Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

7.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/59580

⸱

23. August 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden. hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Zusammenfassung

Die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und Zellen ist ideal für die Untersuchung biologischer und physiologischer Prozesse wie der Regenerationsprozess des Skelettmuskels. Es gibt anerkannte Herausforderungen bei der Arbeit mit menschlichen primären adulten Stammzellen, insbesondere menschlichen Muskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsien abgeleitet sind, einschließlich geringer Zellausbeute aus gesammeltem Gewebe und einem hohen Grad an Spenderheterogenität Wachstums- und Todesparameter zwischen den Kulturen. Während die Integration von Heterogenität in experimentelles Design eine größere Stichprobengröße erfordert, um signifikante Effekte zu erkennen, ermöglicht es uns auch, Mechanismen zu identifizieren, die der Variabilität der hMPC-Erweiterungskapazität zugrunde liegen, und ermöglicht es uns, die Sbeinen-Erweiterungskapazität besser zu verstehen. Heterogenität in der Skelettmuskelregeneration. Neuartige Mechanismen, die die Expansionsfähigkeit von Kulturen unterscheiden, haben das Potenzial, zur Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Regeneration der Skelettmuskulatur zu führen.

Einleitung

Skelettmuskel ist das größte Organsystem im menschlichen Körper, macht 30 bis 40% der ganzen Körpermasse1. Neben seiner anerkannten Rolle in der Fortbewegung, Skelettmuskel hält Körpertemperatur und Körperhaltung, und spielt eine zentrale Rolle in ganzkörperlichen Nährstoff Homöostase. Die Forschung unter Beteiligung menschlicher Teilnehmer, Tiere und Zellkulturmodelle ist wertvoll, um Fragen der Skelettmuskelbiologie und Regeneration zu beantworten. Isolation und Kultur der menschlichen Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs) bietet ein robustes Modell, das es ermöglicht, Zellkulturtechniken und Manipulationen auf menschliche Proben anzuwenden. Ein Vorteil der Verwendung von hMPCs ist, dass sie den genetischen und metabolischen Phänotyp von jedem Spender behalten2,3. Die Aufrechterhaltung des Spenderphänotyps ermöglicht es forschern, interindividuelle Variationen im myogenen Prozess zu untersuchen. Zum Beispiel haben wir unsere hMPC-Charakterisierungsmethode eingesetzt, um alters- und geschlechtsbedingte Unterschiede in der hMPC-Populationsexpansionskapazität4zu identifizieren.

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Techniken zur Isolierung, Kultur, Charakterisierung und Unterscheidung von hMPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe zu beschreiben. Aufbauend auf früheren Arbeiten, die hMPCs beschrieben und potenzielle Zelloberflächenhersteller für die hMPC-Isolierung5,6identifiziert haben, schließt dieses Protokoll eine kritische Wissenslücke, indem es die Isolation mit der Charakterisierung von hMPCs verknüpft. Darüber hinaus machen die detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitungen in diesem Protokoll die hMPC-Isolierung und -Charakterisierung einem breiten wissenschaftlichen Publikum zugänglich, einschließlich derjenigen mit begrenzter Vorerfahrung mit hMPCs. Unser Protokoll gehört zu den ersten, die die Verwendung eines bildgebenden Zytometers zur Verfolgung von Zellpopulationen beschreiben. Neu entwickelte bildgebende Zytometer sind modernste, hochdurchsatz- und mikroplattenbasierte, die live zellbildende, Zellzählung und Mehrkanalfluoreszenzanalyse aller Zellen in jedem Brunnen eines Kulturgefäßes innerhalb von Minuten ermöglichen. Dieses System ermöglicht eine schnelle Quantifizierung dynamischer Veränderungen der Proliferation und Lebensfähigkeit einer gesamten Zellpopulation mit nur minimalen Unterbrechungen der Kultur. Beispielsweise sind wir in der Lage, objektive Maßnahmen des Zusammenflusses an aufeinanderfolgenden Tagen in vitro durchzuführen, um die Wachstumskinetik jeder Kultur zu bestimmen, die von verschiedenen Spendern abgeleitet wurde. Viele Protokolle in der Literatur, insbesondere solche, die die Differenzierung von MFC beinhalten, erfordern, dass Zellen ein definiertes Maß an Zusammenfluss erreichen, bevor sie Differenzierung oder Behandlung einführen7. Unsere Methode ermöglicht eine objektive Bestimmung des Zusammenflusses jedes Brunnens in einem Kulturgefäß, so dass Forscher eine unvoreingenommene, nicht-subjektive Behandlung initiieren können.

