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte a 4 ° c.
- Aspirare il 4% di PFA e lavare 3x con PBT [1X PBS, 1% di albumina sierica bovina (BSA), 0,1% Triton X-100].
Nota: le sezioni possono essere conservate in 1X PBS a 4 ° c e macchiate in un secondo momento. Il tempo massimo di conservazione testato in questo manoscritto è stato di 3 settimane. Il tempo di conservazione più lungo dovrà essere ottimizzato dal singolo utente, se necessario. - Permeabilize sezioni utilizzando 0,3% Triton X-100 in 1X PBS per 30 min.
Nota: questo passaggio può essere modificato e ottimizzato per la colorazione e la permeabilizzazione di anticorpi specifici. - Soluzione di permeabilizzazione di Pipet off.
- Lavare le fette 3x per 5 min con 1x PBS, 1% BSA e 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Bloccare le fette con un agente bloccante con 1% di siero di capra normale per 1 h.
- Lavare le fette 3x per 5 min con PBT.
- Incubare le fette durante la notte a 4 ° c con 500 μL di anticorpo monoclonale di coniglio anti-Ki67 diluito in 1% BSA in 1X PBS.
Nota: per la colorazione di Phalloidin, saltare il passo 6,9 e procedere utilizzando il protocollo per la specifica Phalloidin utilizzata. Per la contromacchia del DNA, saltare al passo 6,15. - Aspirato anticorpo monoclonale anti-Ki67 coniglio.
- Lavare le fette 6x per 5 minuti in 1X PBS.
- Incubare le fette in 500 μL di anticorpi secondari coniugati fluorescenti compatibili con l'anticorpo anti-Ki67 diluito in 1% BSA in 1X PBS a RT per 1,5 h coperti dalla luce.
Nota: in base agli anticorpi secondari utilizzati, il tempo di incubazione con l'anticorpo secondario può essere ulteriormente ottimizzato dal singolo utente. Inoltre, l'anticorpo secondario è sensibile alla luce. Tutti i Lavini successivi devono essere eseguiti al buio. - Aspirato anticorpo secondario.
- Lavare le fette per 3x per 5 min con 1x PBS.
- Lavare le fette per 5 minuti in acqua deionizzata.
- Svasare le fette con DAPI (1μg/mL) per 20 minuti a RT.
- Lavare le fette (una volta) per 5 minuti in acqua deionizzata.
- Montare le fette con una goccia (~ 40 μL) di supporti di montaggio. Per evitare bolle in eccesso, posizionare lentamente il vetrino coprioggetti sul supporto di montaggio sulla slitta, iniziando con un angolo di 45 °.
- Per evitare di schiacciare le sezioni spesse con il coprioggetti, montare ogni fetta con un distanziale. Un distanziatore può essere creato posizionando un bordo di grasso sottovuoto in un quadrato intorno alla sezione tissutale.
- Quando si posa il vetrino coprioggetti, i bordi del vetrino coprioggetti possono essere sigillati con grasso sottovuoto. Premere verso il basso sui bordi del vetrino coprioggetti con il pollice per aderire saldamente sul vetrino. In alternativa, sigillare il vetrino coprioggetti sullo scivolo del microscopio con smalto trasparente.
7. Imaging di sezioni VIBRATOME
- Immagini i vetrini colorati entro 5 giorni dalla colorazione.
- Ottenere sezioni ottiche delle fette di VIBRATOME macchiate utilizzando un microscopio confocale. Con un microscopio confocale, ottenere un z-stack ad una dimensione di passo definito o scattare singole immagini a seconda del design sperimentale dell'utente. Le immagini possono essere esaminate su qualsiasi schermo del computer dopo la raccolta confocale.
