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Immunology and Infection

Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

Nós descrevemos um protocolo detalhado para avaliar os perfis toxicológicos de nanopartículas do óxido de zinco (ZnO NPs) no detalhe, o tipo de morte da pilha em fibroblastos humanos do pulmão MRC5 e na formação dos ROS na mosca da fruta Drosophila.

Abstract

As nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs) têm uma ampla gama de aplicações, mas o número de relatos sobre a toxicidade associada ao ZnO NP cresceu rapidamente nos últimos anos. No entanto, estudos que elucidar os mecanismos subjacentes para a toxicidade induzida por ZnO NP são escassos. Nós determinamos os perfis da toxicidade de ZnO NPs usando modelos in vitro e in vivo experimentais. Uma diminuição significativa na viabilidade celular foi observada em fibroblastos pulmonares MRC5 expostos ao ZnO NP, mostrando que os NPs ZnO exercem efeitos citotóxicos. Da mesma forma, curiosamente, o intestino exposto a ZnO NPs exibiu um aumento dramático nos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mosca da fruta Drosophila. São necessários estudos mais aprofundados para estabelecer uma avaliação de risco para o aumento da utilização de ZnO NPs pelos consumidores.

Introduction

A nanotecnologia refere-se à aplicação de materiais nanodimensionados que são utilizados em todos os campos científicos, incluindo medicina, ciência dos materiais e bioquímica. Por exemplo, ZnO NPs que são conhecidos por sua dispersão ultravioleta, sensoriamento químico, e propriedades antimicrobianas, bem como alta condutividade elétrica, são utilizados na produção de vários produtos de consumo, tais como embalagens de alimentos, cosméticos, têxteis, borrachas, baterias, catalisador para o tratamento de gás de cauda de automóvel, e aplicações biomédicas1,2,3.

No entanto, as aplicações crescentes de produtos baseados em ZnO NP, que levam ao aumento da exposição humana ao ZnO NPs, suscitou preocupações sobre os seus potenciais efeitos adversos na saúde humana. Vários estudos celulares in vitro demonstraram que ZnO NPS pode induzir estresse oxidativo, citotoxicidade relacionada à autofagia, inflamação e genotoxicidade4,5,6,7,8 . Notavelmente, presume-se que a toxicidade de ZnO NPs é causada pela dissolução de Zn para liberar Zn2 + íons, bem como a reatividade superficial de ZnO, resultando em desequilíbrios celulares iônicos e metabólicos que estão ligados com a homeostase iônica prejudicada e um inibição do transporte iônico4,7,9,10. É importante ressaltar que estudos demonstraram que a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um dos mecanismos primários subjacentes à toxicidade associada à ZnO NPs. A atividade antioxidativa insuficiente que segue o insulto de ROS foi mostrada para ser responsável para provocar a citotoxicidade e dano do ADN9. Os efeitos tóxicos de ZnO NPS também foram relatados em modelos animais, incluindo roedor1, zebrafish11,12, bem como a Drosophilade invertebrados13.

A Drosophila serve como um modelo animal alternativo bem estabelecido para a triagem de toxicidade de entidades químicas e nanomateriais (NMS)14,15. É importante ressaltar que existem altos níveis de similaridade genética e fisiológica entre o ser humano e a Drosophila que justifica o uso da Drosophila como um modelo in vivo para avaliar respostas biológicas a contaminantes ambientais, como NMS 16. Além disso, existem muitas vantagens de usar a Drosophila devido ao seu tamanho pequeno, tempo curto, Amenability genético, e fácil e custo-benefício de manutenção. Além disso, a Drosophila tem sido amplamente adotada para o estudo da genética, biologia molecular e do desenvolvimento, desde que seu genoma completo foi totalmente seqüenciado anos atrás em 2000, tornando-o adequado para uma variedade de triagem de alta taxa de transferência e para abordar questões biológicas não resolvidas17,18,19,20,21. Nos últimos anos, vários estudos relacionados à imunotoxicidade utilizando diferentes tipos de NPS na Drosophila foram relatados15,22,23,24. Este novo conhecimento fundamental obtido a partir dos estudos que utilizam a Drosophila tem ajudado a fornecer mais insights sobre a nossa compreensão da nanotoxicologia.

ROS é um bem conhecido culpado de citotoxicidade e genotoxicidade causada por NPs, em particular, NPs baseados em metal25. ROS são espécies químicas contendo oxigênio com propriedades reativas mais elevadas do que o oxigênio molecular. Os radicais livres tais como o radical do superóxido (O2-) e mesmo, moléculas não-radicais tais como o peróxido de hidrogênio (H2O2) podem actuar como Ros. condições fisiológicas normais, eles são obrigados a manter a homeostase celular26, no entanto, Ros excessivos devido à superprodução ou desregulação do sistema de defesa antioxidante pode causar estresse oxidativo, levando a danos às proteínas, lipídios e Ácido desoxirribonucleico (DNA)27. Por exemplo, à medida que os níveis de ROS aumentam e o nível de glutationa (GSH) diminui concomitantemente, a ruptura da síntese de trifosfato de adenosina (ATP) ocorre e o nível de lactato desidrogenase (LDH) aumenta no meio, culminando na morte celular27.