In der Vergangenheit war eine wesentliche Einschränkung der Verwendung von primären hMPCs niedrige Erträge, die die Anzahl der Zellen begrenzen, die für Experimente verfügbar sind. Wir und andere haben gezeigt, dass die Ausbeute von MPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe 1-15 MPCs pro Milligramm Gewebe beträgt (Abbildung 1)8. Da unser Protokoll vier Passagen der Zellen vor der Reinigung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zulässt, reichen unsere kryokonservierten hMPC-Erträge, die aus kleinen Mengen Biopsiegewebe (50 bis 100 mg) gewonnen werden, aus, um Forschungsziele zu erreichen, mehrere Experimente sind erforderlich. Unser FACS-Protokoll erzeugt eine reine (Pax7-positive) MPC-Population von 80 %, daher ist unser Protokoll sowohl für die Ausbeute als auch für die Reinheit optimiert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Review Board der Cornell University genehmigt. Alle Teilnehmer wurden auf die zugrunde liegenden gesundheitlichen Bedingungen untersucht und gaben ihre Einwilligung in Kenntnis der Sachlage ab.

1. Beschaffung von menschlichem Muskelgewebe über die Skelettmuskelbiopsie

  1. Identifizieren Sie den Vastus lateralis Muskel durch Palpation, anatomische Landmarken und aktive Kontraktion des Muskels.
  2. Palpate die vastus lateralis, indem der Teilnehmer ihre Quadrizeps-Muskel straffen und den Bauch des Muskels zu finden, etwa 1/3 des Weges von der Patella zur Hüfte, und nur ventrolateral zum Oberschenkelknochen.
  3. Verwenden Sie ein Papier-Messband, um einen Bereich mit einem chirurgischen Marker etwa 4-6 Zoll von der Oberseite der Patella zu markieren, die den Bauch des Muskels darstellt.
  4. Rasieren Sie alle Haare in der Nähe des markierten Bereichs und reinigen Sie dann mit einem chirurgischen Grad Antiseptikum, das vor medizinischen Verfahren verwendet wird (zum Beispiel: 2% Chlorhexidingluconat (CHG)/ 70% Isopropylalkohol (IPA)) .
  5. Anästhesisieren Sie die Biopsiestelle mit 1% Lidocain.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Injektion des Lidocains in den Skelettmuskel.
  6. Machen Sie einen 4 x 5 mm Schnittweg an der markierten Stelle.
  7. Nachdem der Bereich anästhesisiert ist, schieben Sie eine Bergstrom-Nadel mit Trokar durch die Faszie in den Bauch des Muskels (ca. 2 x 3 cm).
  8. Ziehen Sie Muskelgewebe in die Bergstrom-Nadel, indem Sie den Schneidtrokar 2 x 3 cm zurückziehen, während ein Assistent Saugkraft anwendet, indem Er einen angeschlossenen 60 ml Spritzenkolben zurückzieht.
  9. Schließen Sie die Schneidkammer.
  10. Drehen Sie die Basis der Biopsienadel um eine Vierteldrehung und wiederholen Sie die Reihenfolge des Öffnens der Nadel, des Aufbringens von Absaugung und des Schließens der Nadel.
    HINWEIS: Jedes Mal, wenn die Nadel geschlossen wird, sollte ein Schnitt von Muskelgewebe innerhalb der Bergstrom-Nadel erhalten werden. Während der Probenentnahme bleibt die Nadel in der gleichen vertikalen Position im Oberschenkel, während sie längs um 360° gedreht wird, um jede Probe zu erhalten. Diese Sequenz kann 3-4 mal wiederholt werden.
  11. Vertreiben Sie das gesammelte Biopsiegewebe aus der Nadel in ein steriles, nicht haftenhaftes Dressingpad.
  12. Untersuchen Sie das Gewebe und entfernen Sie sichtbare Fett- und Fibrotische Gewebe mit sterilen Skalpellklingen oder Pinzetten.
  13. Legen Sie eine Portion (50-100 mg) Gewebein eine sterile Röhre, die CO2-unabhängiges Nährmedium enthält (z. B. Hibernate A).
    HINWEIS: Das Gewicht des Gewebes wird wie folgt bestimmt. Zuerst platzen die gekappte Röhre mit dem Nährmedium auf einer Skala und Tare. Als nächstes legen Sie das Gewebe in die Röhre, rekapitulieren Sie die Röhre, und wiegen Sie dann die Röhre, die das Gewebe im Nährmedium enthält.
  14. Bewahren Sie das Rohr, das das Gewebe und das Nährmedium enthält, bis zur Verarbeitung bei 4 °C aufbewahren.
    HINWEIS: Biopsiegewebe sollte innerhalb von 48 h nach der Entnahme verarbeitet werden.