Nota: a causa dello spessore delle fette VIBRATOME, si consiglia di utilizzare un microscopio confocale o un ambito con capacità z-stack per visualizzare i dettagli all'interno dei campioni. Per le immagini utilizzate in questo manoscritto, è stato utilizzato un obiettivo olio 63X; Tuttavia, questo può essere adattato e ulteriormente modificato dal singolo utente e l'ambito specifico utilizzato. È stata utilizzata la risoluzione dei pixel consigliata per ogni obiettivo e fattore di zoom con il campionamento Nyquist presunto di 2,5 pixel in X e Y per la più piccola struttura otticamente risolvibile. Tuttavia, alcuni commentatori suggeriscono 2,3 pixel, mentre altri suggeriscono 2,8 pixel. Si prega di fare riferimento al manuale di microscopia confocale biologica22 per ulteriori dettagli su come effettuare questi calcoli.
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Representative Results
Le colture primarie 2-D sono coltivate nei media integrati del siero bovino fetale (FBS), mentre le colture principali di salisphere 3-D sono tipicamente coltivate in condizioni esenti da siero10,11. Inoltre, i due studi precedenti che utilizzarono le colture VIBRATOME di ghiandole salivari hanno coltivato le loro sezioni in 0% o 10% FBS completati media19,20. Le fette sottomandibulari del topo sono state sezionate ad uno spessore di 50 μm utilizzando un vibratoma e le condizioni di coltura ottimali sono state determinate utilizzando una serie di concentrazioni di FBS (0%, 2,5%, 5,0% e 10%). Per determinare le caratteristiche di sopravvivenza, le immagini del microscopio a campo luminoso sono state scattate nei giorni di coltura 1, 4, 7, 14 e 30 post-sezionamento (Figura 1). Inoltre, le sezioni della ghiandola sono state macchiate con 0,4% di colorante blu Trypan e immagine con un microscopio a campo luminoso a 40x nei punti di tempo indicati (Figura 2a). Le cellule non vitali sono state macchiate di blu e le cellule vitali sono rimaste chiare.
Analogamente, per determinare le caratteristiche di sopravvivenza delle fette più spesse sezionate a 90 μm, le immagini del microscopio a campo luminoso con e senza colorazione blu Trypan sono state scattate al giorno 30 in colture integrate con 2,5% FBS (Figura 2B). A causa dello spessore della fetta, le sezioni 90 μm macchiate con colorante Trypan blu sono state immagine intere poi tagliate a metà al fine di valutare il centro della fetta (Figura 2B). Come conferma, è stato utilizzato un colorante a cellule vive per valutare la sopravvivenza delle cellule in diverse condizioni di coltura della FBS (Figura 2C). Nelle immagini a campo luminoso, sono stati osservati alti livelli di cellule traslucide e sopravvissute nei tessuti sezionati a 50 μm e 90 μm. È interessante notare che le sezioni sono diventate più scure e l'area tissutale complessiva si condensa nel tempo nella cultura, eppure una porzione significativa della sezione sembra sopravvivere al periodo di coltura di 30 giorni (Figura 1, figura 2). Questa condensazione era più evidente nelle condizioni di coltura di FBS 0% e 10%. Le cellule positive di Trypan blu sono state osservate sul perimetro di tutte le sezioni indipendentemente dalle condizioni di coltura, e c'è stato un aumento dell'area della cellula positiva blu Trypan in condizioni di coltura 0% FBS rispetto alle condizioni di coltura FBS superiori (Figura 2a , 2B).
Utilizzando la macchia cellulare dal vivo, le sezioni coltivate nello 0% hanno mostrato la quantità minima di colorazione e l'aggiunta di FBS ai media di coltura ha migliorato la quantità di cellule vive. Nel loro insieme, le sezioni coltivate nello 0% di FBS mostravano la condensazione dei tessuti visibili, le aree macchiate di trippan blu e i livelli più bassi di colorazione delle cellule vive. L'aggiunta di 2,5% FBS alle colture ha migliorato la quantità di tessuto traslucido, diminuito l'area positiva di Trypan blu e aumentato i livelli di colorazione delle cellule vive. Ulteriori aumenti della concentrazione di FBS non sembrano migliorare la capacità di sopravvivenza del tessuto; Pertanto, 2,5% FBS nel supporto vibratoma era la concentrazione ottimale di FBS e utilizzato come condizione di coltura per tutti gli esperimenti successivi.
