Immunology and Infection

细胞培养和果蝇黑色素的氧化锌纳米颗粒的毒性研究

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510

Cheng Teng Ng¹, Choon Nam Ong², Liya E. Yu³, Boon Huat Bay⁴, Gyeong Hun Baeg⁴

¹NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, ²NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, ³Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, ⁴Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

我们描述了一个详细的方案，用于评估氧化锌纳米粒子（ZnO NPs）的毒理学特征，特别是人类MRC5肺成纤维细胞中的细胞死亡类型和果蝇果蝇果蝇的ROS形成。

Abstract

氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的应用范围很广，但近年来有关 ZnO NP 相关毒性的报告数量迅速增加。然而，阐明ZnO NP诱导毒性的基本机制的研究很少。我们使用体外实验模型和体内实验模型确定了ZnO NPs的毒性曲线。在ZnO NP暴露的MRC5肺成纤维细胞中观察到细胞活力显著下降，表明ZnO Npps具有细胞毒性作用。同样，有趣的是，暴露于ZnO NPs的肠道在果蝇果蝇果蝇中表现出活性氧物种水平（ROS）的显著增加。需要进行更深入的研究，以便对消费者增加使用 ZnO NPs 进行风险评估。

Introduction

纳米技术是指纳米材料的应用，用于所有科学领域，包括医学、材料科学和生物化学。例如，以紫外线散射、化学传感、抗微生物特性以及高导电性著称的ZnO NPs被用于各种消费品的生产，如食品包装、化妆品、纺织品、橡胶、电池、汽车尾气处理催化剂以及生物医学相关^{应用1、2、3。}

然而，基于ZnO NP的产品的迅速应用，导致人类接触ZnO NP的机会增加，这引起了人们对其对人类健康的潜在不利影响的关注。一些体外细胞研究表明，ZnO NPs可以诱导氧化应激、自噬相关细胞毒性、炎症和基因毒性4，5，6，7，8.值得注意的是，ZnO NPs的毒性被假定为由Zn溶解以释放Zn²⁺离子引起的，以及ZnO的表面反应性，导致细胞离子和代谢失衡，这些失衡与受损的离子平衡和抑制的子运输4，7，9，10。重要的是，研究表明，活性氧物种（ROS）的产生是ZnO NPs相关毒性的主要机制之一。ROS侮辱后抗氧化活性不足已被证明是导致细胞毒性和DNA损伤^{的原因9。}在动物模型中也报告了ZnO NPs的毒性作用，包括啮^{齿动物1，}斑马^{鱼11，12，}以及无脊椎动物果^蝇13。

果蝇是化学实体和纳米材料（NMs）14、15毒性筛选的成熟替代动物模型。重要的是，人类和果蝇之间有着高度的遗传和生理相似性，这证明使用果蝇作为体内模型来评估对环境污染物（如NMs）的生物反应。^16.此外，由于果蝇体积小、寿命短、遗传性、易于操作、易于和具有成本效益的维护，使用果蝇有许多优点。此外，自2000年全基因组完全测序以来，果蝇被广泛用于遗传学、分子和发育生物学的研究，因此适合各种高通量筛选以及解决未解决的生物问题17，18，19，20，21。近年来，在果蝇中，有15、22、23、24号研究与使用不同类型核对素的免疫毒性有关。从使用果蝇的研究中获得的这些基本的新知识有助于深入了解我们对纳米毒理学的理解。

ROS是NPs引起的细胞毒性和基因毒性的众所周知的罪魁祸首，特别是基于金属^的NPs25。ROS是含氧化学物种，具有比分子氧更高的活性。自由基，如超氧化物基（O2^-），甚至非基分子，如过氧化氢（H2 O_2）可以充当ROS。在正常生理条件下，它们需要维持细胞^平衡26，然而，过量的ROS由于过量生产或抗氧化防御系统调节可能导致氧化应激，导致蛋白质损伤，脂质和脱氧核糖核^{酸（DNA）27。}例如，随着ROS水平增加和谷胱甘肽（GSH）水平同时下降，三磷酸腺苷（ATP）合成发生中断，乳酸脱氢酶（LDH）水平增加，最终导致细胞^死亡27。

在这里，我们提供使用培养的哺乳动物细胞和果蝇细胞进行细胞和遗传分析的协议，以确定ZnO NPs的潜在不利影响。图1概述了用于ZnO NPs毒性研究的方法。

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Protocol

1. 荧光活细胞分类（FACS）活细胞/固定细胞分析

声波 ZnO NP 在悬浮 15 分钟。
使用1mg/mL ZnO NP库存溶液制备不同浓度的ZnO NP（例如0、10、25、50、100和200微克/mL），用于处理培养细胞。
种子MRC5人类肺成纤维细胞（1 x 10⁵细胞/孔）提前一天进入6孔培养板，然后用2 mL的ZnO NPs（三胞胎）处理细胞8小时、16小时和24小时。
在每个时间点，通过300 x g离心收集细胞5分钟。
用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞颗粒两次。
用1x结合缓冲液重新悬浮细胞，该缓冲液由0.1M HEPES/氢氧化钠（NaOH）、1.4M氯化钠（NaCl）和25 mM氯化钙（CaCl_2）组成，浓度为每100μL1 x 10⁵细胞。
加入5μL的氟利辛等子素（FITC）附件五染色和5μL碘化钠（PI）DNA染色，并在室温（RT;25°C）下孵育细胞15分钟。
在按流式细胞测定对细胞进行排序之前，用额外的 400 μL 1x 结合缓冲液补充样品。每个样本至少分析 10，000 个细胞。
使用获得的中值强度对条形图进行表格。

