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Methodenartikel

Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen

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DOI:

10.3791/59561

⸱

10. Juli 2019

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt Methoden für ein Mausmodell der traumatischen Hirnverletzung mit offenem Schädel und die Transplantation kultivierter, humaninduzierter pluripotenter Stammzellen-abgeleiteter Zellen in die Verletzungsstelle. Verhaltens- und histologische Tests der Ergebnisse dieser Verfahren werden ebenfalls kurz beschrieben.

Zusammenfassung

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Krankheitspathologie aufgrund von TBI entwickelt sich von der primären mechanischen Beleidigung zu sekundären Verletzungsprozessen, einschließlich Apoptose und Entzündung. Tiermodellierung war wertvoll bei der Suche nach Verletzungsmechanismen und Bewertung potenzieller neuroprotektive Therapien. Dieses Protokoll beschreibt das Modell der kontrollierten kortikalen Wirkung (KII) des fokalen, offenen TBI. Insbesondere werden Parameter für die Herstellung einer leichten einseitigen kortikalen Verletzung beschrieben. Die Verhaltensfolgen von CCI werden mit dem Klebebandentfernungstest der bilateralen sensorimotorischen Integration analysiert. In Bezug auf die experimentelle Therapie für TBI-Pathologie, dieses Protokoll zeigt auch einen Prozess für die Transplantation kultivierter Zellen in das Gehirn. Neuronale Zellkulturen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen wurden, wurden aufgrund ihres Potenzials ausgewählt, eine überlegene funktionelle Wiederherstellung bei menschlichen TBI-Patienten zu zeigen. Chronisches Überleben von HiPSCs im Hirngewebe der Wirtsmaus wird mit einem modifizierten DAB-Immunhistochemischen Prozess nachgewiesen.

Einleitung

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein allgemeiner Begriff für die erworbene Schädigung des Gehirns aufgrund von indirekten mechanischen Kräften (Rotationsbeschleunigung/Verzögerung oder Gegenputsch) durch Schläge auf den Kopf oder direkte Schäden durch Objekte oder Explosionswellen. TBI ist schätzungsweise die Ursache von etwa 9 % der weltweiten Todesfälle undwurde in schätzungsweise 50 Millionen Fällen pro Jahr 1,2beobachtet. Ein Bericht der Centers for Disease Control and Prevention aus dem Jahr 2017 schätzte, dass es im Jahr 2013 insgesamt 2,8 Millionen Krankenhausbesuche und Todesfälle aufgrund von TBI in den Vereinigten Staatengab 3. Viele mildere TBIs werden jedes Jahr nicht gemeldet. Seriöses TBI kann zu lebenslanger Beeinträchtigung der Kognition, der motorischen Funktion und der allgemeinen Lebensqualität führen. Die Folgen von mildem TBI, insbesondere repetitives sportbezogenes TBI, wurdenerst vor kurzem für ihre heimtückischen gesundheitlichen Auswirkungen 4,5geschätzt.

Die präklinische Modellierung ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung neuer mechanistischer Erkenntnisse und einer möglichen restaurativen Therapie für TBI. Das Modell der kontrollierten kortikalen Schlagwirkung (CCI) von TBI ist ein Open-Head-Modell der mechanischen Prellung des Kortex. Die Aufprallparameter können geändert werden, um CCI-Verletzungen zu erzeugen, die von leichten bis schweren6reichen. CCI-Verletzungen sind eher fokal als diffus, wie bei anderen geschlossenen Kopfmodellen von TBI zu sehen ist. CCI kann durchgeführt werden, um eine einseitige Verletzung zu induzieren, so dass der kontralaterale Kortex als interner Vergleich dienen kann. Dieses Protokoll zeigt die Eigenschaften einer milden CCI für einen Teil des Kortex, der primäre somatosensorische und motorische Regionen umfasst. Dieser kortikale Bereich wurde für seine Beteiligung an sensorimotorischen Verhaltensweisen ausgewählt, für die zahlreiche Verhaltenstests verletzungsbedingte Defizite erkennen können7. Auch Verhaltensverbesserungen durch therapeutische Eingriffe bei TBI können nachgewiesen werden.

