Dieses Protokoll zeigt Methoden für ein Mausmodell der traumatischen Hirnverletzung mit offenem Schädel und die Transplantation kultivierter, humaninduzierter pluripotenter Stammzellen-abgeleiteter Zellen in die Verletzungsstelle. Verhaltens- und histologische Tests der Ergebnisse dieser Verfahren werden ebenfalls kurz beschrieben.
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Methodenartikel
Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Krankheitspathologie aufgrund von TBI entwickelt sich von der primären mechanischen Beleidigung zu sekundären Verletzungsprozessen, einschließlich Apoptose und Entzündung. Tiermodellierung war wertvoll bei der Suche nach Verletzungsmechanismen und Bewertung potenzieller neuroprotektive Therapien. Dieses Protokoll beschreibt das Modell der kontrollierten kortikalen Wirkung (KII) des fokalen, offenen TBI. Insbesondere werden Parameter für die Herstellung einer leichten einseitigen kortikalen Verletzung beschrieben. Die Verhaltensfolgen von CCI werden mit dem Klebebandentfernungstest der bilateralen sensorimotorischen Integration analysiert. In Bezug auf die experimentelle Therapie für TBI-Pathologie, dieses Protokoll zeigt auch einen Prozess für die Transplantation kultivierter Zellen in das Gehirn. Neuronale Zellkulturen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen wurden, wurden aufgrund ihres Potenzials ausgewählt, eine überlegene funktionelle Wiederherstellung bei menschlichen TBI-Patienten zu zeigen. Chronisches Überleben von HiPSCs im Hirngewebe der Wirtsmaus wird mit einem modifizierten DAB-Immunhistochemischen Prozess nachgewiesen.
Einleitung
Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein allgemeiner Begriff für die erworbene Schädigung des Gehirns aufgrund von indirekten mechanischen Kräften (Rotationsbeschleunigung/Verzögerung oder Gegenputsch) durch Schläge auf den Kopf oder direkte Schäden durch Objekte oder Explosionswellen. TBI ist schätzungsweise die Ursache von etwa 9 % der weltweiten Todesfälle undwurde in schätzungsweise 50 Millionen Fällen pro Jahr 1,2beobachtet. Ein Bericht der Centers for Disease Control and Prevention aus dem Jahr 2017 schätzte, dass es im Jahr 2013 insgesamt 2,8 Millionen Krankenhausbesuche und Todesfälle aufgrund von ....
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Protokoll
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden vom Uniformed Services University Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt.
1. Kraniektomie und kontrollierte kortikale Wirkung
- Vorbereitung des kontrollierten kortikalen Aufprallgeräts und der chirurgischen Versorgung.
- Eine 1 ml Schlupfspitzenspritze mit 0,5 ml steriler Saline zur Wundbewässerung aufladen. Befestigen Sie eine 25 G Nadel an der Spritze, um die Bewässerung zu steuern.
- Bereiten Sie eine verdünnte Lösung von CsA in DMSO bis zur Endkonzentration von 1 mg/ml vor. Laden Sie eine zweite 1 ml Schlupfspitzenspritze mit 0,5 ml Cyclospo....
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Ergebnisse
Die Craniectomie-Chirurgie erleichtert experimentelle Hirnverletzungen und therapeutische Zelltransplantationen: Das kontrollierte kortikale Wirkungsmodell der Hirnverletzung und die anschließende Zelltransplantationstherapie erfordern eine sorgfältige Entfernung des darüber liegenden Schädels. Die Kraniektomie kann auf jeder dorsalen Oberfläche des Schädels durchgeführt werden, um Manipulationen an der Hirnregion von Interesse zu ermöglichen. Das Diagramm in Abbildung 1 zei.......
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Diskussion
Mildes CCI als Modellsystem zur Erprobung experimenteller regenerativer Therapie
Das CCI-Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Mechanismen der Gewebefunktionsstörung nach mechanischen Verletzungen des Kortex. Die Abstimmbarkeit der Verletzungsparameter ist ein attraktives Merkmal dieses Modells. Die Änderung der Z-Tiefe des Aufpralls, der Geschwindigkeit oder der Verweilzeit kann die Schwere der Verletzung erhöhen oder verringern, wie vom Prüfer gewünscht10
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Zentrums für Neurowissenschaften und Regenerative Medizin (CNRM, Fördernummer G170244014) unterstützt. Wir schätzen die Unterstützung von Mahima Dewan und Clara Selbrede bei Pilotstudien zur Klebeentfernung. Kryslaine Radomski führte vorläufige Hirnverletzungen und Zelltransplantationen durch. Amanda Fu und Laura Tucker vom USU CNRM Preclinical Studies Core Laboratory gaben wertvolle Ratschläge zu Tieroperationen bzw. Verhaltenstests.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 ml Spritzen | Becton Dickinson (BD) | ||
| 1,7 ml Flip-Top-Reagenzgläser | Denville | C2170 | |
| 10 Mikroliter Spritze | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide Spritzennadeln | Becton Dickinson (BD) | ||
| 70% Ethanol | Produkt nach Wahl; variiert je nach Region | ||
| Paracetamol Suspension zum Einnehmen | Tylenol (Kinder) | In Wasser verdünnen auf 1 mg/ml | |
| Anästhesieverdampfer Vetland | 521-11-22 | ||
| Tuch | Im Kaufhaus | ||
| kaufen Betadine | Purdue Produkte | NDC-67618-151-32 | |
| komprimierter Sauerstoff | Produkt der Wahl; variiert je nach Region | ||
| Cyclosporin A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB-Färbekit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| Esel-Anti-Maus-IgG-Antikörper, HRP-konjugiert | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| Isolierband | 3M Corporation | Kauf im Kaufhaus | |
| feine Pinzette | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Pinzette | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Kapillarpipetten aus Glas, 1 mm OD, 0,58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Idealer Mikrobohrfräser Satz mit 5 | Cell Point Wissenschaftlich | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaktischer Impaktor für CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| Isofluran | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Labor-Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Mikropipettenabzieher | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Jeder Abzieher reicht aus |
| Mikroskop-Deckgläser | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Mikroskop-Objektträger-Montagemedium | Produkt der Wahl | ||
| Spiegel | Kauf im Kaufhaus | ||
| Maus Anti-Human-Kernantigen-Antikörper | Millipore | MAB1281 | |
| Maus auf Maus Blockierungskit | Vektor Laboratorien | BMK-2202 | |
| Nadelhalter hämostatisch | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Augensalbe | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmische Federschere | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Kunststoffbox | Kauf im | ||
| Kaufhaus Kunststoffzylinder | Kauf im Kaufhaus | ||
| QSI motorisierte Spritzenpumpe | Stoelting | 53311 | |
| Abnehmbare Nadel-Klemmverschraubung | Hamilton | 55750-01 | |
| kleiner stereotaktischer Rahmen für Nagetiere | Stoelting | 51925 | |
| kleine Schere | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | ||
| Sterile Alkohol-Vorbereitungspads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile Wattestäbchen/Kendall Wattestäbchen | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile Kochsalzlösung | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stoppuhren (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold Objektträger | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| Nähte - 5.0 Seide mit gebogener Nadel | Oasis | MV-682 |
Referenzen
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