Per determinare la vitalità delle fette di tessuto ex vivo sottomandibolare post-dissezione, marcatori proliferativi e apoptotici sono stati valutati ai giorni 1, 3, 7, 14, e 30 in coltura. L'attività proliferativa è stata valutata da Ki67 immunocolorazione in un sottoinsieme di fette di coltura (Figura 3A). KI67 cellule positive sono state osservate in tutti i punti temporali valutati e hanno continuato ad essere presenti al giorno 30 nella coltura, con minime differenze tra i punti temporali. Analogamente, il grado di apoptosi è stato valutato mediante immunocolorazione della caspasi-3 con scissione in un sottoinsieme separato di sezioni (Figura 3B). Un basso livello di cellule positive della caspasi-3 si è osservato in tutti i punti temporali fino al giorno 14 in coltura, mentre il giorno 30 le condizioni sembravano avere un piccolo aumento del numero di cellule positive della caspasi-3, in alcune aree. La valutazione dei bordi dei tessuti non ha rivelato livelli più elevati di caspasi-3 con scissione, che non ricapitolerà la colorazione blu del trypan (Figura 2). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che le indicazioni per la proliferazione e la vitalità sono rimaste presenti nelle colture VIBRATOME durante il periodo di valutazione di 30 giorni.
Le colture VIBRATOME di sezione spessa consentono di valutare le interazioni tra i costituenti cellulari di un particolare tessuto ad una profondità che include più di uno spessore delle cellule epiteliali in ogni direzione. Inoltre, è importante essere in grado di cultura entrambe le principali ghiandole salivari, in quanto differiscono nella composizione delle proteine salivari prodotte, architettura istologica, radiosensibilità, e altre caratteristiche critiche. Per determinare diverse popolazioni cellulari nelle colture della ghiandola sottomandibolare, le sezioni sottomandibolari sono state macchiate con E-cadherin (E-CAD) per rilevare le cellule epiteliali, l'actina muscolare liscia (SMA) per rilevare le cellule mioepiteliali e i filamenti di actina (Phalloidin) per rilevare strutture citoscheletriche durante i 30 giorni di coltura (Figura 4a).
La colorazione di e-cadherin è stata osservata sulle membrane della maggior parte delle cellule e rilevata durante il periodo di coltura di 30 giorni. Le cellule SMA + sono state rilevate in tutto il periodo della coltura, con livelli simili ad ogni punto temporale. Anche l'organizzazione citoscheletrica dei filamenti di actina sembrava essere mantenuta in ogni punto di tempo valutato. Al contrario, ci sono stati marcatori cellulari che non sono stati mantenuti costantemente durante l'intero periodo di valutazione e questi includevano CD31 (vasculature), TUBB3 (neuroni), e aquaporin-5 (AQP-5, marcatore acinare) (Figura 4B). Le strutture vascolari attraverso le pile confocali sono state chiaramente osservate ai giorni 1 e 3 post-coltura; Tuttavia, queste strutture apparivano frammentate al giorno 7. Allo stesso modo, i processi neuronali erano intatti durante il primo giorno di cultura, apparivano diminuiti al giorno 3, e furono successivamente persi al giorno 7 nella cultura. Aqp5 + cellule sono state osservate nei giorni 1, 3, 7, e 14 in coltura; anche se, al giorno 14, il livello di colorazione complessiva sembrava essere ridotto, con una somiglianza più granulare nelle restanti cellule positive. Questi dati suggeriscono che le colture sottomandibulari contengono la diversità dei costituenti del tessuto con il mantenimento dei tipi di cellule vascolari e neuronali per periodi di coltura più brevi, e tipi di cellule epiteliali e myoepiteliali per periodi di coltura più lunghi.
