Methodenartikel

Induzieren apische Parodontitis bei Mäusen

DOI:

10.3791/59521

⸱

6. August 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Dental Sciences, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Endodontics, Hadassah Ein Kerem Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um apische Parodontitis bei Mäusen lokal zu induzieren. Wir zeigen, wie man ein Loch in den Zahn der Maus bohrt und seinen Zellstoff freilegt, um lokale Entzündungen zu verursachen. Es werden auch Analysemethoden zur Untersuchung der Art dieser Entzündung wie Mikro-CT und Histologie gezeigt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Mechanismen, die an lokal induzierten Entzündungen beteiligt sind, können mit mehreren verfügbaren Tiermodellen untersucht werden. Eine davon ist die Induktion von apikaler Parodontitis (AP). Apical Parodontitis ist eine häufige Pathologie entzündlicher Natur in den parodontalen Geweben, die die Zahnwurzel umgeben. Um die Natur und den Mechanismus dieser Pathologie besser zu verstehen, ist es vorteilhaft, das Verfahren bei Mäusen durchzuführen. Die Induktion dieser odontogenen Entzündung wird durch Bohren in den Mauszahn erreicht, bis das Zellstoffstoff exponiert ist. Als nächstes bleibt das Zahnfleisch ausgesetzt, um durch die natürliche Mundflora im Laufe der Zeit kontaminiert zu werden, was apikale Parodontitis verursacht. Nach diesem Zeitraum wird das Tier geopfert, und der Zahn und der Kieferknochen können auf verschiedene Weise analysiert werden. Typische Analysen umfassen Mikro-CT-Bildgebung (zur Bewertung der Knochenresorption), histologische Färbung, Immunhistochemie und RNA-Expression. Dieses Protokoll ist nützlich für die Forschung auf dem Gebiet der Oralbiologie, um diesen entzündlichen Prozess in einem in vivo experimentellen Umfeld mit einheitlichen Bedingungen besser zu verstehen. Das Verfahren erfordert einen sorgfältigen Umgang mit den Mäusen und dem isolierten Kiefer, und eine visuelle Demonstration der Technik ist nützlich. Alle technischen Aspekte der Verfahren, die zu induzierten apikalen Parodontitis und deren Charakterisierung in einem Mausmodell führen, werden demonstriert.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel dieser Methode ist es, apikale Parodontitis in einer Maus zu induzieren, indem die Spitze mit der natürlichen Mikroflora kontaminiert wird, und dann verschiedene Eigenschaften dieses pathologischen Prozesses zu untersuchen.

Apical Parodontitis (AP) ist eine häufige Pathologie entzündlicher Natur in den parodontalen Geweben, die die Zahnwurzel umgeben. Diese Zahnerkrankung kann starke Schmerzen verursachen und muss von einem Zahnarzt behandelt werden. Die Behandlungsmöglichkeiten umfassen Wurzelkanalbehandlung (primär oder sekundär), endodontische Chirurgie, Zahnextraktion oder Nachsorge je nach klinischen und radiographischen Befunden und die Meinung des Arztes. Der Mechanismus dieses entzündlichen Prozesses, obwohl seit mehreren Jahrzehnten untersucht1,2,3, ist immer noch nicht umfassend verstanden. Angesichts der Schwere dieser Pathologie besteht daher ein klarer Bedarf an Forschung, die sich mit ihrem grundlegenden Charakter befasst. Daher sind Systeme, in denen das Studium von AP möglich ist, von großem wissenschaftlichen Interesse.