Aqui, nós fornecemos protocolos para a realização de análises celulares e genéticas usando células de mamíferos cultivadas e Drosophila para determinar os potenciais efeitos adversos de ZnO NPS. Uma visão geral do método utilizado para o estudo de toxicidade de ZnO NPs é mostrada na Figura 1.

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Protocol

1. fluorescência ativada Cell Sorting (FACS) análise em células vividas/fixas

  1. SONICATE ZnO NPs em suspensão por 15 min.
  2. Prepare ZnO NPs em várias concentrações (por exemplo, 0, 10, 25, 50.100 e 200 μg/mL) usando 1 mg/mL ZnO NP solução de ações para o tratamento de células cultivadas.
  3. Sementes MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/poço) em uma placa de cultura de 6 poços por dia de antecedência, e depois tratar as células com 2 ml de ZnO NPS (em triplicates) para 8 h, 16 h e 24 h.
  4. Em cada ponto de tempo, recolher as células por centrifugação em 300 x g por 5 min.
  5. Lave as pastilhas celulares duas vezes com tampão fosfato salina (PBS).
  6. Ressuscita as células com tampão de ligação 1x, que é composto de 0,1 M HEPES/hidróxido de sódio (NaOH), cloreto de sódio de 1,4 M (NaCl), e cloreto de cálcio de 25 mM (CaCl2), em uma concentração de 1 x 105 células por 100 μl.
  7. Adicionar 5 μL de fluoresceína isotiocianato (FITC) anexina V mancha e 5 μL de iodeto de propiídio (PI) de coloração de DNA, e incubar as células por 15 min à temperatura ambiente (RT; 25 ° c) no escuro.
  8. Top-se as amostras com um adicional de 400 μL de 1x tampão de ligação antes de classificar as células por citometria de fluxo. Um mínimo de 10.000 células é analisado para cada amostra.
  9. Tabulate o gráfico de barras usando a intensidade mediana obtida.

2. exposição de ZnO NPs a Drosophila

  1. Adicionar 1 mL de nanopartículas em diferentes concentrações em frascos, seguido de 9 mL de mosca para fazer uma concentração final de 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ou 0,5 mg/mL ZnO NPs.
  2. Misture as nanopartículas com alimentos cuidadosamente nos frascos usando a pipeta.
  3. Permitir que os alimentos com mosca que contenham ZnO NPs esfriem por pelo menos 2-3 h antes do uso.
  4. Introduzir moscas masculinas e fêmeas adultas nos frascos por 5 dias, e permitir que eles acasalam e põem ovos (que aparecem como manchas brancas) na superfície do alimento.
  5. Retire as moscas parentais, e permitir que os ovos para sofrer mais desenvolvimento, que consiste em 4 diferentes estágios de desenvolvimento (embrionário, larval, pupal e estágio adulto).

3. dissecção da mosca

  1. Colete larvas do final de 3RD instar da parede dos frascos para análise. Ovos recém-colocados normalmente se desenvolvem em larvas de 3RD instar tardio após 72-120 h em RT.
  2. Limpe o prato de dissecção e encha o poço com dissecção média/PBS.
  3. Dissecar as larvas (tardia 3RD instar) o estereomicroscópio, usando um par de fórceps.
  4. Use a ponta do fórceps para fazer um furo minúsculo e para quebrar aberto a camada da cutícula das larvas. Retire cuidadosamente o intestino e coloque-o num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo o meio de Drosophila da Schneider, antes da etapa de fixação utilizando 1 ml de paraformaldeído a 4% (PF).
  5. 3.5 fixar o intestino no PF por 10 min em RT, para experimentos subsequentes, como imunocoloração.

4. detecção de ROS usando coloração de Dihydroethidium (DHE)

  1. Trate as larvas com várias concentrações de ZnO NPs conforme descrito na etapa 2,1.
  2. Após a dissecção do intestino de larvas de 3RD instar, conforme descrito na seção 3, incubar o intestino no meio de Drosophila da Schneider em RT antes da coloração tecidual ser realizada. Dissolva 1 μL de corante DHE (a partir da concentração de 30 mM) em 1 mL do meio Schneider, fazendo uma concentração final de trabalho de 10-30 μM de corante DHE.
  3. Incubar o intestino por 5 min em RT no escuro, e depois lave três vezes usando o meio de Schneider para cada 5 min.
  4. Fixar o intestino com 4% PF (passo opcional) e montar o intestino em lâminas de vidro, com anti-fade montagem meio contendo 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Capture imagens um microscópio confocal.