Mentre le colture VIBRATOME-sezionate sono state precedentemente segnalate per la ghiandola salivare parotide, le colture sono state mantenute per 48 h, limitando il lasso di tempo durante il quale potevano essere studiati. Al fine di determinare se le ghiandole parotide possono essere mantenute più a lungo, le ghiandole parotidi murine sono state sezionate e coltivate per 1, 3, 7 o 14 giorni. Meno sezioni sono state ottenute dalla ghiandola parotide a causa della sua dimensione più piccola nei topi; Pertanto, non è stato tentato un periodo di coltura di 30 giorni. Le fette sono state valutate per la proliferazione mediante colorazione immunofluorescente utilizzando anticorpi contro Ki67. Analogamente alle colture sottomandibolare, le cellule positive di Ki67 sono state osservate in tutti i punti temporali, indicando che le cellule mantengono un grado di proliferazione nella coltura (Figura 5a).
Inoltre, sono stati valutati il mantenimento di marcatori di acinare funzionali (α-amilasi e Aqp5), di un marcatore epiteliale (e-CAD) e di popolazioni di cellule vascolari (CD31) e neuronali (TUBB3). L'amilasi è una delle proteine più abbondanti prodotte da cellule epiteliali differenziate e spesso perse durante la coltura 2-D delle cellule parotidi primarie. Nelle colture VIBRATOME, l'amilasi è stata osservata nelle cellule acinare ed è stata esclusa dalle cellule duttali durante il periodo di coltura di 14 giorni (Figura 5b). Analogamente alle colture sottomandibolare, le cellule Aqp5 + erano presenti nelle colture parotidi in ogni momento, con il giorno 14 colture che presentavano livelli ridotti rispetto ai punti temporali precedenti (Figura 5C). I livelli di E-cadherina sono stati mantenuti anche sulle membrane della maggior parte delle cellule durante il periodo di coltura di 14 giorni (Figura 5d). Le strutture neuronali sembravano essere mantenute durante il periodo di coltura di 7 giorni e non sono state valutate in punti temporali successivi (Figura 5e). Al contrario, le strutture vascolari apparivano intatte durante il primo giorno nella cultura, e solo le strutture più piccole erano presenti ai giorni 3 e 7 nella cultura (Figura 5F). Questi dati suggeriscono che le colture parotidi mantengono le loro capacità proliferativa e la maggior parte delle capacità funzionali per 7-14 giorni nella cultura e potenzialmente presentano una struttura tissutale più intatta per un lasso di tempo più lungo.
L'utilità funzionale del modello di coltura vibratoma è stata affrontata trattando le colture parotidi o sottomandibolari con una singola dose di radiazioni (Figura 6, Figura 7, Figura 8). Il lavoro precedente nei modelli murini irradiati si è concentrato sulla ghiandola parotide e ha dimostrato l'induzione dell'apoptosi che picchi a 24 ore, induzione della proliferazione compensatoria a partire dal giorno 5, interruzione dei filamenti di actina a partire dal giorno 5, e perdita di marcatori di differenziazione (ad esempio, amilasi) per giorno 1423,24,26. L'irradiazione delle colture di vibratomi parotidi ha portato ad aumenti di apoptosi al giorno 1, aumenti della proliferazione al giorno 7, interruzione dei filamenti di actina al giorno 7 e riduzioni dell'amilasi al giorno 7 (Figura 6). L'irradiazione delle colture VIBRATOME submandibolari ha portato ad aumenti di apoptosi ai giorni 1 e 3, aumenti della proliferazione al giorno 7 e interruzione dei filamenti di actina al giorno 7 (Figura 7). I livelli di e-cadherina sono apparsi relativamente intatti in entrambe le colture parotidi e sottomandibolari, che erano simili alle osservazioni in vivo26. I marcatori funzionali di cellule acinare AQP-5 nelle sezioni della ghiandola sottomandibolare e nell'amilasi nelle sezioni della ghiandola parotide sono diminuiti al giorno 14, rispetto ai corrispondenti punti temporali non trattati (Figura 8). Questi dati suggeriscono che i cambiamenti tissutali indotti dalle radiazioni osservati in vivo sono stati osservati anche nelle colture VIBRATOME irradiate.