Da AP ein komplexer pathologischer Prozess ist, an dem das lokale Gewebe und das Immunsystem beteiligt sind, reichen In-vitro-Studien nicht aus, um die Prozesse vollständig zu verstehen. Die Untersuchung klinischer Proben dieser Krankheit ist auch aufgrund ethischer Einschränkungen und signifikanter Variabilität zwischen verschiedenen Menschen und verschiedenen klinischen Stadien4,5, und damit der Notwendigkeit von In-vivo-Modellen problematisch. Diese Modelle basieren auf dem Konzept, den Zellstoff der Zahnfleischkontamination auszusetzen und die entzündliche Reaktion des Körpers auf diesen Reiz in den periapischen Geweben6,7zu beobachten. Häufige In-vivo-Modelle sind Nagetiere oder größere Tiere wie Hunde. Trotz der klinischen Herausforderung bei der Behandlung von Mäusen, bei denen es sich um sehr kleine Tiere mit Miniaturzähnen handelt, sind die Vorteile des Mausmodells signifikant: Praktisch ist die Arbeit mit Mäusen technisch einfach in Bezug auf die Einrichtungen und ist am kostengünstigsten, und Wissenschaftlich ist die Maus ein gut erforschtes Tiermodell mit leicht verfügbaren genetischen und molekularen Werkzeugen und einem gut untersuchten Genom. Tatsächlich verwendeten frühere Studien ein Mausmodell für die Untersuchung von entzündlichen und Knochenresorptionssignalen und Zellen, die an apikalen Parodontitis8,9,10,11beteiligt sind. Daher ist ein klares Protokoll zur Verwendung eines Mausmodells für die Untersuchung von AP erforderlich. Hier beschreiben wir ein solches Protokoll.

Das hier beschriebene Protokoll hat den großen Vorteil, dass es geeignet ist, Knock-out-Mäuse (KO) zu untersuchen und zu erfahren, wie das Fehlen eines bestimmten Gens zahnärztliche Entzündungen beeinflusst7,12. Weitere nützliche Anwendungen dieses Protokolls sind die Untersuchung der Auswirkungen von Medikamenten und systemischen Bedingungen auf die Entwicklung der apikalen Parodontitis13, die Wirkung der apikalen Parodontitis auf die Entwicklung der Osteonekrose der Kiefer14 , 15 und Stammzelltherapie zur Knochenregeneration16.

Dieses Protokoll kann auch als Modell zur Untersuchung lokaler Entzündungen verallgemeinert werden. Um den Entzündungsprozess zu untersuchen, wurden mehrere Mausmodelle entwickelt, darunter z.B. induzierte Kolitis oder Arthritis17,18. Diese Modelle haben systemische Effekte und haben keine eingebaute Kontrolle im selben Tier. Modelle für induzierte apikale Parodontitis, die eine kontralaterale Kontrolle ohne Entzündung beinhalten, haben den Vorteil, diese Einschränkungen zu überwinden14,19.

Das unten beschriebene Protokoll ist daher nützlich für Forscher, die sich für lokale Entzündungsprozesse interessieren. Die kontrollierte Natur dieser Entzündung, ihre Einschließung an einen bestimmten Ort und der kontralaterale Kontrollzahn machen dieses Protokoll wertvoll für die Untersuchung der Mechanismen, die an diesem Prozess beteiligt sind. Darüber hinaus ist das Protokoll nützlich für Forscher, die sich für die klinischen Aspekte der periapischen Entzündung interessieren. Das Mausmodell ist ideal, um verschiedene Variablen der Krankheit zu studieren, zusätzlich zu dem Vorteil, dass es in der Lage ist, genetische Manipulationen im Mausmodell einfach durchzuführen, um die Aktivität bestimmter Gene bei periapischen Entzündungen zu untersuchen.

Technisch gesehen ist das klinische Verfahren aufgrund der geringen Abmessungen der Mäusezähne eine Herausforderung. Es wird von Vorteil sein, dieses Verfahren zu visualisieren, um mehr über Positionierung, benötigte Ausrüstung und Leistung zu erfahren.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Hebräischen Universität (Ethics no. MD-17-15093-5).