2. Isolierung menschlicher Muskelvorläuferzellen aus Biopsiegewebe

  1. Mince BiopsieGewebe.
    1. Übertragen Sie das Muskelgewebe aus dem Nährmedium in eine sterile Petrischale in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einem ähnlichen sterilen Arbeitsplatz.
    2. Verwenden Sie sterile Skalpellklingen, um Gewebe in 1 mm3 Stück zu zerkleinern.
  2. Waschen Sie gehacktes Biopsiegewebe, um Restmüll zu entfernen.
    1. Übertragen Sie das Muskelgewebe in ein 15 ml konisches Rohr mit 10 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und lassen Sie das Gewebe über die Schwerkraft absetzen.
    2. Aspirieren Sie den Überstand darauf zu achten, das Muskelgewebe nicht zu stören.
    3. Fügen Sie dem gewaschenen Gewebe 10 ml PBS hinzu und lassen Sie das Muskelgewebe über die Schwerkraft umsiedeln.
    4. Aspirieren Sie den Überstand darauf zu achten, das Muskelgewebe nicht zu stören.
    5. Fügen Sie 10 ml glukosearmes Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) hinzu und lassen Sie das Gewebe über die Schwerkraft neu ansiedeln.
    6. Aspirieren Sie den Überstand darauf zu achten, das Muskelgewebe nicht zu stören.
  3. Inkubieren Sie das Gewebe in Verdauungsmedien.
    1. Resuspend das Muskelgewebe in 3 ml Verdauungsmedien (2 mg/ml Kollagenase D bei niedrigem Glukose-DMEM).
      HINWEIS: Kollagenase D-Stammlösungen können mit 20 mg/ml in glukosearmem DMEM hergestellt und bei -80 °C gelagert und dann zum Zeitpunkt der Anwendung 1:10 in glukosearmem DMEM verdünnt werden.
    2. Inkubieren Sie das Rohr, das das Muskelgewebe enthält, in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 min.
    3. Trituieren Sie die Muskelgewebesuspension alle 10 min mit einer 10 ml serologischen Pipette oder einer breiten Bohrungspipette.
    4. Fügen Sie 83 l zusätzliche Verdauungsmedien und 24 l Dispaselösung (0,76 mM Calciumacetat, 1,39 mM Natriumacetat, 13,91 mg/ml Dispase II in glukoseniedrigem DMEM) hinzu. Bringen Sie die Suspension in das 37 °C Wasserbad zurück.
    5. Trituieren Sie die Muskelgewebesuspension alle 5 x 10 min mit einer breiten Bohrung Pipettenspitze.
    6. Fortsetzen Sie die Trituration, bis eine gleichmäßige Gülle erreicht ist, und nicht länger als 1,5 h, um eine Überverdauung zu verhindern.
      HINWEIS: Ausreichende Semanzipierung des Gewebes und die enzymatische Aktivität von Kollagenase und Dispase können die Probenverdauung beeinflussen. Eine gleichmäßige Gülle sollte in der Lage sein, eine normale Pipettenspitze mit minimaler Okklusion nach 1,5 h zu passieren. Wenn eine gleichmäßige Gülle nach 1,5 h nicht erreicht wird, überprüfen Sie doppelt, ob die Gewebezerkleinerung ausreichend ist, und wird das Gewebe auf die entsprechende Größe zerkleinert (Schritt 2.1.2). Zusätzlich sollte die Aktivität der Enzyme getestet werden, da eine Chargen-zu-Los-Variation in der enzymatischen Aktivität auftritt.
  4. Pelletzellen und Einfrieren in Wiederherstellungsmedien.
    1. Fügen Sie 6 ml Wachstumsmedien (GM; 79% Hames F12, 20% fetales Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin, 5 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor [bFGF], pH 7,4, durch einen 0,22-m-Filter) in die Muskelschlämme.
    2. Die Suspension durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr geben. Spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen 4 ml GM.
      HINWEIS: Die Probe kann wieder in ein 15 ml konisches Rohr übertragen werden, um das Pellet einfach zu visualisieren. Ein größeres Waschvolumen kann verwendet werden, wenn die nachfolgenden Zellerträge gering sind.
    3. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
    4. Aspirieren Sie den Überstand sicher, nicht das Pellet zu stören. Streichen Sie das Rohr, um das Pellet in den verbleibenden Medien wieder auszusetzen. Wenn Zellen nicht kultiviert werden, fahren Sie sofort mit Schritt 2.4.5 fort, um Anweisungen zur Langzeitspeicherung zu erhalten, andernfalls fahren Sie mit Schritt 3.1.6 fort.
      HINWEIS: Wenn eine unmittelbare Kultur gewünscht wird, sollte GM in Zellkulturplatten vor Beginn der Biopsieverarbeitung vorbebrütet werden (Schritte 3.1.1 und 3.1.2).
    5. Fügen Sie dem wiederhergestellten Pellet 1,5 ml Einfrierungsmedien (Materialtabelle) hinzu.
    6. Die Gülle in eine Kryovial überführen. Legen Sie den Kryovial über Nacht bei -80 °C in einen isopropanol-kontrollierten Ratenkühler. Kryovial bei -80 °C lagern, bis er für die Kultur bereit ist.
      HINWEIS: Kryovials, die Gülle enthalten, können für die langzeitige Lagerung (mehr als 1 Monat) in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden. Die Verwendung eines isopropanol-kontrollierten Ratenkühlers ermöglicht es, Zellen mit einer Rate von 1 °C/min reproduzierbar zu gefroren zu lassen, was zu optimalen Zellwiederherstellungsraten führt, wie die Lebensfähigkeit nach dem Einfrieren und die erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Anhaftung an Zellkulturgefäßen9. Alternativ kann ein Becher verwendet werden, der RT Isopropanol enthält und in einen -80 °C-Gefrierschrank gelegt wird.