Figura 1: Immagini di microscopio a campo luminoso di 50 μm sottomandibolare sezioni. Le ghiandole sottomandibolari di topi femmina FVB (4-8 settimane di età) sono state sezionate, sezionato a 50 μm di spessore, e coltivate su inserti di coltura cellulare organotipica per 1, 4, 7, 14 e 30 giorni dopo la dissezione a 0%, 2,5%, 5,0%, e 10% siero bovino fetale (FBS) nei media per determinare le caratteristiche culturali e ottimizzare le condizioni di coltura. Barre di scala = 200 μm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: colorazione della vitalità sottomandibolare sezioni. A) immagini microscopiche a campo luminoso di 50 μm sotto mandibolare sezionate da 4 a 8 settimane di topi FBV femmina e colorate con Trypan blue (0,4%) a 1, 3, 7, 14 e 30 giorni in coltura con media contenenti 2,5% di siero bovino fetale (FBS). B) immagini del microscopio a campo luminoso di 90 μm sezioni sottomandibular (pannello sinistro), macchiate con Trypan blu (pannello centrale), tagliate a metà e macchiate con Trypan blu (pannello a destra), poi coltivate a 30 giorni dopo la dissezione nei media contenenti 2,5% FBS. C) immagini fluorescenti di 50 μm di sezioni sottomandibulari coltivate in varie concentrazioni di FBS (0%, 2,5%, 5%, 10%) macchiato con calceina AM per indicare le cellule vive (verde) al giorno della cultura 7. Barre di scala = 200 μm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: Valutazione di marcatori proliferativi e apoptotici in sottomandibolare fettine di tessuto organotipico. Le ghiandole sottomandibulari di topi femmina FVB (4-8 settimane di età) sono state sezionate, tagliate a 50 μm di spessore, e coltivate nei media completati con 2,5% FBS su inserti di coltura cellulare organotipica per 1, 3, 7, 14 e 30 giorni dopo la dissezione. Ai punti temporali indicati, le fette sono state fissate e macchiate per i marcatori proliferativi (Ki67) e apoptotici (cleaved caspase-3). A) colorazione immunofluorescente delle cellule Ki67 positive (verde) e del nucleo (blu). B) colorazione immunofluorescente delle cellule della caspasi-3-postive sfalsate (rosse) e del nucleo (blu) da due punti di vista di una fetta. Il pannello superiore della riga visualizza le celle di caspasi-3-positive sfalsate sul bordo di una fetta e il pannello della riga inferiore mostra le celle della caspasi-3-positive sfalsate dal centro di una fetta. Le immagini confocali rappresentative sono state selezionate da più pile z per punto temporale. Barre di scala = 30 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Presenza di strutture cellulari in sottomandibolare fettine di tessuto organotipico . Le ghiandole sottomandibolari di topi femmina FVB (4-8 settimane di età) sono state sezionate, tagliate a 50 μm di spessore, e coltivate in media integrate con 2,5% FBS su inserti di coltura cellulare organotipica per 1, 3, 7, 14 o 30 giorni dopo la dissezione. Ai punti temporali indicati, le fette venivano fissate e macchiate per i corrispondenti marcatori con il nucleo (blu). A) le sezioni sottomandibolari sono state valutate ai giorni 1, 7, 14 e 30 post-dissezione per i livelli di E-cadherina, actina muscolare liscia (SMA) e F-actina (Phalloidin). (B) le sezioni sottomandibolari sono state valutate ai giorni 1, 3 e 7 per i livelli di CD31 (vasculature) e TUBB3 (neuroni). Aquaporin-5 (Aqp5) è stato valutato ai giorni 1, 3, 7 e 14. Le immagini confocali rappresentative sono state selezionate da più pile z per punto temporale. Barre di scala = 30 μm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: Valutazione di marcatori proliferativi e funzionali nelle fette di tessuto organotipico par. Le ghiandole parotidi da topi femminili FVB (4-8 settimane di età) sono state sezionate, tagliate a 50 μm di spessore e coltivate nei media completati con 2,5% FBS