1. Tieranästhesie und Positionierung

  1. Bereiten Sie sterile Lösungen wie unten beschrieben vor.
    1. Bereiten Sie 5 ml 7 mg/ml Ketamin und 0,09 mg/ml Medetomidin in Phosphatpufferlösung (PBS)/Saline verdünnt vor.
    2. Bereiten Sie eine sterile Lösung von Atipamezol (0,4 mg/ml) in PBS/Saline verdünnt (empfohlen, eine Menge von 5 ml vorzubereiten).
    3. Bereiten Sie eine sterile Lösung von Mepivacain (7,5 mg/ml) in PBS/Saline für die lokalanästhesie verdünnte Lösung vor (eine mitgelieferte Durchstechflasche mit Mepivacain ist für einen Bestand von 7,2 ml ausreichend).
  2. Verwenden Sie 6-8 Wochen alte weibliche C57BL/6 Mäuse für das Experiment. Halten Sie die Tiere in einer bestimmten pathogenfreien (SPF) Tiereinheit auf, wobei Standardwasser und -nahrung von der Anlage und der Fütterung sad libitum bereitgestellt werden.
  3. Wiegen Sie Mäuse und injizieren Sie intraperitoneal (IP) ein Volumen von 10 l für jedes Gramm des Gewichts. Zum Beispiel für eine Maus, die 20 Gramm wiegt,
    200 L Ketamin/Medetomidin-Lösung zu injizieren. Dies wird eine Endkonzentration von (70 mg/kg) Ketamin und (0,9 mg/kg) Medetomidin
    für jedes Tier.
  4. Um Augengeschwüre durch Trockenheit während des Eingriffs zu verhindern, tragen Sie Augensalbe mit Chloramphenicol (5%) auf die Augen der Tiere, während sie unter Anästhesie sind. Halten Sie die Tiere warm mit einer Lampe, während sie anästhesiert werden. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex (durchführende feste Zehenklemmung) überprüfen.
  5. Nachdem die Maus beästhebt wurde, positionieren Sie die Maus auf der rechten Seite (für einen Rechtshänder) auf einer geschlossenzelligen extrudierten Polystyrolschaumoberfläche und befestigen Sie die Füße mit Klebeband an der Oberfläche.
  6. Öffnen Sie den Mund mit kleinen Gummibändern um die Schneidezähne (1 für obere Schneidezähne und 1 für niedrigere Schneidezähne), die durch lange Nadeln, die in die geschlossenzellige extrudierte Polystyrolschaumoberfläche gepinnt sind, gehalten werden.
  7. Ziehen Sie die rechte Wange mit Zangen an die Oberfläche geklebt. Verwenden Sie Zangen, die im stationären Zustand geschlossen sind.
  8. Platzieren Sie die Oberfläche mit der Maus in einer komfortablen Arbeitsposition, die den Zugang zu Unterkiefermolaren mit der richtigen Vergrößerung (ein binokulares Mikroskop oder klinisches Mikroskop) und Licht ermöglicht.
  9. Ziehen Sie die Zunge mit Zangen oder Zahnspachtel zurück und injizieren Sie lokal anästhesie mit einer 27 Gauge Nadel in die mucobuccal Falte neben dem ersten Unterkiefermolaren. 25-50 l ist ausreichend. Schwellung des Gewebes um die Injektionsstelle sollte visualisiert werden.

2. Zellstoffexposition

  1. Verwenden Sie einen 1/4 runden Zahngrat oder einen Diamantgrat gleicher Größe (ein langer Schaft wird empfohlen) mit einer Geschwindigkeit von 800 Runden pro Minute (Drehzahl), der an jedem geeigneten Dentalmotor (z. B. einem automatischen Drehmomentmindermotor (ATR) befestigt ist).
  2. Bohren Sie auf dem okklusalen Teil des ersten rechten Unterkiefermolaren, bis die Zellstoffhörner durch das Dentin sichtbar sind. kurze Ausbrüche des Motors verwenden, um eine Flächenüberhitzung zu verhindern.
  3. Verwenden Sie eine K-Datei oder Eine H-Datei #8 oder #10, um das Fruchtfleisch zu durchbohren und die Datei in die Zellstoffhörner (mesial und distal) einzufügen, indem Sie das Dentin, das sie bedeckt, brechen. Dateien werden durch Autoklaven sterilisiert.
  4. Fahren Sie mit den Dateien im Zellstoff so tief wie möglich weiter, während Sie die Öffnungen mit den Dateien erweitern. In der Regel werden Blutungen sichtbar aus dem Zellstoff sein.
  5. Achten Sie darauf, scharfe Kanten des Zahnes mit dem Grat zu runden und den Zahn aus der Okklusion zu entfernen, um Schmerzen während des Experiments zu reduzieren. Reinigen Sie den Schmutz während des Eingriffs mit einer Mikrobürste.
  6. Lassen Sie den kontralateralen Zahn (links zuerst Unterkiefermolaren) als Kontrolle.