3. Kultivieren menschlicher Muskelvorläuferzellen

  1. Die Muskelschlämme auftauen.
    1. Vor dem Auftauen und Säen von hMPCs, vor-Gleichgewicht Zellkulturplatten in GM. Fügen Sie 250 L GM zu 4 Brunnen einer kollagenbeschichteten (Kollagen I), 24-Well-Zellkulturplatte. Füllen Sie die verbleibenden Brunnen mit 500 l sterilen Basismedien (d. h. F12), um Verdunstung während der Langzeitkultur zu verhindern.
      HINWEIS: Für Biopsien zwischen 50 g und 100 g sind vier Brunnen einer 24-Well-Platte geeignet. Wenn das Biopsiegewebe weniger als 50 g beträgt, können zwei Brunnen besser geeignet sein. Restmüll und geringe Zellzahl verhindert die Verwendung einer Zellzähltechnik in diesem Schritt; Daher wird die genaue Saatdichte nicht bestimmt und variiert leicht von Biopsie zu Biopsie.
    2. Zellkulturgefäße mit GM bei 37 °C in 5% CO2 für 1 h vor der Aussaat inkubieren.
    3. Kryovials aus dem Gefrierschrank -80 °C entfernen und in ein 37 °C-Wasserbad geben; die Flüssigkeit im Rohr sollte vollständig in Wasser getaucht werden.
    4. Wenn das Auftauen fast abgeschlossen ist (ca. 5 min), übertragen Sie den Kryovial auf eine sterile laminare Strömungshaube. Die Muskelschlämme aus dem Kryovialrohr übertragen und zu einem 15 ml konischen Rohr mit 6 ml vorgewärmten GV mit einer Rate von 1 ml/min geben.
    5. Zentrifugieren Sie die Muskelschlämme bei 300 x g für 5 min bei RT.
      HINWEIS: Eine schwingende Eimerzentrifuge kann es einfacher machen, kleine Pellets bei diesem Schritt zu visualisieren, ist aber nicht unbedingt notwendig.
    6. Aspirieren Sie den Überstand sicher, nicht das Pellet zu stören. Streichen Sie das Rohr, um das Pellet in den verbleibenden Medien wieder auszusetzen und in 1 ml GM wieder auszusetzen.
    7. Übertragen Sie 250 l des resuspendierten Pellets (heute als hMPC-Suspension) auf jede der 4 Brunnen der vorbebrütenten 24-Well-Zellkulturplatte.
  2. Kultur und Passage hMPCs.
    1. HMPC-Kulturen in GV bei 37 °C in 5%CO2pflegen.
      HINWEIS: Die Bestände an GV ohne bFGF (d. h. F12, Antibiotika, FBS) werden in Chargen hergestellt und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gehalten. bFGF wird GM am Tag der Anwendung hinzugefügt. BFGF-haltige Medien können für 48 h bei 4 °C gelagert werden.
    2. 24 Stunden nach der Isolierung, aspirieren Sie die GM, waschen Sie das Kulturgefäß vorsichtig 2x mit vorgewärmtem GM, und fügen Sie frische GM.
      ANMERKUNG: 24 h sollten hMPCs ausreichend Zeit zum Anbringen zur Verfügung stellen; nach dem Waschen sollten keine hMPCs entfernt werden. Dieser Schritt wird auch restliche Trümmer entfernen, die während der Zellernte erzeugt wurden, wodurch das Gefäß mit einem bildgebenden Zytometer genauere Konfluenzscans ermöglicht wird (Abschnitt 5 unten). Nach diesem ersten Medienwechsel wird GM alle 48 Stunden gewechselt.
    3. Passage hMPCs, wenn 70% Zusammenfluss erreicht wird oder wenn sie auf dem gleichen Kulturgericht für 10 Tage geblieben sind, je nachdem, was zuerst auftritt.