su inserti di coltura cellulare organotipica per 1, 3, 7 o 14 giorni dopo la dissezione. Ai punti temporali indicati, le fette venivano fissate e macchiate per i corrispondenti marcatori con il nucleo (blu). A) colorazione immunofluorescente delle cellule Ki67 positive (verde). B) colorazione immunofluorescente delle cellule amilasi-positive (rosso). C) colorazione immunofluorescente delle cellule positive di aquaporin-5 (Aqp5) (verde). (D) colorazione immunofluorescente delle cellule positive di E-cadherina (rosse). (E) colorazione immunofluorescente dei neuroni indicato dalle cellule positive di TUBB3 (Magneta). (F) colorazione immunofluorescente della vascolarizzazione indicata da cellule positive CD31 (rosse). Le immagini confocali rappresentative sono state selezionate da più pile z per punto temporale. Barre di scala = 30 μm; d = cellule duttali. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6: cambiamenti cellulari a seguito di irradiazione di fette di tessuto organotipico parotide. Le ghiandole parotidi da topi femmina FVB (4-8 settimane di età) sono state sezionate, tagliate a 50 μm di spessore, e coltivate in integrato con 2,5% FBS su inserti di coltura cellulare organotipica. Il giorno 1 post-dissezione, un sottoinsieme di fette è stato esposto a 5 radiazioni GY e mantenuto per 2, 4, o 8 giorni post-dissezione (corrisponde ai giorni 1, 3, e 7 post-radiazione). Colorazione immunofluorescente di sezioni parotidi non trattate e irradiate per determinare i livelli di (a) Ki67 (verde)-cellule positive, (B) la caspasi sfalsata 3 (rosso)-cellule positive, (C) Phalloidin (ciano)-cellule positive, (D) cellule positive di amilasi (rosse) e (e ) e-cadherin (rosse) cellule positive. Tutte le macchie nucleari utilizzate DAPI (blu). Le immagini confocali rappresentative sono state selezionate da più z-stack per punto temporale. Barre di scala = 30 μm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 7: cambiamenti cellulari a seguito di irradiazione di fette di tessuto organotipico sottomandibolare. Le ghiandole sottomandibulari di topi femmina FVB (4-8 settimane di età) sono state sezionate, tagliate a 50 μm di spessore, e coltivate in media integrate con 2,5% FBS su inserti di coltura cellulare organotipica. Il giorno 1 post-dissezione, un sottoinsieme di fette è stato irradiato con 5Gy e mantenuto per 2, 4, o 8 giorni post-dissezione (corrisponde ai giorni 1, 3, e 7 post-radiazione). Colorazione immunofluorescente di sezioni sottomandibolari non trattate e irradiate per determinare i livelli di (a) Ki67 (verde)-cellule positive, (B) la caspasi sfalsata 3 (rosso)-cellule positive, (C) Phalloidin (ciano)-cellule positive, (D) aquaporin 5 (Aqp5) (verde)-cellule positive, e (e) e-cadherin (rosso) cellule positive. Tutte le macchie nucleari utilizzate DAPI (blu). Le immagini confocali rappresentative sono state selezionate da più z-stack per punto temporale. Barre di scala = 30 μm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 8: marcatori di acinare funzionali nelle fette di tessuto organotipico parotide e sottomandibolare irradiati. Le ghiandole sottomandibulari e parotidi di topi femmina FVB (4-8 settimane di età) sono state sezionate, tagliate a 50 μm di spessore, e coltivate in media integrate con 2,5% FBS su inserti di coltura cellulare organotipica. Il giorno 1 post-dissezione, un sottoinsieme di fette è stato irradiato con 5Gy e mantenuto per 14 giorni dopo l'irradiazione. La colorazione immunofluorescente delle sezioni non trattate (UT) e irradiate (IR) è stata utilizzata per determinare i livelli di cellule (a) aquaporin-5 (Aqp5) (verdi)-positive e (B) amilasi (rosso)-positive). Tutte le macchie nucleari utilizzate DAPI (blu). Le immagini confocali rappresentative sono state selezionate da più z-stack per punto temporale. Barre di scala = 30 μm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