3. Ende des klinischen Verfahrens

  1. Lösen Sie die Maus aus dem Fixierungszustand und injizieren Sie Atipamezole IP (10 l für jedes Gramm Körpergewicht). Dies wird eine endgültige Dosis von (4 mg/kg) Atipamezol geben.
  2. Buprenorphin in PBS/Saline (0,05 mg/kg) IP verdünnt es injizieren (empfohlen, am Tag des Eingriffs eine Menge von 3 ml zu zuzubereiten). Siehe Diskussion, um zu erklären, warum Schmerzlinderung notwendig ist.
  3. Stellen Sie sicher, dass sich die Tiere von der Anästhesie erholen, bevor Sie sie verlassen. Geben Sie ihnen weiche Nahrung, weil sie aufgrund von Zahnschmerzen nicht in der Lage sein können, harte Nahrung zu essen.

4. Follow-up nach dem Verfahren (42 Tage)

  1. Wiegen Sie die Tiere in den ersten 3 Tagen nach dem Eingriff und injizieren Sie Einmal täglich Buprenorphin (0,1 mg/kg) IP (empfohlen, eine Menge von 6 ml zuzubereiten).
  2. Während der Zeit des Experiments (42 Tage, wenn sich eine Entzündung aufbaut) überwachen Sie die Tiere nach Gewicht und allgemeiner Verhaltensbeurteilung 2-3 mal pro Woche.
  3. Liefern Sie den Tieren im Laufe der Nachbeobachtungszeit weicheNahrung. Befeuchten Sie das Essen mit Wasser und legen Sie es in eine Petrischale auf dem Boden des Käfigs.