      HINWEIS: 70% Zusammenfluss beträgt ca. 55.000 Zellen/cm2.
    4. Um dies zu verfolgenden, fügen Sie 250 l vorgewärmten Trypsin zu jedem Brunnen einer 24-Well-Zellkulturplatte hinzu und brüten für 5 min.
    5. Tippen Sie auf das Zellkulturgefäß auf einer festen Oberfläche, um hMPCs zu lösen. Mit einem Lichtmikroskop kann überprüft werden, ob sich die hMPCs gelöst haben.
    6. Die Trypsin/hMPC Suspensionen in einem 15 ml konischen Rohr auf 5 ml GM übertragen.
    7. Zentrifugieren Sie die hMPC-Aufhängung bei 300 x g für 5 min bei RT.
    8. HMPC-Suspensionen von der Zentrifuge entfernen und in der sterilen laminaren Durchflusshaube auf Eis legen.
      HINWEIS: HMPCs während des Passierens auf Eis zu halten, führt zu weniger Zellaggregation.
    9. Aspirieren Sie Überstand aus hMPCs und setzen Sie Pellet in 1 ml GM sanft wieder auf.
    10. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
      HINWEIS: Eine Verdünnung der Zellsuspension auf den Zellzählpuffer ist in der Regel angemessen.
    11. Saat-hMPCs auf kollagenbeschichtete Kulturgerichte mit vorgewärmtem GV mit einer Dichte von 3.500 Zellen pro cm2. Eine Kombination aus 10 cm Platten und 24-Well-Platten ist ideal. Die 24-Well-Platten können täglich auf einem bildgebenden Zytometer gescannt werden, um das Wachstum zu überwachen.
    12. Befolgen Sie das gleiche Verfahren (ab Schritt 3.2.4.) für nachfolgende Passagen.
      HINWEIS: Die Gesundheit und Reinheit der Zellen kann über Passagen hinweg mit einem Marker für zelluläre Seneszenz (z.B. "Galactosidase" und Immunfärbung für Pax7 überwacht werden.
  3. Cryopreserve die hMPCs.
    1. Cryopreserve überschüssige Zellen für die spätere Verwendung, um die KulturVolumen handlicher zu machen.
    2. Für die Kryokonservierung folgen Sie dem in den Schritten 3.2.4.-3.2.9 beschriebenen Trypsinisierungsverfahren.
    3. Während die Zellsuspension zentrifugiert wird, bereiten Sie eine Mischung aus 20% (z.B. 200 l) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 80% (z.B. 800 l) GM vor. Pipette nach oben und unten 20x, um eine ausreichende Mischung zu gewährleisten. Lassen Sie die Mischung auf Eis ruhen.
    4. Basierend auf der Zellzahl die hMPC Suspension bei GM auf 2 x 106/ml verdünnen.
    5. Kombinieren Sie die hMPC Suspension und das 20% sterile DMSO/80% GM-Gemisch 50/50. Das letzte Kryokonservierungsmedium ist eine Kombination aus DMSO (10%) und GM (90%) 1 x 106 hMPCs/ml enthalten.
    6. Platzieren Sie 1 ml der hMPC Suspension in Schritt 3.3.5 in so viele Kryovials, wie es die anfängliche Zellzahl erlaubt. Dann legen Sie aliquoted hMPCs in einem isopropanol-kontrollierten Ratenkühler in einem -80 °C Gefrierschrank über Nacht.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden in der Regel zwischen 5 und 15 Millionen Zellen gewonnen, von denen 30 bis 60 % von FACS als hMPCs identifiziert werden.