Ein Kennzeichen von TBI ist die weit verbreitete neuronale Dysfunktion in der verletzten Region. Verletzte Neuronen erleiden den Zelltod, und die neuronale Netzwerkkonnektivität ist gestört8,9. TBI stört die Rekrutierung endogener Stammzellen, was zu weiteren nachgelagerten Verhaltensdefiziten10,11führt.  Die Transplantation von neuronalen Stammzellen und Stammzellen-abgeleiteten Zellen wurde als Möglichkeit zur Wiederherstellung der Funktion im verletzten Gehirn untersucht. Zusätzlich zu dem Potenzial, beschädigte neuronale Schaltkreise wiederherzustellen, üben transplantierte Zellen parakrine Effekte aus, die das neuronale Überleben und die funktionelle Erholung von TBI12fördern. Eine Vielzahl von Zelltypen wurden präklinisch transplantiert, um ihr restauratives Potenzial in Modellen neurologischer Erkrankungen13,14,15zu bewerten. Die jüngste Popularisierung der induzierten pluripotenten Stammzelltechnologie16 hat die Entwicklung zahlreicher menschlicher Stammzelllinien für den experimentellen Einsatz erleichtert. Präklinische Tests mit hiPSC-abgeleiteten Zellen sind ein wichtiger erster Schritt, um die potenzielle therapeutische Wirksamkeit einer bestimmten Zelllinie gegen menschliche Krankheiten zu charakterisieren. Dieses Labor hat Protokolle zur Unterscheidung von HiPSCs zu neuralen Phänotypen17 entwickelt, um transplantierbare Zellen zu erhalten, um die Erholung von traumatischen Hirnverletzungen zu unterstützen.

Experimente in diesem Protokoll verwenden eine einseitige CCI, um TBI in die linke somatosensorische und motorische Kortex von erwachsenen Mäusen zu induzieren. Eine leichte CCI-Verletzung führt zu einem anhaltenden funktionellen Defizit im rechten Vorderpfau, das verwendet wird, um die Auswirkungen der von hiPSC abgeleiteten neuronalen Zelltransplantation auf die funktionelle Wiederherstellung zu verfolgen. Die senkpermittelmotorische Prüfung in diesem Protokoll wurde an die von Bouet und Kollegen18 festgelegte Methodik angepasst und zuvor von Fleming und Kollegen19demonstriert.  Dieses Protokoll skizziert einen vollständigen Workflow für die Durchführung einer experimentellen Hirnverletzung, therapeutische Transplantation von HiPS-Zellen und Verhaltens- und histologische Analysen experimenteller Ergebnismessungen.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden vom Uniformed Services University Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt.