5. Experimentierung und Analyse

  1. Nach 42 Tagensind 11 Folgemaßnahmen abgeschlossen, anästhesieren Tiere IP mit Ketamin/Xylazin in einer Konzentration von 106,25 mg/kg Ketamin, und 75 mg/kg Xylazin (eine Stammlösung von 42,5 mg/ml Ketamin, und 1,5 mg/ml Xylazin in einem Gesamtvolumen von 2 ml ist empfohlen) und preform zervikale Dislokation.
    HINWEIS: Es gibt verschiedene Optionen für möglicheAnalysen, um Entzündungen 20,21zu bewerten. Hier wird die Analyse des Gewebes durch Mikro-CT und histologische Färbung beschrieben.
  2. Nach der Euthanasie verwenden Sie chirurgische Schere und Zangen, um einen Teil des Kiefers einschließlich der 3 Molaren (separat für jede seitlich behandelte und nicht behandelte Kontrolle) auszuschneiden. Durch die Verwendung von Zangen schälen Sie so viel wie das Weichgewebe wie möglich ab und lassen Sie hauptsächlich Knochen und Zähne auf der Probe.
  3. Spülen Sie das Gewebe kurz in PBS, und legen Sie es dann in Paraformaldehyd (PFA) 4% (in PBS verdünnt) für 24-48 Stunden für die Fixierung.
    VORSICHT: Verwenden Sie PFA in einer chemischen Haube und gemäß den Richtlinien des Material Safety Data Sheet (MSDS).
  4. Nach 24-48 Stunden mit PBS 3x abspülen, um das PFA auszuwaschen.
  5. Micro-CT
    1. Für die Mikro-CT-Analyse nehmen Sie die geernteten Gewebe (Teil des Unterkiefers einschließlich 3 Molaren, in den Abmessungen von ca. 4 mm x 5 mmx 1 mm) zu einem Mikro-CT-Scanner, legen Sie sie in ein Rohr mit 12 mm Durchmesser, das mit 1,5 ml PBS-orientiert gefüllt ist, so dass die bukkalen oder lingualen Oberflächen des Zahnes und der Wurzel parallel zur Unterseite des Rohres liegen. Trennen Sie zwischen den Proben mit Schwamm, und decken Sie die Oberseite des Rohres mit flexiblen Film.
    2. Öffnen Sie das Scan-Panel, und wählen Sie die Messnummer aus. Wählen Sie die Steuerdatei mit den folgenden Parametern: Energie von 70 kV, Intensität von 114 A und Auflösung von 6 'm3 Voxelgröße.
    3. Klicken Sie auf die Scout-Ansicht, und wenn das Bild angezeigt wird, klicken Sie auf Referenzlinie und markieren Sie den Bereich der Beispiele zum Scannen. Nach jedem Beispiel klicken Sie auf Scan hinzufügen. Wenn Sie die Beispiele markieren, wechseln Sie zur Aufgabenliste, und wählen Sie "Interaktionsaufgaben starten"aus.
      HINWEIS: Die gleichen Proben können anschließend für die Histologie verwendet werden. Es ist wichtig, dass sie während des CT-Scans nicht austrocknen.
  6. Verwenden Sie ein geeignetes Computerprogramm für die Mikro-CT-Ausrichtung und -Analyse.
    1. Öffnen Sie die Probe auf der XY-Ebene in der Mikro-CT-Auswertung. Wählen Sie für jede Stichprobe drei Punkte für die Ausrichtung aus:
      Die mesiale apikale Verengung - definiert den Ursprung des Koordinatensystems.
      Der koronare Teil des mesialen Kanals - definiert einen Punkt auf der Z-Achse.
      Die distale apikale Verengung - definiert einen Punkt auf der XZ-Ebene.
    2. Verwenden Sie das Messwerkzeug auf der linken Seite, und zeichnen Sie eine Linie, die jeden Punkt erreicht. Definieren Sie jeden der drei Punkte durch einen X-, Y & amp; Z-Wert, wie er im rechten Bereich angezeigt wird.
    3. Definieren Sie den Interessenbereich in der Stichprobe, indem Sie die Aufgabe unter der Option "CT-Auswertung"auswählen, und klicken Sie auf 3D-Auswertung. Auf dem Bildschirm werden ein Rechteck und ein Fenster mit den Bemaßungen pro Achse angezeigt. Passen Sie die Abmessungen des Rechtecks an den Interessenbereich auf der XY-Achse an, indem Sie mit der mittleren Maustaste in die Ecken klicken. Wählen Sie die Bemaßungen in der Z-Achse aus, indem Sie die erste Segmentzahl des Interesses am Z-Quadrat unter VOI Startund die Anzahl der Slices vom ersten bis zur letzten Slice-Zahl des Interesses am Z-Quadrat unter Dimeinfügen.
    4. Klicken Sie auf Anwendungen unter Sitzungsmanager, und wählen Sie DECterm. Warten Sie einige Sekunden, bis ein Fenster geöffnet wird, und geben Sie dann die fünf Schritte des schrägen Skripts ein, die unten gemäß den folgenden Anweisungen beschrieben werden (zwischen den Zeilen auf Enterklicken):
      Ipl
      isq_to_aim
      ziel1
    5. Kopieren Sie den Namen isq (Datei von Interesse): Wählen Sie Ansichten unter Sitzungs-Manager aus und klicken Sie auf microCTdata. Suchen Sie die Datei, an der gearbeitet wird, und klicken Sie mit der Mitte auf die Datei. Klicken Sie dann in das Fenster des DECterm zurück.
    6. Geben Sie die X-, Y- und Z-Werte (mit einem Leerzeichen dazwischen) ein, die unter VOI bei der Auswahl der Interessenregion ermittelt wurden.
    7. Geben Sie die X-, Y- und Z-Werte (mit einem Leerzeichen dazwischen) ein, die bei der Auswahl der Interessenregion unter dim ermittelt wurden.
    8. Warten Sie, bis Sie eine Nachricht erhalten: isq to aziel completed.
      (Schritt II- Ausrichtung):
      z ausrichten
      ziel1
      ziel2
    9. Geben Sie die X-, Y- und Z-Werte (mit einem Leerzeichen zwischen ihnen) ein, die für den Ursprung des Koordinatensystems ermittelt wurden.
    10. Geben Sie die X-, Y- und Z-Werte (mit einem Abstand zwischen ihnen) ein, die für den Punkt auf der z-Achse bestimmt wurden.
    11. Geben Sie die X-, Y- und Z-Werte (mit einem Abstand zwischen ihnen) ein, die für den Punkt auf der XZ-Ebene ermittelt wurden.
    12. Warten Sie, bis Sie eine Meldung erhalten: "align_Z abgeschlossen"
      (Schritt III- Kopf):
      kopfball
      ziel2
      0 0 0
      0 0 0
    13. Klicken Sie auf Enter.
      (Schritt IV- Konvertieren der Datei zurück von ziel in isq):
      toisq
      ziel2
    14. Kopieren Sie den Namen isq (Datei von Interesse): Wählen Sie Ansichten unter Sitzungs-Manager aus und klicken Sie auf microCT-Daten. Suchen Sie die Datei, an der Sie arbeiten, und klicken Sie mit der Mitte auf die Datei. Klicken Sie dann in das Fenster des DECterm zurück. Löschen (mit "Rückraum") die ". ISQ" am Ende der Datei, und schreiben Sie:"_new. ISQ", um die ausgerichtete Datei zu erkennen.