2. 锌O NPs接触果蝇

将1毫升不同浓度的纳米颗粒加入小瓶中，然后加入9毫升的飞食，最终浓度为0.1毫克/mL、0.25mg/mL或0.5mg/mL ZnO NPs。
使用移液器将纳米颗粒与食物彻底混合在小瓶中。
在使用前，让含有 ZnO NPs 的苍蝇食物冷却至少 2-3 小时。
将成年雄性苍蝇和雌性苍蝇引入小瓶5天，并允许它们交配并产卵（显示为白斑）在食物表面。
去除亲蝇，让卵子得到进一步发育，包括4个不同的发育阶段（胚胎、幼虫、幼虫和成人阶段）。

3. 飞行解剖

从小瓶的墙壁上收集晚3^号星幼虫进行分析。新鲜产卵通常发育到晚3^在星幼虫后72-120小时在RT。
清洁解剖盘，用解剖介质/PBS 填充井。
在立体显微镜下用一对钳子解剖幼虫（晚3^星）。
使用钳尖打一个小孔，并打破幼虫的角质层。小心地拔出肠道，并将其放入含有施耐德果蝇基剂的1.5 mL微离心管中，然后用1 mL的4%甲醛（PF）固定步骤。
3.5 在RT将肠道在PF中修复10分钟，用于后续实验，如免疫染色。

4. 使用二氢二甲苯（DHE）染色进行 ROS 检测

如步骤 2.1 所述，用不同浓度的 ZnO NPs 处理幼虫。
按照第3节所述，从第3^号星幼虫解剖肠道后，在进行组织染色之前，在RT处用施耐德的果蝇培养基孵育肠道。将1μL的DHE染料（从30 mM的库存浓度中溶解）在施耐德介质的1 mL中，使最终工作浓度为10-30 μM DHE染料。
在黑暗中在RT孵育肠道5分钟，然后每5分钟使用施耐德的介质清洗3次。
用 4% PF（可选步骤）固定肠道，并将肠道安装到玻璃滑片上，使用含有 4°，6-diamidino-2-phenylindole （DAPI）的防褪色安装介质。在共聚焦显微镜下捕捉图像。

5. 使用 ImageJ 软件测量荧光

将使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜采集的捕获的荧光图像导入 ImageJ 软件。
单击"分析"菜单并选择"设置测量值"。
选择输出度量值，如面积集成强度和平均灰色值。
单击"测量"。
选择没有荧光的区域来设置背景。
将数据导出到 Excel 电子表格中，并使用如下所示的计算确定已校正的总细胞荧光（CTCF）。
CTCF = 集成密度 - （选定细胞 X 平均荧光的背景读数区域）
构造条形图并执行统计分析。

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Representative Results

NP暴露的细胞使用细胞染色试剂试剂盒进行处理，然后使用流式细胞测定法对细胞进行分类。ZnO NP处理的细胞（底部，右侧面板）表现出比对照细胞（R5，底部，左侧面板）更高的早期（R3）/晚期凋亡细胞（R6）的百分比。坏死细胞死亡用R4（顶部，右侧面板）表示（图2）。图2显示了FITC/附件五对ZnO NP处理的MRC-5成纤维细胞的测定结果。

在果蝇实验中，在10mL管中加入不同浓度的声波ZnO NPs，然后用移液器控制器混合好食物（图3）。从小瓶中采集的晚期第三只恒星幼虫在立体显微镜下被解剖。幼虫首先被清洗，以去除剩余食物的残留物（图4）。外角层被撕开，露出内脏器官。肠道由特征长和半透明的外观识别（而其他器官在显微镜下显得不透明和浅黄色）（图5）。肠道被小心取出，没有破裂，并转移到一个新的微离心管，含有固定在冰上（图6）。

对于荧光强度的定量（如肠道中的 DHE 探针的强度），图像以 JPEG 或 TIFF 格式导出，并采用 ImageJ 软件打开。选择并确定了用于分析的肠道部分，例如，中肠道或后胃区域，并测量了感兴趣区域（ROI）的荧光强度。为了比较不同实验组的相对强度，我们采用了上一节中描述的相同定量共聚焦显微镜方法。为了比较荧光强度，使用负未经处理的控制设置参数。基于未经处理控制的校准强度计算信号强度，可以直接比较不同的实验组。图 7显示了暴露于不同浓度的 ZnO NPs 的第 3^个星幼虫肠道中的 DHE 信号的平均强度。用0.5mg/mL的ZnO NP处理处理的幼虫肠道表现出最高的荧光强度。