1. Kraniektomie und kontrollierte kortikale Wirkung

  1. Vorbereitung des kontrollierten kortikalen Aufprallgeräts und der chirurgischen Versorgung.
    1. Eine 1 ml Schlupfspitzenspritze mit 0,5 ml steriler Saline zur Wundbewässerung aufladen. Befestigen Sie eine 25 G Nadel an der Spritze, um die Bewässerung zu steuern.
    2. Bereiten Sie eine verdünnte Lösung von CsA in DMSO bis zur Endkonzentration von 1 mg/ml vor. Laden Sie eine zweite 1 ml Schlupfspitzenspritze mit 0,5 ml Cyclosporin-A-Lösung (CsA) zur Immunsuppression. Befestigen Sie eine 25 G Nadel oder größer an der CsA-Spritze.
    3. Befestigen Sie den kontrollierten kortikalen Aufprallkolben an einem Arm an einem stereotaxic Rahmen und stellen Sie ihn auf einen Winkel von 15° ein. Befestigen Sie eine 3 mm Stoßsondensonde am Kolben.
    4. Stellen Sie die Aufprallgeschwindigkeit auf 1,5 m/s und die Aufprallzeit auf 0,1 s fest, um eine leichte kortikale Verletzung zu verursachen.
  2. Führen Sie eine einseitige Kraniektomie
    1. Platzieren Sie die Maus in einer Anästhesie-Induktionskammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer mit komprimierter Sauerstoffquelle verbunden ist. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 3 % Isofluran bei 0,7 l/min Sauerstoff. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf die Zehen-Pinch.
    2. Rasieren Sie die Kopfhaut mit elektrischen Clippers und wischen Sie jedes lose Fell weg.
    3. Legen Sie die Maus in einen stereotaxic Rahmen mit angeschlossenem Anästhetikum Lieferung Nase Kegel.
      1. Legen Sie ein auf 37 °C eingestelltes Wärmepad auf den stereotaxic-Rahmen unter der Maus, um die Körpertemperatur unter Anästhesie aufrechtzuerhalten. Fixieren Sie den Kopf mit Ohrstangen und einem Bissbalken an Ort und Stelle und richten Sie den Kopf so aus, dass der Schädelfrontalknochen horizontal ist. Halten Sie die Anästhesie für die Dauer der Operation bei 1,5%-2% Isofluran.
    4. Um eine präoperative Behandlung und aseptische chirurgische Vorbereitung durchzuführen, wenden Sie antibiotische ophthalmologische Salbe auf die Augen mit einem sterilen Wattestäbchen an. Wenden Sie eine jodbasierte Lösung auf die rasierte Kopfhaut an. Entfernen Sie diese mit 70% Ethanol. Bedecken Sie das Tier mit einem fenestrated chirurgischen Vorhang, so dass die Oberseite des Kopfes sichtbar ist, aber die Augen bedeckt sind.
    5. Machen Sie einen Mittellinienschnitt (1,5-2 cm) auf der Kopfhaut mit einem Skalpell oder einer Schere.  Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um die Wunde zu reinigen und die Faszien links von der Mittellinie bei Bregma zu reinigen.
    6. Verwenden Sie die Schlagsonde, um die Kraniektomie-Site zu identifizieren.
      1. Stellen Sie den stereotaxic-Referenzpunkt (X = 0, Y = 0) auf Bregma ein.  Stellen Sie die Sonde seitlich auf 2 mm links von der Mittellinie ein. Umreißen Sie einen Kreis mit einem Durchmesser von 5 mm um die Sonde mit einem chirurgisch sicheren Feinspitzenmarker. Heben und drehen Sie den Stoßkraft aus der Position.
    7. Verwenden Sie das Hochgeschwindigkeits-Drehmikromotor-Kit Handwerkzeug, um ein offenes Loch im Schädel mit einem rund-Spitzen 0,6 mm oder 0,8 mm Gratbohrer mit einer maximalen Geschwindigkeit von 70 %-80% zu machen. Wenden Sie leichten Druck auf den Schädel an, während Sie entlang der 5 mm Umfangskontur bohren, um diesen Rahmen zu verdünnen.
      1. Beim Bohren keinen Überdruck ansetzen. Dies kann zu kortikalen Verletzungen durch Vibration, Kompression oder versehentliches Eindringen führen. Lassen Sie die Geschwindigkeit des Bohrers die Arbeit erledigen.
      2. Bohren Sie nicht zu lange an einem bestimmten Ort, um eine übermäßige Reibungserwärmung des Schädels zu vermeiden. Bewässern Sie die Kraniektomie gelegentlich mit steriler Herzwäsche, um Schmutz zu entfernen und die Erwärmung aus dem Drehwerkzeug zu reduzieren.
      3. Achten Sie beim Bohren über die koronare Nahtlinie genau darauf, da diese Punkte anfällig für Blutungen sind.
    8. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Schädelklappe zu entfernen, wenn die Kraniektomie-Umrisse ausreichend ausgedünnt sind. Greifen Sie die Klappe zwischendurch, und heben und ziehen Sie seitlich mit einer radialen Bewegung.
      1. Beschädigen Sie die Dura mater beim Heben der Klappe nicht; dies kann zu schweren Verletzungen und Blutungen führen.
  3. Führen Sie eine leichte kontrollierte kortikale Schlagverletzung durch
    1. Reinigen Sie die Schlagsonde mit einem sterilen Alkohol-Prep-Pad. Bewegen Sie die Stoßsonde wieder in Position über dem freiliegenden Kortex. Senken Sie die Sonde, bis sie die Dura mater Oberfläche berührt. Markieren Sie diese Position als Z = 0.
    2. Ziehen Sie den Kolben zurück und bewegen Sie sich auf Z = -1,0 mm. Entladen Sie den Kolben, um den Kortex zu beeinflussen.
    3. Heben Sie den Kolben schnell an und bewegen Sie den Arm aus der Position. Tragen Sie großzügige Mengen an Saline auf, um den Kortex nach einer Verletzung zu bewässern. Spülen Sie die Operationsstelle nach Bedarf mit Derinline und veransäen Sie den Kopfhautschnitt mit einfachen unterbrochenen Stichen mit 5,0 Seidennaht.
  4. Postoperative Pflege an der Maus durchführen
    1. Anästhesie abbrechen. Liefern Sie CsA durch subkutane Injektion in Scruff bei 10 mg/kg Dosis. Legen Sie die Maus in einen sauberen und vorgewärmten postoperativen Käfig.
    2. Acetaminophen-Analgetikum im Trinkwasser bei 1,0 mg/ml.
      HINWEIS: Analgesie nach dem entsprechenden IACUC-Standard-Betriebsverfahren und unter Berücksichtigung experimenteller Ergebnisvariablen (z. B. Sedierung, Neuroinflammation) bereitstellen.
    3. Geben Sie befeuchtete Chow-Nahrung in einem erwärmten Erholungskäfig zur Verfügung, um bei der Rehydratation und Erholung zu helfen.
  5. Gehen Sie von Abschnitt 2 bis Abschnitt 4 oben, wenn Sie Nur-Kraniektomie-Kontrollen (Schein- und Schein-) durchführen.