5. medindo a fluorescência usando o software de ImageJ

  1. Importe as imagens capturadas da fluorescência adquiridas usando a microscopia de fluorescência ou a microscopia confocal da exploração do laser no software de ImageJ.
  2. Clique no menu Analyze e selecione definir medições.
  3. Selecione a medida de saída, como intensidade integrada da área e valor de cinza médio.
  4. Clique em medir.
  5. Selecione uma região sem fluorescência para definir o plano de fundo.
  6. Exporte os dados para a planilha do Excel e determine a fluorescência total corrigida da célula (CTCF), usando o cálculo como mostrado abaixo.
    CTCF = densidade integrada-(área da célula selecionada X média de fluorescência de leituras de fundo)
  7. Construa um gráfico de barras e realize análises estatísticas.

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Representative Results

As pilhas NP-expostas foram processadas com a pilha que mancha o jogo do reagente, seguida pela seleção da pilha usando a citometria do fluxo. As células tratadas com NP ZnO (inferior, painel direito) exibem uma percentagem mais elevada de células apoptóticas precoces (R3)/tardias (R6) do que as células de controlo (R5, inferior, painel esquerdo). A morte celular necrótica é indicada pelo R4 (painel superior, direito) (Figura 2). Os resultados do ensaio FITC/Anexin V em fibroblastos MRC-5 tratados com ZnO NP são mostrados na Figura 2.

Para as experiências de Drosophila , ZnO NPS sonicado em várias concentrações foram adicionados para voar alimentos em tubos de 10 ml e, em seguida, misturado bem usando um controlador de pipeta (Figura 3). Larvas do terceiro ínstar tardio coletadas de frascos foram dissecadas o estereomicroscópio. As larvas foram lavadas pela primeira vez para remover restos de alimentos remanescentes (Figura 4). A camada exterior da cutícula foi despedaçada para expor órgãos internos. O intestino foi identificado pela aparência longa e semitransparente característica (enquanto outros órgãos aparecem opaco e luz amarelada o microscópio) (Figura 5). O intestino foi cuidadosamente retirado, sem quebra, e transferido para um novo tubo de microcentrífuga contendo fixativo no gelo (Figura 6).

Para a quantificação da intensidade de fluorescência, como a intensidade da sonda DHE no intestino, as imagens foram exportadas em formatos JPEG ou TIFF e abertas com o software ImageJ. A parte do intestino para análise foi selecionada e identificada, por exemplo, a região do midgut ou intestino posterior, e a intensidade de fluorescência da região de interesse (ROI) foi mensurada. Para comparar as intensidades relativas dos diferentes grupos experimentais, empregou-se o mesmo método quantitativo de microscopia confocal descrito na seção anterior. Para comparação das intensidades de fluorescência, o parâmetro foi definido utilizando-se o controle negativo não tratado. Cálculos da intensidade do sinal com base nas intensidades de calibração do controle não tratado permitiram uma comparação direta entre os diferentes grupos experimentais. A Figura 7 mostra a intensidade média do sinal DHE no intestino larval de 3RD exposto a ZnO NPS em diferentes concentrações. O intestino de larvas tratadas com 0,5 mg/mL de tratamento com ZnO NP apresentou a maior intensidade de fluorescência.

As diferenças nas intensidades relativas entre todos os grupos experimentais foram tabuladas, e a análise estatística foi realizada, proporcionando resultados qualitativos e quantitativos (Figura 8).