4. Isolierung von Pax7+ Human Muscle Progenitor Cells via Flow Cytometry

  1. Um hMPCs aus lebenden Kulturen (Schritt 3.2.11) vorzubereiten, versuchen Sie genügend Kulturgefäße für 1 x 106x 106 Gesamtzellen. Bereiten Sie Zellsuspensionen vor, wie in den Schritten 3.2.4-3.2.9 beschrieben.
  2. Bereiten Sie hMPCs aus kryokonservierten Kulturen vor (Schritt 2.4.6 oder 3.3.6).
    1. Wählen Sie für jeden Spender 1 x 2 Tuben mit einem Durchlauf von 1 x 106 Durchgängen von vier hMPCs aus.
      HINWEIS: Die Verwendung von Durchgang vier hMPCs ermöglicht eine ausreichende Zellausbeute bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des proliferativen Potenzials bis zum 6. Durchgang (Abbildung 2).
    2. Schnelles Auftauen von Zellen, indem sie sie aus dem -80 °C Gefrierschrank entfernen und in ein 37 °C-Wasserbad legen, wobei die Flüssigkeit im Rohr vollständig untergetaucht ist.
    3. Wenn das Auftauen fast abgeschlossen ist (ca. 5 min), übertragen Sie hMPCs auf eine sterile laminare Durchflusshaube und übertragen Sie den Inhalt der Zellsuspension in 6 ml vorgewärmtes GV in einem 15 ml konischen Rohr mit einer Rate von 1 ml/min.
    4. Bereiten Sie Zellsuspensionen vor, wie in den Schritten 3.2.7-3.2.9 beschrieben.
    5. Setzen Sie jedes Pellet in 3 ml FACS-Puffer (500 ml PBS, 12,5 ml normales Ziegenserum, 2 ml 0,5 M EDTA, pH 7,4, durch einen 0,22 m Filter) ab.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei RT.
    7. Aspirat-Überstand aus hMPCs und sanft resuspend Pellet in 250 L FACS Puffer; auf Eis.
    8. Legen Sie 100 l Zellen in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr und lassen Sie sie auf Eis, um sie als Live/Dead-Steuerung zu verwenden (Schritt 4.5.1).
      HINWEIS: Die 100 ul Zellen, die für Leben/Tote-Kontrollen verwendet werden sollen, können von der Einnahme eines kleinen Volumens (20 ul) resuspendedr Zellen von jedem Spender zu sortieren oder aus Bankzellen stammen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, nicht mehr als 20 ul resuspendierte Zellen von einem einzigen Spender zu nehmen. Bringen Sie Volumen bis zu 100 ul mit FACS-Puffer, wenn < 100 ul von Zellen verfügbar ist.
  3. Stain hMPCs für Zelloberflächenmarker.
    1. Bereiten Sie den folgenden Antikörper-Cocktail vor (die gezeigten Mengen sind für jede Kultur, entsprechend skalieren): 5 l CD56 (neurales Zelladhäsionsmolekül [NCAM]; PE-Cy7-konjugiert) und 5 l CD29 (1-Integrin; AlexFluor488-konjugiert). Die endgültige Antikörperverdünnung ist 1:50.
    2. Fügen Sie jede hMPC-Suspension 10 l des Antikörpercocktails hinzu und bebrüten sie 30 min im Dunkeln auf Eis.
    3. Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer zu jeder Suspension/Antikörper-Cocktail-Mischung hinzu.
    4. Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 300 x g für 5 min bei RT.
    5. Das Pellet in 300 l FACS-Puffer wieder aufhängen und in ein 5 ml rundes Unter-Polystyrolrohr übertragen.
    6. Halten Sie die Suspension auf Eis und vor Licht geschützt.
  4. Bereiten Sie die Kompensationsperlen vor.
    HINWEIS:     Positive Kontrollen für jeden Antikörper und eine Negativkontrolle (ungefärbte Perlen) sollten mit Kompensationsperlen vorbereitet werden. Kompensationsperlenkontrollen sollten auf dem Durchflusszytometer ausgeführt werden, bevor die Proben sortiert werden. Diese Kontrollen ermöglichen die Bestimmung, wie viel das Fluorchrom aus jedem Antikörper im Kanal des anderen detektiert werden kann, so dass eine Kompensation angewendet werden kann.