2. Stereotaxie Transplantation der Zellsuspension

  1. Beginnen Sie mit der Zelltransplantation etwa 24 h nach Kraniektomie.
  2. Vorbereitung der Zelltransplantationsgeräte und chirurgischen Versorgung
    1. Füllen Sie eine 1 ml Schlupfspitzenspritze mit steriler Saline für die Wundbewässerung. Befestigen Sie eine 25 G Nadel an der Spritze, um die Bewässerung zu steuern.
    2. Füllen Sie eine 1 ml Schlupfspitzenspritze mit CsA-Lösung zur Immunsuppression. Befestigen Sie eine 25 G Nadel oder größer an der CsA-Spritze. Füllen Sie die CsA-Spritze nach Bedarf zwischen den Operationen nach.
    3. Bereiten Sie Glasnadeln aus 1,0 mm OD BorosilikatglasKapillarpipetten nach Standardmethoden vor.
    4. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Nadelspitzen auf ca. 200 m Durchmesser zu brechen. Stellen Sie sicher, dass die zylindrische Welle der Nadel nicht länger als 2,5 cm ist.
  3. Kalibrieren Sie die Spritzenpumpe für den Einsatz mit einer 10-L-Spritze.  Geben Sie eine Durchflussrate von 0,2 l/min ein, um ein Gesamtvolumen von 2,0 l zu liefern.
  4. Bereiten Sie die humaninduzierte pluripotente Stammzellsuspension (iPSC) vor.
    1. Führen Sie die gesamte Zellhandhabung in einer BSL-2-Haube mit Standard-Sterilhandhabungstechniken durch.
    2. Bereiten Sie Zellkulturen im Voraus gemäß den für den Zelltyp definierten Standardbedingungen vor. Als Beispiel siehe Lischka et al.17.
      HINWEIS: Bei den in dieser Demonstration gezeigten Experimenten wurden verschiedene neurale Phänotypzellen verwendet, die von hiPSCs abgeleitet wurden.
    3. Dissoziieren Sie die Zellen vorsichtig in eine einzellige Suspension mit einer Zellablösung oder anderen bevorzugten enzymatischen oder chemischen Mitteln.
    4. Zähle Zellen in Suspension, dann verdünne die Suspension in einem 1,7 ml Flip-Top-Reagenzglas auf 5 x 104 Zellen/L in einem Medium der minimalen Zellkultur (z. B. DMEM).
    5. Beachten Sie die folgenden Hinweise für die Transplantation:
      1. Halten Sie die Zellen in Suspension bei 37 °C für die Dauer der Verfahren.
      2. Laden Sie die Spritze erst unmittelbar vor der intraparenchymalen Injektion (Schritt 4.5 unten).
        HINWEIS: Die Schwerkraft kann dazu führen, dass sich die Zellsuspension absetzt oder sich an der Seite der Spritze festklammert, wenn sie auf ihrer Seite liegt. Dies führt zu Unregelmäßigkeiten in der Anzahl der injizierten Zellen.
      3. Allot5 x 105 Zellen (10 l Suspension) pro Maus, wenn mehrere Zelltransplantationen an einem Tag durchgeführt werden.
  5. Durchführung einer stereotaxic-Transplantationsoperation
    1. Platzieren Sie die Maus in einer Anästhesie-Induktionskammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer mit komprimierter Sauerstoffquelle verbunden ist. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 3 % Isofluran bei 0,7 l/min Sauerstoff.
    2. Legen Sie die Maus in einen stereotaxic Rahmen mit angeschlossenem Anästhetikum Nasenkegel.
      1. Fixieren Sie den Kopf mit Ohrstangen und einem Bissbalken an Ort und Stelle und richten Sie den Kopf so aus, dass der Schädelfrontalknochen horizontal ist. Halten Sie die Anästhesie für die Dauer der Operation bei 1,5%-2% Isofluran.
    3. Präoperative Pflege und aseptische Vorbereitung durchführen
      1. Mit einem Wattestäbchen hydratisierende ophthalmologische Salbe mit Antibiotikum auf die Augen auftragen.
      2. Die Einschnittstelle mit steriler Saline verfälschen, um die Stelle zu reinigen und Nähte zu lockern. 70% Ethanol vorsichtig mit einem Wattestäbchen auftragen, um die Einschnittstelle zu sterilisieren.