Figure 1
Figura 1: visão geral do método utilizado para o estudo de toxicidade de ZnO NPS. Para o trabalho in vitro, as células tratadas com ZnO NP foram manchadas antes da análise da citometria de fluxo. Para o trabalho in vivo, o intestino foi dissecado de larvas de 3RD , seguidas de coloração com corante DHE e aquisição de imagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: parcela de pontos das células separadas em diferentes populações com base na coloração FITC e PE. Os pictogramas mostram os resultados do ensaio FITC/Anexin V com tratamento 24 h de ZnO-NPs no MRC-5. A análise estatística das células em diferentes estágios pode ser realizada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: preparação do meio de alimentação Fly contendo ZnO np. (A) os ingredientes para o alimento de mosca são adicionados à água, permitidos inchar, e cozidos por 5 min. (B) após refrigerar para baixo a 50 ° c com agitação, Nipagin foi adicionado e misturado completamente. (C) preparar uma mistura mestra para as nanopartículas (volume total não superior a 10% do volume de alimentos final). (D) médio é então aliquotado, misturado com ZnO NPS em várias concentrações e permitiu esfriar completamente antes do armazenamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: todo o procedimento de dissecção intestinal. (A) transferir larvas de 3RD instar para um disco de dissecção. (B) Use o fórceps para prender delicadamente uma larva, e (C) Lave afastado o remanescente do alimento usando o soro fisiológico. (D) rasgue delicadamente a cutícula distante sem tocar no intestino e em outros órgãos internos. (E) Coloque o intestino na solução salina para o procedimento subsequente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: a anatomia do trato digestivo/intestino. O intestino extraído da larva da Drosophila é dividido em três domínios discretos de diferentes origens do desenvolvimento, a saber, o intestino, intestino médio e hindgut. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: coloração do tecido intestinal com DHE. (A) Prepare uma mistura mestra contendo meio de crescimento e DHE (uma concentração final de 30 μm). (B) adicione o Mix mestre no poço de um disco de dissecção. (C) transferir o tecido do intestino dissecado para o poço que contém a mistura mestre DHE. (D) incubar em RT por 5 min e proteger o tecido da luz; Lave 3x em PBS/soro fisiológico para 5min. (E) fixar em 4% PF para 10 min; Lave o tecido três vezes com PBS (opcional). (F) gentilmente transferir o intestino para uma lâmina de vidro, Lay plana sem ter qualquer tecido dobrado e montar com suporte de montagem antes de cobrir com vidro de cobertura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7

Figura 7: ZnO NPS induz Ros no intestino de larvas de Drosophila. (a) a mancha de DHE no intestino de controle mostra o nível basal de Ros. (b e c) as células intestinais tratadas mostram um aumento gradual da intensidade da DHE de forma dose-dependente.  Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Quantitation de imagens fluorescentes usando ImageJ. (A) importe as imagens capturadas. (B) clique no menu analisar e selecione definir medições. (C) Seleccione a intensidade integrada da área e o valor cinzento médio. Selecione uma região sem fluorescência para definir o plano de fundo. (D) exportar os dados para o Excel e calcular o ctcf para posterior análise estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A fim avaliar se ZnO NP pode induzir o apoptose em fibroblastos MRC5, nós usamos o fluxo citometria para distinguir as pilhas da morte Necrotic ou apoptóticas da pilha. Em células normais ao vivo, a fosfatidilserina (PS) é localizada na membrana celular. Se a apoptose ocorre, o PS é translocalizado para o folheto extracelular da membrana plasmática, permitindo a ligação da anexina V rotulada com fluoresceina (FITC anexina V)29. De um lado, o iodeto vermelho-fluorescente do propidium (PI), um corante obrigatório do ácido nucleico, é impermeável às pilhas vivas e às pilhas apoptóticas mas mancha as pilhas inoperantes30. Isso nos permite identificar as células mortas (vermelho e verde), células apoptóticas (fluorescência verde) e células ao vivo (pouca ou nenhuma fluorescência), usando um citometro de fluxo com a linha de 488 nm de um laser de íon-argônio para excitação.

Para a coloração de DHE do intestino de Drosophila , é importante reconstituir o corante com DMSO pouco antes de iniciar o experimento, pois o armazenamento prolongado pode levar a uma autooxidação do corante que transforma o corante em cor escura/arroxeada31, 32. Além disso, as soluções de ações reconstituídas também tendem a expirar rapidamente, de modo que se tem que prestar atenção à "data de expiração". Alternativamente, as pontas de prova cromogênicos fluorogênicos tais como a versão verde da ponta de prova fotoestáveis, que tem a habilidade adicionada de ser multiplexados com manchas, e produzem sinais muito mais claros do que DHE, podiam ser usadas. O intestino dissecado foi transferido para o meio de Schneider contendo o corante na concentração desejada, sem adição de fixador. Isto é para permitir a incorporação do corante em células ao vivo, e, portanto, a coloração é realizada no meio de cultura, para permitir uma melhor respiração das células.

No que diz respeito à quantificação de DHE que mancha, para um começo, evite a saturação dos pixéis em pilhas não tratadas do controle. O programa de software de imagem foi utilizado para determinar o tempo de exposição através da sinalização visual de pixels saturados. A amostra não tratada foi utilizada para definir o tempo de exposição e manter os mesmos parâmetros ao capturar imagens para comparação da intensidade em diferentes grupos de tratamento, o que é importante para a quantificação da intensidade da imagem de fluorescência mais tarde. É essencial adquirir todas as imagens (controle e amostras tratadas) usando o mesmo sistema e configurações/parâmetros de aquisição, e o plano de fundo deve ser padronizado para todas as imagens (de modo que haja consistência para subtração de fundo)33.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O estudo foi apoiado pelo número de subvenção R706-000-043-490. O estudo não representa a visão do patrocinador da subvenção.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

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