进一步列出所有实验组的相对强度差异，并进行了统计分析，提供了定性和定量结果（图8）。

图1：用于锌O NPs毒性研究的方法概述。对于体外工作，ZnO NP 处理的细胞在流动细胞学分析之前被染色。在体内工作，肠道从^第三星幼虫解剖，其次是染色与DHE染料和图像采集。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：根据FITC和PE染色，将细胞分到不同种群的点图。象形图显示了FITC/附件五测定的结果，在MRC-5上24小时处理ZnO-NPs。然后可以对不同阶段的细胞进行统计分析。请点击此处查看此图的较大版本。

图3：制备含ZnO NP的飞食介质。（A）飞食的成分加入水中，允许膨胀，煮5分钟（B）冷却至50°C搅拌后，加入尼帕金并彻底混合。（C）为纳米粒子准备主混合物（总体积不超过最终食物体积的10%）。（D）介质然后被联种，与不同浓度的ZnO NPs混合，并允许在储存前完全冷却。请点击此处查看此图的较大版本。

图4：整个肠道解剖过程。（A）将第^三星幼虫转移到解剖盘。（B）用钳子轻轻抱住幼虫，并用盐水洗去食物的残余物.（D）轻轻撕开角质层，不要接触肠道和其他内脏器官。（E）将肠道放入盐水中，以便后续程序。请点击此处查看此图的较大版本。

图5：消化道/肠道的解剖结构。从果蝇幼虫中提取的肠道分为三个不同发育起源的离散域，即前肠、中肠和后肠。请点击此处查看此图的较大版本。

图6：用DHE染色肠道组织。（A）准备含有生长介质和 DHE（最终浓度为 30 μM）的主混合物。（B）将主混合物加入解剖盘的井中。（C）将解剖的肠道组织转移到含有DHE主混合物的井中。（D）在RT孵育5分钟，保护组织免受光;在PBS/盐水中洗3次5分钟（E）在4%PF中修复10分钟;用PBS清洗组织三次（可选）。（F）轻轻地将肠道转移到玻璃幻灯片上，平放，不折叠任何组织，在盖玻璃盖面之前，用安装介质安装。请点击此处查看此图的较大版本。

图7：ZnO NPs在果蝇幼虫肠道诱导ROS。（a）控制肠道中的 DHE 染色显示 ROS 的基础水平.（b和c）经过处理的肠道细胞以剂量依赖性的方式显示DHE强度逐渐增加。请点击此处查看此图的较大版本。

图8：使用ImageJ对荧光图像进行定量。（A）导入捕获的图像。（B）单击"分析"菜单并选择"设置测量值"。（C）选择区域综合强度和平均灰色值。选择没有荧光的区域来设置背景。（D）将数据导出到 Excel 并计算 CTCF 以进行后续统计分析。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

为了评估ZnO NP是否可诱导MRC5成纤维细胞凋亡，我们使用流式细胞测定法来区分细胞与坏死或凋亡细胞死亡。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞膜处局部化。如果发生凋亡，PS被转移至血浆膜的细胞外传单，允许用荧光素标记的附件五（FITC附件^五）29。另一方面，红荧光丙二蛋白（PI），一种核酸结合染料，对活细胞和凋亡细胞是无害的，但污渍死^细胞30。这使我们能够识别死细胞（红色和绿色），凋亡细胞（绿色荧光）和活细胞（很少或没有荧光），使用流式细胞仪与488nm线的Argon-ion激光激发。

对于果蝇肠道的DHE染色，在开始实验之前用DMSO重新建立染料非常重要，因为长时间的储存可能导致染料的自动氧化，使染料变成深色/^紫色31。^此外，重组后的股票解决方案也往往很快到期，因此必须关注"到期日"。或者，可以使用荧光稳定探头（如光稳定探头的绿色版本），这种探头具有与污渍进行多路复用的附加能力，并产生比DHE更清晰的信号。解剖的肠道被转移到施耐德的培养基，含有所需的浓度的染料，没有添加固定性。这是允许将染料结合在活细胞中，从而在培养基体中进行染色，以便更好地呼吸细胞。

关于DHE染色的定量，首先，避免控制未经处理的细胞中的像素饱和。成像软件程序用于通过视觉标记饱和像素来确定曝光时间。未经处理的样品用于设置曝光时间并维护相同的参数，用于捕获图像以比较不同治疗组的强度，这对以后荧光图像强度的量化非常重要。使用相同的系统和采集设置/参数获取所有图像（控制和处理样本）至关重要，并且所有图像的背景都应标准化（以便背景减法具有一致性）³³。

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Disclosures

提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项研究得到了补助金编号R706-000-043-490的支持。这项研究并不代表赠款发起人的观点。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate	Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Bacto Agar	BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb			a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer	Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software	DAKO		https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine)	Thermo Fisher Scientific	D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD biosciences	556547
Fluorescent microscope	Olympus
Glucolin	Supermarket
ImageJ software	NIH
MRC5 human lung fibroblast	ATCC	CCL-171
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fisher Scientific	21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO	NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles	Sigma Aldrich	721077	Refer Sheet 2