    4. Entfernen Sie Nähte mit feiner Pinzette und Augenschere. Bewässerung Chirurgie Website und Kraniektomie mit reichlich steriler Saline.
      1. Betrachten Sie das Tier für den Ausschluss, wenn der Kortex disqualifizierende Eigenschaften wie übermäßige Herniation, Verfärbung, gestörte Vaskularisation oder Blutungen aufweist.
    5. Laden Sie die Zelltransplantationsspritze
      1. Verschieben Sie die Zellsuspension vom 37 °C-Inkubator in eine Zellkultur-Biosicherheitshaube. Wirbeln oder tippen Sie vorsichtig auf das Rohr, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten.
      2. Verwenden Sie einen Mikropipettor, um die Zellsuspension von 7,5 L durch das Kolbenende in die Hamilton-Spritze zu laden.
        1. Halten Sie die Spritze in einem Winkel von 120° mit dem Kolbenende nach unten. Setzen Sie den Kolben ein, wobei Darauf zu achten ist, dass keine Luftblase zwischen Federung und Kolbenspitze eingeführt wird.
      3. Befestigen Sie die Dichtungseinheit an der Pipettennadel, und befestigen Sie die Nadel an der Spritze.
      4. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Pipettennadel zu bewegen.  Wenn es Widerstand gegen Suspensionsabfluss gibt, verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Nadelspitze zu brechen, um den Durchmesser zu vergrößern.
    6. Befestigen Sie die Spritze an der stereotaxic Spritzenpumpe.  Treten Sie vor, um sicherzustellen, dass die Spritzenpumpenbaugruppe ordnungsgemäß funktioniert.
    7. Bewegen Sie die Nadel in die Koordinaten für die Injektion.
      1. Richten Sie die Nadelspitze auf Bregma aus. Legen Sie die X- und Y-Koordinaten auf 0 fest. Dann bewegen Sie die Nadelspitze über die Kraniektomie auf 2,0 mm seitlich und -1,0 mm nachträchchder Bregma.  Berühren Sie die Nadelspitze auf die Dura-Mater-Oberfläche und stellen Sie die stereotaxic-Koordinate auf Z = 0 ein.
      2. Drücken Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension ausreichend fließt, bevor Sie die Nadel in das Gehirn einführen.
      3. Führen Sie die Nadel in eine Tiefe von Z = -1,4 mm in das Gehirn ein. Diese stereotaxic Koordinaten platzieren das Transplantat an der grauen materie-weißen Materiegrenze des tiefen Kortex20.
    8. Starten Sie die Spritzenpumpe, um die Zellsuspension zu infundieren. Stellen Sie den Labortisch-Timer auf 15 min und starten Sie den Timer. Verwenden Sie ein Mikroskop mit langer Arbeitsdistanz, um den Abfluss der Zellsuspension zu überwachen.
      1. Bewässern Sie die Operationsstelle während der Injektion mit steriler Saline, um die Gewebefeuchte aufrechtzuerhalten.
      2. Nach 15 min ziehen Sie die Transplantationsnadel langsam zurück.  Bewässern Sie die Operationsstelle mit Deraline und schließen Sie den Schnitt mit Nähten.
    9. Postoperative Pflege durchführen
      1. Anästhesie abbrechen. Liefern Sie CsA durch subkutane Injektion in Scruff bei 10 mg/kg Dosis. Legen Sie die Maus in einen sauberen und vorgewärmten postoperativen Käfig.
      2. Acetaminophen-Analgetikum im Trinkwasser bei 1,0 mg/ml.
        HINWEIS: Analgesie gemäß dem entsprechenden IACUC-Standard-Betriebsprotokoll (SOP) und unter Berücksichtigung experimenteller Ergebnisvariablen bereitstellen.
      3. Geben Sie befeuchteten Chow-Futter-Recovery-Käfig, um bei der Rehydrierung und Erholung zu helfen.
  6. Setzen Sie die täglichen CsA-Injektionen bei 10 mg/kg während der gesamten Überlebensdauer der Maus fort.