    15. Klicken Sie auf Enter | geben Sieein.
    16. Warten Sie, bis Sie eine Nachricht erhalten: "toisq_from_aim completed"
      (Schritt V- Flip):
      Isq
      pro
    17. Kopieren Sie den neuen isq -Namen (Datei von Interesse): Wählen Sie Ansichten unter Sitzungs-Manager aus und klicken Sie auf microCT-Daten. Suchen Sie die Datei, an der gearbeitet wird, und klicken Sie mit der Mitte auf die Datei. Klicken Sie dann in das Fenster des DECterm zurück.
    18. Klicken Sie auf Enter | geben Sieein. Warten Sie, bis Sie eine Meldung erhalten: "isq_to_aim completed"
      schnipser
      pro
      Aa
      Zx
      warten, um eine Nachricht zu erhalten: "flip_aim abgeschlossen"
      Von
      Aa
    19. Kopieren Sie den neuen isq-Namen: Wählen Sie Ansichten unter Sitzungs-Manager aus und klicken Sie auf microCT-Daten. Suchen Sie die Datei, an der gearbeitet wird, und klicken Sie mit der Mitte auf die Datei. Klicken Sie dann in das Fenster des DECterm zurück. Löschen (mit "Rückraum") die ". ISQ" am Ende der Datei und schreiben: "_flip. ISQ", um die ausgerichtete Datei zu erkennen.
    20. Warten Sie, bis Sie eine Nachricht erhalten: "from_aim_to_isq completed"
  7. Contouring
    1. Wählen Sie die Scheibe, die ungefähr die Mitte des Zahnes darstellt, in der der koronale Zellstoff, der Radkulärzellstoff beider Kanäle und beide apikalen Foramen dargestellt werden.
    2. Markieren Sie manuell die Kontur des Interesses auf dem mittleren Schnitt, indem Sie auf das obere linke Konturpanel klicken - beginnend mit dem distalen Punkt der distalen Wurzelspitze markieren Sie den apikalen Rand koronal zum radiopaque apischen Bereich, durch den mesialen Rand der mesialen Wurzelspitze nach der distalen Grenze der mesialen Wurzel und der mesialen Grenze der distalen Wurzel durch die Furkationsregion (siehe Abbildung 3 II,IV).
    3. Kopieren Sie diese Kontur (Strg+C, Strg+V) und passen Sie sie entsprechend an 5 Slices an, die auf beiden Seiten des mittleren Segments positioniert sind.
    4. Um das Gewebevolumen der für jede Probe markierten Kontur zu berechnen, wählen Sie die Aufgabe unter der "CT-Auswertung"aus und klicken Sie auf 3D-Auswertung. Klicken Sie im Fenster der 3D-Auswertung auf Near Task auswählen und wählen Sie einen Filter, um das Gewebevolumen (TV) zu berechnen.
  8. Histologie
    1. Nach der Entfernung des Gewebes aus dem Mikro-CT-Scanner entkalken Sie das Gewebe, indem Sie jede Probe 10 Tage lang in ein Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 0,5 Mio. pH 8,0 geben. Ändern Sie die EDTA-Lösung alle 3 Tage.
    2. Dehydrierung: Proben in histologische Kassetten und in steigende Ethanolkonzentrationen, jeweils eine Stunde, wie folgt: 70% Ethanol (an dieser Stelle kann der Prozess für mehrere Wochen angehalten werden, solange die Proben in Ethanol aufbewahrt werden), 90% Ethanol 2x, 100% Ethanol 2x, Xylol 2x (Vorsicht: Verwenden sie Xylol in einer chemischen Haube und gemäß den MSDS-Richtlinien).
      1. Kassetten auf flüssiges Paraffin (60 °C) übertragen und in der chemischen Haube über Nacht lassen, damit das Xylol verdunstet.
    3. Blockieren: Verwenden Sie eine histologische Blockiermaschine, um die Proben in Paraffin einzubetten. Achten Sie darauf, sie in einer richtigen Position einzubetten (d.h. die Krone und die Wurzeln sollten parallel zum unteren Teil der Form ausgerichtet sein, so dass der Zahn "liegt", um sagittale Abschnitte zu erhalten. Die Proben können nun mit einem Mikrotom geschnitten werden.
    4. Schneiden der Abschnitte: Beginnen Sie mit dem Schneiden dicker Scheiben von 20 m bis zum Erreichen des relevanten Teils des Gewebes. Sobald sie einen Teil des Zahnes (Krone oder Wurzeln) erkennen, ändern Sie sich in Abschnitte von 6 m, und ändern Sie den Schnittwinkel gemäß dem vorherigen Abschnitt.
      1. Wenn der vorherige Abschnitt z. B. die Krone, aber nicht die Wurzeln enthält, ändern Sie den Winkel des Blocks im Mikrotome, so dass die Wurzeln näher an das Messer heranrücken und die Krone zurückgeht (die Teile des Zahnes können mit bloßem Auge auf den Block selbst erkannt werden).
      2. Stellen Sie den Winkel bis zur Gewinnung sagittaler Abschnitte einschließlich koronalen und radikulären Zellstoffs und des apikalen Foramens ein. Schneiden Sie in dieser Ausrichtung so viele Scheiben wie möglich, bis das entsprechende Gewebe geschnitten ist.
    5. Für Färbeprotokolle (z.B. Haemotoxylin- und Eosinfärbung (H&E), Braun- & Brennfärbung, Tartrat-resistente Säurephosphatase (TRAP) Färbung, Immunhistochemie), siehe20,21.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Flussdiagramm der experimentellen Schritte ist in Abbildung 1dargestellt. Wie im Protokoll erwähnt, werden die Mäuse anästhesiert, und ihr erster Unterkiefermolar auf einer Seite wird bis zur Zellstoffexposition gebohrt, während der kontralaterale Zahn als Kontrolle gelassen wird. Als nächstes werden die Zähne 42 Tage lang durch die Mundflora kontaminiert, während dersie überwacht werden und Schmerzmittel erhalten. Nach 42 Tagen werden Mäuse eingeschläfer...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird eine Methode zur Induktion von apikalen Parodontitis bei Mäusen eingeführt. Das Ziel der Methode ist es, die apikale Parodontitis Bedingung für die Untersuchung von Mechanismen und Folgen dieses entzündlichen Prozesses zu nutzen. Apische Parodontitis wurde bei 6-8 Wochen alten Mäusen induziert, ein Alter, in dem die Wurzeln voll entwickelt sind24. Um in diesem Modell apikale Parodontitis zu verursachen, wird der Zahnbrei von Maus-Mandibulären Molaren mit einem Zahngrat ausge...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten Dr. Oded Heyman für seine Hilfe bei der Tierpositionierung, Raphael Lieber für Hilfe bei der Mikro-CT-Analyse und Prof. Andiara De Rossi Daldegan für ihre Beratung zur Vorformung des Experiments danken. Wir möchten auch Dr. Sidney Cohen für das kritische Lesen und Bearbeiten würdigen.