La ricerca sulla ghiandola salivare ha utilizzato una serie di modelli di cultura, tra cui culture 2-D immortalate, colture primarie 2-D, culture salisphere 3-D e colture di organi 3-D da espianti embrionali per accertare le domande sulla biologia e la fisiologia sottostanti. Questi modelli di cultura hanno prodotto informazioni approfondite su una vasta gamma di domande di ricerca e continueranno ad essere strumenti importanti nella ricerca salivare. I limiti di questi modelli di coltura includono la modulazione dell'attività di p53 durante l'immortalizzazione, la vitalità transitoria delle colture primarie, la perdita di differenziazione e le proteine secretorie nella cultura e l'incapacità di valutare le cellule cellulari, la cellula-ECM e la polarità interazioni farmacologiche nei tessuti adulti. Il primo metodo di coltura di Slice organotipica 3-D (culture di sezionamento vibratoma) per le ghiandole salivari è stato pubblicato nel 200818; Tuttavia, questa tecnica è stata largamente sottoutilizzata in questo campo nonostante l'uso frequente in altri campi. Il lavoro ha coltivato sezioni parotidi per 48 h, che limita la capacità di studiare queste sezioni per gli effetti cronici dopo il trattamento radiante o utilizzare protocolli di trasfezione o trasduzione per i fenotipi dopo la manipolazione di geni specifici. Il metodo descritto qui è stato ottimizzato per consentire più tempo nella cultura, produrre immagini ad alta risoluzione attraverso la microscopia confocale, fornire un metodo per studiare la dinamica intra-e intercellulare su una sezione 3D, e valutare i cambiamenti indotti dalle radiazioni durante un periodo di coltura di almeno 14 giorni.
Mentre ogni passo è necessario per l'implementazione della tecnica, alcuni passaggi sono cruciali per il successo di sezionamento e la manutenzione della cultura. Questi includono il taglio delle fette di ghiandola salivare, mantenendo le fette in coltura, e la colorazione e l'imaging delle fette con microscopia confocale. Il protocollo presentato pone alcune sfide che richiedono pazienza e pratica al fine di ottenere fette ottimali per l'analisi. I seguenti suggerimenti aiuteranno a realizzare questo protocollo con successo. È imperativo isolare completamente la ghiandola salivare dal tessuto connettivo circostante dopo la dissezione. Il tessuto connettivo residuo fa sì che la lama vibratoma trascini la ghiandola dal blocco di agarosio e richieda che il tessuto venga ri-incorporato in agarosio. Questo può essere una limitazione importante poiché più re-incorporamento può aumentare le probabilità di contaminazione e diminuire la vitalità delle fette. Questo è particolarmente cruciale per la coltura di ghiandole parotidi, poiché le ghiandole parotide sono più lobulari nella struttura e quindi più probabile avere tessuto estraneo.
L'aggiunta di 1% di penicillina-streptomicina-amfotericina B (PSA) a tutti i liquidi compreso il vassoio tampone, il piatto di raccolta Slice e il supporto vibratoma minimizzano la contaminazione delle fette dopo la dissezione. La variazione della concentrazione di agarosio è stata utilizzata per ottimizzare il taglio di successo. A causa della densità delle ghiandole salivari, 1,9% agarosio era troppo morbido, e le ghiandole sono state facilmente disalloggiate dal blocco. Il sezionamento vibratoma in altri campi ha utilizzato 5,0% di agarosio; Tuttavia, questo ha causato tagli frastagliati e fette erano subottimali. Dopo aver testato diverse condizioni percentuali di agarosio, 3% agarosio è stato il più ottimale per sostenere il peso e la compattezza del tessuto. In particolare, la concentrazione di agarosio utilizzata nella Warner et al. e su et al. era anche del 3%19,20.