3. Klebebandentfernungstest der sensorimotorischen Integration

  1. Schneiden Sie das elektrische Band mit einem kleinen Rasiermesser in 3 mm x 5 mm Streifen, bevor Sie den Verhaltenstest durchführen. Verwenden Sie eine glatte Glasoberfläche zum Schneiden der Klebestreifen.
    HINWEIS: Verwenden Sie gelb und bürokratisch, da Mäuse Schwierigkeiten haben, zwischen diesen Farben zu unterscheiden21.
    1. Wählen Sie einen kleinen Spiegel, der gut in die durchsichtigen Kunststoffbox passt.
      1. Befestigen Sie den Spiegel in einem etwa 45°-Winkel mit Modellierton oder Klebeband, um das Verhalten der Tiere von unten zu betrachten.
    2. Legen Sie die Box und die Spiegelbaugruppe auf eine Bank in einem ruhigen, dedizierten Verhaltensprüfraum.  Ordnen Sie den Zylinder auf der Kunststoffbox über dem Spiegel an.
    3. Ordnen Sie das Handhabungstuch, die Pinzette und die Klebestreifen auf der Bank neben der Verhaltensprüfbox an.
    4. Reinigen Sie die Box und den Zylinder mit 70% Ethanol und Papiertüchern.  Oberflächen gründlich trocknen lassen.
    5. Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum. Lassen Sie die Mäuse sich vor verhaltenstests mindestens 30 min im Testraum anklimatisieren.
    6. Entfernen Sie die Wasservorräte aus den Käfigen, um das Wasserlassen während der Tests zu minimieren, was die effiziente Testleistung beeinträchtigen kann.
  2. Führen Sie den Klebstoffentfernungstest durch
    HINWEIS: Dieser Verhaltenstest wird am besten von zwei bis drei Prüfern durchgeführt: einer, um die Stoppuhren zu bedienen, und ein oder zwei, um die Mäuse zu behandeln und das Verhalten zu beobachten.
    1. Verwenden Sie jede Pinzette, um einen Klebestreifen jeder Farbe zu schälen.
      1. Wählen Sie aus, welcher Streifenfarbe welcher Vorderpaw entspricht, und bleiben Sie während der gesamten Testversion konsistent.
    2. Verwenden Sie das Handhabungstuch, um eine Maus durch die Schürfwunden des Halses und des Rückens so zu halten, dass die Maus die Vorderpfoten von ihrem Körper und Kopf fernhält.
    3. Verwenden Sie pinnzette, um einen Klebestreifen auf die Plantaroberfläche jedes Vorpaw sanden. Verwenden Sie einen empfindlichen und konsistenten Fingerdruck, um die Streifen an den Pfoten zu befestigung.
    4. Legen Sie die Maus schnell in den Kunststoffzylinder. Starten Sie die beiden Stoppuhren, wenn die Maus alle vier Pfoten auf der Kunststoffbox hat.
    5. Verwenden Sie die beiden Stoppuhren, um die Latenzen für die folgenden vier Ereignisse aufzuzeichnen: linke Pfotenanzeige, linke Pfotenentfernung, rechte Pfotenanzeige, rechte Pfotenentfernung.
      1. Zeichnen Sie ein Benachrichtigungsereignis auf, wenn das Tier den Klebestreifen eindeutig erkennt, indem es die Pfote schüttelt oder zuckt oder den Streifen beißt.
      2. Zeichnen Sie ein Entfernungsereignis auf, wenn das Tier den Streifen effektiv von der Vorpaw-Pflanzoberfläche entfernt.
        HINWEIS: Das Entfernungsereignis wird nicht durch Streifenhaftung disqualifiziert oder wenn der Streifen an der seitlichen Oberfläche des Vorderpfotens klammert.
      3. Stoppen Sie den Timer bei 120 s, wenn der entsprechende Streifen nicht entfernt wurde.
      4. Zeichnen Sie die verstrichenen Zeiten für die vier Ereignisse auf dem Datenblatt auf.
    6. Führen Sie eine zweite Testversion für jede Maus durch
      1. Lassen Sie zwischen den Versuchen für eine einzelne Maus mindestens 5 min vergehen, um Stress abzubauen, was die effiziente Leistung des Tests beeinträchtigen kann.
      2. Reinigen Sie das Gerät mit Papiertüchern zwischen den Testmäusen, um Abfälle zu entfernen, wenn mehrere Mäuse aus einem einzigen Käfig getestet werden.
        1. Reinigen Sie das Gerät gründlich mit 70% Ethanol und Papiertüchern, wenn Mäuse aus mehreren Käfigen getestet werden.
      3. Umkehren Sie die Farbpfotenplatzierungsreihenfolge für die zweite Testversion der Sitzung, um jeden Effekt der Farbe zu randomisieren.
    7. Berechnen Sie die durchschnittliche Latenz jedes Ereignisses zwischen zwei Studien pro tagessitzung für jedes Tier.
  3. Reinigen Sie das Gerät und behandeln Sie das Tuch gründlich mit Wasser, ersetzen Sie die Käfigwasserversorgung und bringen Sie die Mäuse in ihre Haltungseinrichtung zurück.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.2 auf aufeinanderfolgenden Versuchszeitpunkten für ein Versuchsdesign mit wiederholten Messungen.
    HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.5.3 täglich für 5 Tage vor jeder Datenerhebung, um die Tiere an die Aufgabe zu akklimatisieren. Die Baseline-Datenerfassung vor der Operation wird empfohlen.