    1. Wirbel Kompensation Perlen.
    2. In drei 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren einen Tropfen (50 l) Kompensationsperlen hinzufügen.
    3. Fügen Sie dem entsprechenden Röhrchen 1 L oder keinen der Negativkontrolle hinzu.
    4. 15 min im Dunkeln bebrüten.
    5. Fügen Sie jedem Rohr und Wirbel 1,5 ml FACS-Puffer hinzu.
    6. Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 300 x g in einer Tischzentrifuge für 5 min bei RT.
    7. Aspirieren Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 l FACS Puffer.
      HINWEIS: Das Pellet kann sehr schwer zu visualisieren sein; beim Anaspirieren des Überstandes ist Vorsicht geboten.
    8. Legen Sie die Suspension in ein 5 ml rundes Unterteil Polystyrolrohr und halten Sie dann die Röhre auf Eis und vor Licht geschützt.
  5. Bereiten Sie Live- und Totkontrollen vor.
    1. Teilen Sie die 100 l hMPCs aus Schritt 4.2.8 in zwei 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren (eine für die Live-Steuerung und eine für die Totkontrolle).
    2. Legen Sie das tote Steuerrohr in einen Heizblock, der für >10 min auf 70 °C vorgewärmt ist. Während dieser Zeit, halten Sie die Live-Kontrolle auf Eis.
    3. Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 300 x g in einer Tischzentrifuge für 5 min bei RT.
    4. Aspirieren Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 150 l FACS Puffer.
    5. Kombinieren Sie die Live/Dead-Steuerungen in einem einzigen 5 ml runden unteren Polystyrolrohr.
  6. Führen Sie Lebensfähigkeitsfärbung.
    1. Fügen Sie allen zu sortierenden Zellröhren und der Live/Dead-Kontrolle 1 L 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) hinzu.
    2. Fügen Sie GM zu kollagenbeschichteten 24-Well-Platten (250 l/well) und 10 cm (8 ml/well) Platten hinzu und lassen Siesie in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 ausdemieren.
  7. Sortieren Sie hMPCs über die Durchflusszytometrie.
    1. Sortieren Sie hMPCs auf einem Durchflusszytometer mit 100 m Düse bei einem Druck von 20 psi. Bestimmen Sie Live-hMPCS basierend auf Seiten- und Vorwärtsstreuung sowie 7-AAD-Negativität (Sortierparameter und eine repräsentative Sortierung sind in Abbildung 3zu sehen).
    2. Zellen positiv für PE-Cy7 (780/60 nm) und AlexFluor488 (530/30 nm) stellen CD56+/CD29+ Zellen dar und sind somit Pax7-positive Zellen (hMPCs). Sortieren Sie doppelte positive Zellen in Sammelröhrchen, die ein 300-L-Kissen faCS-Puffer enthalten.
      HINWEIS: Die Reinheit sortierter Kulturen kann durch Immunfärbung für Pax7 bestimmt werden, gefolgt von einer nachgeschalteten Durchflusszytometrieanalyse (Abbildung 4).
    3. Verwerfen Sie alle anderen Zellen.
    4. Übertragen Sie die sortierten Zellen in ein 15 ml konisches Rohr.
    5. Drehen Sie die hMPC-Aufhängung bei 300 x g für 5 min bei RT.
    6. Den Überstand vorsichtig ansaugen und in 1 ml GM resuspendieren.
    7. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
      HINWEIS: Während die Anzahl der Zellen als die Anzahl der Ereignisse abgeleitet werden kann, die positiv sortiert sind, wurde festgestellt, dass diese Anzahl die Anzahl der Zellen im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Zellzählung um 10 bis 40 % überschätzt.
    8. Seed die hMPCs wie in Schritt 3.2.11 beschrieben.
      HINWEIS: Die Überprüfung der Reinheit der hMPC-Population kann durch Immunfärbung für Pax7 und Analyse mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden.