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Dr. Izador I. Cabakoff Research Endowment Fund an MK und IA und ein Yitzhak Navon Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie an die EG unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AtipamezolhydrochloridEurovet Animal HealthCAS 104075-48-1
ATRdentsplytecnika
BlockiermaschineLeicaEG1150H
Buprenorphinvetmarket163451
klinisches Mikroskop/BinokularOlympusSz61
ZahnbohrerKomet DentalZR8801L 315 008
DentalspatelPremier1003737
EDTAJ.T Baker8993
entelanQuecksilber1.07961
Eosin Y-Lösung, alkoholischeSIGMAHT110116
Hämatoxylinlösung, Mayer'sSIGMAMHS 16
KetaminhydrochloridVetoquinolCAS 1867-669
Medetomidinhydrochlorid (Cepetor)CP-pharma GmbHCAS 86347-15-1
Mepivacain HCl 3%TevaCAS 96-88-8
Mikrobürsten- einstellbare PräzisionsapplikatorenPARKELLS379
Mikro-CT ScannerscancouCT 40
ParafinLeica39602004
PBSSIGMAD8537
PFAEMS15710
Chloramphenicol Augensalbe (5%)Rekah pharmazeutischCAS 56-75-7
PinzetteWAMRef-CT
XylazinEurovet TiergesundheitCAS 7361-61-7
XylolGadotCAS 1330-20-7

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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