4. Diaminobenzidin (DAB) immunhistochemische Analyse des Transplantatüberlebens und der Verletzungspathologie

  1. Euthanisieren Sie die Tiere und führen Sie eine transkardiale Perfusion durch.
    1. Bereiten Sie Lösungen von 0,1 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS vor. Den pH-Wert beider Lösungen auf 7,4 ausgleichen.
    2. Legen Sie die beiden Lösungen auf Eis in einer Dunstabzugshaube. Legen Sie eine peristaltische Pumpe in die Dunstabzugshaube und führen Sie die Pumpe aus, um die Schläuche mit PBS zu füllen. Stellen Sie den Pumpendurchfluss auf 7 ml/min ein.  Schließen Sie eine 25 G Nadel an das Abflussrohr der Pumpe an.
    3. Legen Sie eine Drainagewanne mit einem weichen Substrat in die Haube. Heben Sie ein Ende der Schale in einem leichten Winkel an, so dass Perfusionsflüssigkeiten an das untere Ende abfließen.
    4. Legen Sie eine Maus in eine Anästhesie-Induktionskammer. Füllen Sie die Kammer mit 4% Isofluran mit komprimiertem 100% Sauerstoff-Fahrzeuggas.
    5. Bewegen Sie die anästhesierte Maus aus der Kammer zu einem Anästhesie Nasenkegel. Verringern Sie das Isofluran auf 2%.
    6. Führen Sie eine Thorakotomie durch, um das Herz zu entblößen. Beenden Sie die Anästhesie, da die Thorakotomie Euthanasie verursacht.
    7. Legen Sie die Perfusionspumpe-Abflussnadel vorsichtig in den linken Ventrikel entlang der langen Herzachse. Durchbohren Sie nicht das Herzseptum, da dies eine schlechte Durchblutung verursachen wird.
    8. Verwenden Sie eine kleine Schere, um das rechte Atrium zu schneiden, dann schalten Sie sofort die peristaltische Pumpe ein.
    9. Setzen Sie den PBS-Fluss fort, bis die Flüssigkeit, die das rechte Atrium verlässt, blutfrei läuft.
      1. Schalten Sie die Pumpe aus. Bewegen Sie das Pumpeneinsaugrohr in den Behälter von PFA. Starten Sie die Pumpe neu. Setzen Sie die Durchblutung von PFA fort, bis entweder das Tier ausreichend starr ist oder bis ein Volumen von 20 ml durchgepumpt wurde.
      2. Schalten Sie die Pumpe aus. Entfernen Sie die Auslaufnadel aus dem Herzen. Bewegen Sie das Ansaugrohr vom PFA zum PBS, und spülen Sie PFA gründlich aus den Schläuchen.
  2. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch sorgfältige Zerlegung. Legen Sie das Gehirn in einen kleinen Behälter gefüllt mit 4% Paraformaldehyd, und lassen Sie das Gehirn über Nacht bei 4 °C nachzubeheben.
  3. Ersetzen Sie am Tag nach der Fixierung das P durch PBS und 0,1% Natriumazid. Bewahren Sie das Gehirn in dieser Lösung bis zur Vorbereitung auf histologische Abschnitte auf.
  4. Sammeln Sie 40-50 m Abschnitte von Formaldehyd-fixiertem Hirngewebe über ein gefrierendes Mikrotom oder Raumtemperaturvibratom.
  5. Gewebe in 0,3% Wasserstoffperoxid in Wasser zur Inaktivierung endogener Peroxidasen, die unspezifische Färbungen erzeugen können.
  6. Antigenabruf mit Zitronensäurepuffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Polysorbat-20, pH 6,0) bei 60 °C für 30 min durchführen.
  7. Führen Sie die Antikörperkennzeichnung nach Standardmethoden durch.  Siehe Lundell et al.' s Bericht22 aus diesem Labor für weitere Details.
    1. Verwenden Sie ein IgG-Neutralisationskit für die Maus (siehe Materialtabelle), um die Kreuzreaktivität mit endogenen Antikörpern zu reduzieren. Inkubieren Sie die Gewebe im IgG-Neutralisationspuffer mindestens 1 h bei Raumtemperatur (RT) und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    2. Verwenden Sie einen Maus-Antihuman-Kernantigen-Primärantikörper (hNA; 1:500 Verdünnung) bei der Transplantation menschlicher iPSC-abgeleiteter Zellen, um die transplantierten Zellen zu lokalisieren. Inkubieren Sie Gewebe mit dem primären Antikörper bei 4 °C für 48-72 h unter sanfter Rührung.
    3. Nach dem Spülen der primären Antikörperlösung Gewebe mit HRP-konjugiertem Anti-Maus-Sekundärantikörper bei 1:250 Verdünnung für 2 h bei RT inkubieren.
    4. Führen Sie die DAB-Chromogenreaktion mit Standardmethoden durch, um eine Immunkennzeichnung zu zeigen. Lassen Sie die DAB-Reaktion für 5 bis 10 min bei RT entwickeln.
  8. Beflecktes Gewebe an Dias anbringen und Mitdeckzettel mit Standardmethoden auftragen.
  9. Quantifizieren Sie die Anzahl der markierten Zellen unter Verwendung der unvoreingenommenen Stereologie, wie zuvor beschrieben23,24. Führen Sie die Analyse mit optischen Abschnitten von 20 m und einem Schnittintervall von drei nm durch.