Inoltre, l'angolo, la frequenza delle vibrazioni e la velocità di avanzamento della lama possono essere modificate in base al tessuto da sezionare. Per le ghiandole salivari sottomandibulari e parotidi, un angolo di 15 °, una velocità di 0,075 mm/s e una frequenza di 100 Hz erano appropriati per il sezionamento. A causa della morbidezza delle ghiandole salivari, le condizioni di taglio ottimali hanno richiesto la lama di avanzare lentamente attraverso il tessuto ad alta vibrazione. Per la colorazione immunofluorescente, la permeabilizzazione, la durata delle incubazioni e le fasi di lavaggio sono essenziali per le macchie ottimali. Se la colorazione positiva appare solo negli strati esterni della fetta di tessuto, può essere necessaria una permeabilizzazione più rigorosa con la proteinasi K, mentre la colorazione irregolare o la colorazione di fondo elevata possono richiedere una colorazione meno rigorosa con 0,2% Triton X-100. I tempi di incubazione sono stati ottimizzati per segnale elevato e basso background, che potrebbe essere necessario adattare a specifici anticorpi primari. Le fasi di lavaggio più lunghe sono essenziali per ridurre lo sfondo elevato e questo può essere adattato agli anticorpi specifici utilizzati.
Una grande applicazione di questa metodologia è l'analisi cinetica estesa dopo l'esposizione alle radiazioni delle ghiandole salivari. Il precedente lavoro ha stabilito cambiamenti di fase sia acuti che cronici nelle ghiandole salivari irradiate6,24,25,26, e il sistema di coltura vibratoma può essere un potente strumento per dissezionare il critico eventi molecolari in momenti specifici dopo il trattamento. Ad esempio, cambiamenti cellulari indotta da radiazioni nella ghiandola salivare che sono stati segnalati in letteratura, comprese le riduzioni in amilasi, apoptosi delle cellule acinare, proliferazione compensatoria delle cellule acinare, perdita di polarità e interruzioni in struttura citoscheletrica. In particolare, le colture VIBRATOME irradiate ex vivo presentano alterazioni simili in questi marcatori.
Inoltre, la risposta di fase acuta nelle ghiandole salivari ruota attorno all'attività di p53; Tuttavia, non è chiaro quale ruolo p53 Gioca nei punti di tempo successivi a causa della vitalità di ~ 5 giorni delle culture primarie. Questo sistema consentirebbe un'interruzione controllata ex vivo dell'attività di p53 in momenti successivi e scoprirà un ruolo nei danni cronici o nelle risposte rigenerative. Inoltre, la risposta compensatoria di proliferazione è iniziata 5 giorni dopo il trattamento delle radiazioni ed è difficile delineare i regolatori molecolari di questa risposta nelle colture primarie transitorie. L'applicazione più ampiamente utilizzata di questa metodologia probabilmente coinvolgerà le cellule cellulari, le cellule ECM e le interazioni di polarità nei tessuti adulti. Studi di impatto sono stati condotti in colture di organi 3-D da ghiandole embrionali per scoprire l'intricata interazione tra lo sviluppo di ghiandole salivari e la rete neuronale o vascolare27,28,29, 30,31.
Il metodo descritto qui indica che è necessaria un'ulteriore ottimizzazione per il lavoro neuronale o vascolare nelle colture sottomandibulari e possibilmente in colture parotidi. Il danno da radiazioni interrompe anche i regolatori di giunzione, induce la deposizione di collagene, altera l'organizzazione F-actina e modula i granuli secretori26,30,32. Gli studi di rigenerazione della ghiandola salivare sono handicappati dall'assenza di un modello adulto per valutare queste interazioni. Questo metodo di coltura organotipica può fornire un sistema per applicare tecniche molecolari avanzate e studiare ulteriormente la regolazione di questi mediatori in un contesto 3D e scoprire in modo efficiente nuove terapie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento pilota fornito dall'ufficio di ricerca e scoperta dell'Università dell'Arizona e dagli istituti nazionali di sanità (R01 DE023534) a Kirsten Limesand. La borsa di formazione per la biologia del cancro, T32CA009213, ha fornito supporto allo stipendio per Wen Yu Wong. Gli autori vorrebbero ringraziare M. Rice per il suo prezioso contributo tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
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