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Ergebnisse

Die Craniectomie-Chirurgie erleichtert experimentelle Hirnverletzungen und therapeutische Zelltransplantationen: Das kontrollierte kortikale Wirkungsmodell der Hirnverletzung und die anschließende Zelltransplantationstherapie erfordern eine sorgfältige Entfernung des darüber liegenden Schädels. Die Kraniektomie kann auf jeder dorsalen Oberfläche des Schädels durchgeführt werden, um Manipulationen an der Hirnregion von Interesse zu ermöglichen. Das Diagramm in Abbildung 1 zei...

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Diskussion

Mildes CCI als Modellsystem zur Erprobung experimenteller regenerativer Therapie
Das CCI-Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Mechanismen der Gewebefunktionsstörung nach mechanischen Verletzungen des Kortex. Die Abstimmbarkeit der Verletzungsparameter ist ein attraktives Merkmal dieses Modells. Die Änderung der Z-Tiefe des Aufpralls, der Geschwindigkeit oder der Verweilzeit kann die Schwere der Verletzung erhöhen oder verringern, wie vom Prüfer gewünscht10

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Zentrums für Neurowissenschaften und Regenerative Medizin (CNRM, Fördernummer G170244014) unterstützt. Wir schätzen die Unterstützung von Mahima Dewan und Clara Selbrede bei Pilotstudien zur Klebeentfernung. Kryslaine Radomski führte vorläufige Hirnverletzungen und Zelltransplantationen durch. Amanda Fu und Laura Tucker vom USU CNRM Preclinical Studies Core Laboratory gaben wertvolle Ratschläge zu Tieroperationen bzw. Verhaltenstests.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 ml SpritzenBecton Dickinson (BD) 
1,7 ml Flip-Top-ReagenzgläserDenvilleC2170
10 Mikroliter SpritzeHamilton7635-01
25G Precision Glide SpritzennadelnBecton Dickinson (BD)
70% EthanolProdukt nach Wahl; variiert je nach Region
Paracetamol Suspension zum EinnehmenTylenol (Kinder)In Wasser verdünnen auf 1 mg/ml
Anästhesieverdampfer Vetland521-11-22
TuchIm Kaufhaus
kaufen BetadinePurdue ProdukteNDC-67618-151-32
komprimierter SauerstoffProdukt der Wahl; variiert je nach Region
Cyclosporin ASigma-Aldrich30024-100mg
DAB-FärbekitVector LaboratoriesSK-4100
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD8418-500ml
DMEMInvitrogen (ThermoFisher)A14430-01
Esel-Anti-Maus-IgG-Antikörper, HRP-konjugiertJackson ImmunoResearch715-035-151
Isolierband3M CorporationKauf im Kaufhaus
feine PinzetteFine Science Tools11254-20
PinzetteFine Science Tools91106-12
Kapillarpipetten aus Glas, 1 mm OD, 0,58 mm IDWorld Precision Instruments1B100F-3
Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-KitForedom Electric Co. K.1070 - K.107018
Idealer Mikrobohrfräser Satz mit 5Cell Point Wissenschaftlich60-1000
Impact One Stereotaktischer Impaktor für CCILeica Biosystems39463920
IsofluranBaxterNDC-10019-360-60
Labor-TimerFisher Scientific14-649-17
MikropipettenabzieherMicroData Instruments, Inc.PMP-102Jeder Abzieher reicht aus
Mikroskop-DeckgläserFisherbrand12-545-E
Mikroskop-Objektträger-MontagemediumProdukt der Wahl
SpiegelKauf im Kaufhaus
Maus Anti-Human-Kernantigen-AntikörperMilliporeMAB1281
Maus auf Maus BlockierungskitVektor LaboratorienBMK-2202
Nadelhalter hämostatischFine Science Tools12002-12
AugensalbeFalcon PharmaceuticalsNDC-61314-631-36
ophthalmische FederschereFine Science Tools15018-10
KunststoffboxKauf im
Kaufhaus KunststoffzylinderKauf im Kaufhaus
QSI motorisierte SpritzenpumpeStoelting53311
Abnehmbare Nadel-KlemmverschraubungHamilton55750-01
kleiner stereotaktischer Rahmen für NagetiereStoelting51925
kleine SchereFine Science Tools14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)
Sterile Alkohol-VorbereitungspadsFisherbrand06-669-62
sterile Wattestäbchen/Kendall WattestäbchenTyco Healthcare540500
Sterile KochsalzlösungHospiraNDC-0409-1966-07
Stoppuhren (2)Fisher Scientific06-662-56
Superfrost Plus Gold ObjektträgerFisherbrand15-188-48
Nähte - 5.0 Seide mit gebogener NadelOasisMV-682
309659305122 für den Umgang mit Tieren A1110501

Referenzen

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