5. Charakterisierung der Kulturen der menschlichen Muskelprogenitorzelle (hMPC) mit einem bildgebenden Zytometer

  1. Verwenden Sie das bildgebende Zytometer (Materialtabelle), um Zusammenflussscans durchzuführen.
    1. Wählen Sie Neue Scan erstellen aus, und geben Sie dann die Plattenkategorie, das Plattenprofil und die Platten-IDein. Das bildgebende Zytometer kann 96, 24 und 6 Wellplatten aufnehmen.
    2. Wählen Sie unter Anwendungdie Option Einmündung > Konfluence 1aus.
    3. Wählen Sie einen Brunnen aus, der mit dem Navigator auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt werden soll.
    4. Suchen Sie eine Fokusebene, in der die Zellen im Vergleich zum Hintergrund weiß erscheinen, und wählen Sie das Registerhandbuch aus, oder erlauben Sie dem bildgebenden Zytometer, die Fokusebene auszuwählen, indem Sie Register Autoauswählen.
      HINWEIS: Für die 96 Brunnenplatten, die in der Tabelle der Materialienvorgeschlagen werden, beträgt eine ungefähre Position 4,3 Einheiten.
    5. Verwenden Sie die Maus, um alle Brunnen hervorzuheben, die gescannt werden müssen. Der gesamte Brunnenbereich wird automatisch gescannt. Wählen Sie Scan starten.
    6. Wählen Sie die Analyseeinstellungen optimal für Den Platten- und Zelltyp aus.
      HINWEIS: Für hMPCs sind die folgenden Einstellungen optimal: Intensität = 6, gesättigte Intensität = 0, Durchmesser = 8, Mindestdicke = 3, min Clustergröße = 500 und Genauigkeit = hoch.
    7. Wählen Sie Analyse startenaus.
      HINWEIS: Sehen Sie Bilder visuell, um sicherzustellen, dass der Benutzer und das bildgebende Zytometer hinsichtlich des Umfangs der Zellen übereinstimmen. Wenn eine große Diskrepanz besteht, scannen Sie die Platte erneut mit einer anderen Fokusebene oder anderen Analyseeinstellungen. Konfluence Scanning kann verwendet werden, um das Wachstum zwischen Kulturen zu vergleichen, zeitweise die Verabreichung einer Behandlung zu bestimmen oder Zellen zu überwachen und zu entscheiden, wann eine Differenzierung eingeleitet werden soll. Wenn eine Differenzierung gewünscht wird, werden Details in Abschnitt 6 angegeben.
  2. Verwenden Sie das bildgebende Zytometer, um Zellen zu zählen.
    1. Bereiten Sie eine Färbelösung vor, die 12 ml Von Hams F12, 6 l Von Hoechst 33342 und 24 l Propidiumjodid enthält.
    2. Aspirieren Sie Medien und ersetzen Sie durch Färbelösung, inkubieren bei 37 °C für 15 min.
    3. Aspirieren Färbung Lösung und ersetzen mit Hamf12.
      HINWEIS: Es ist wichtig, ein Medium mit niedrigem Phenolrotgehalt zu verwenden, um klare Bilder zu erhalten. Alternativ kann PBS verwendet werden.
    4. Laden Sie die Platte auf das bildgebende Zytometer und wählen Sie unter Anwendung, wählen Sie Zelllebensfähigkeit > Live + Tot + Total. Der Live-Kanal wird ein helles Feldbild sein, der tote Kanal wird das Propidium Iodide sein, und der gesamte Kanal wird der Hoechst 33342 sein.
    5. Legen Sie den Live-Kanal auf ein helles Feld fest, und klicken Sie unter Fokus-Setupauf Auto registrieren .
    6. Legen Sie unter dem Kanal Total den Kanal auf blau fest. Verwenden Sie Fokus suchen, um die Kerne in den Fokus zu rücken, oder verwenden Sie die Auf- und Abwärtspfeile, um den Fokus manuell einzustellen. Klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen.
    7. Stellen Sie unter dem Dead-Kanal den Kanal auf Rot ein. Verwenden Sie Fokus suchen, um die toten Zellen in den Fokus zu rücken, oder verwenden Sie die Auf- und Abwärtspfeile, um den Fokus manuell festzulegen. Klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen.
    8. Wählen Sie Scan starten aus, um den Scan zu starten.
    9. Wählen Sie Analyseparameter aus, die für den Platten- und Zelltyp geeignet sind. Wählen Sie Analyse starten aus, um die Analyse zu starten. Überprüfen Sie nach Abschluss der Analyse visuell, ob die Analyse Zellen angemessen zählt (z. B. für die Gesamtkanalprüfung, ob jeder Kern als Kern erkannt wird und dass das bildgebende Zytometer keine Flecken im Hintergrund Nuklei). Wenn der Scan und die Analyse zufriedenstellend sind, geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, andernfalls scannen oder ändern Sie die Analyseparameter.

6. Unterscheidung von humanen Muskelvorläuferzellen (hMPCs) auf Myotuben

  1. Bestimmen Sie den hMPC-Zusammenfluss mithilfe des Protokolls in Abschnitt 5.1. Um hMPCs in Myoröhren zu differenzieren, ist es ideal, dass Zellen 80 bis 85 % konfluent sind, wie durch die Zusammenflussfunktion auf dem bildgebenden Zytometer bestimmt (siehe Abschnitt 5). Wenn hMPCs von mehr als einem eindeutigen Spender verwendet werden, ermöglicht das Konfluenzscanning Zellen verschiedener Spender, mit der Differenzierung zu beginnen, wenn sie den Zusammenfluss erreichen.
    HINWEIS: Bei 80% Zusammenfluss gibt es ca. 66.000 Zellen/cm2.
  2. Waschzellen 2x mit Differenzierungsmedien (97% Schinkenf12, 2% Pferdeserum, 1% Penicillin/Streptomycin, pH 7,4, durchlaufen einen 0,22-m-Filter).
  3. Bewahren Sie Zellen in Differenzierungsmedien so lange, wie das Experiment diktiert, während Sie täglich die Medien wechseln.
  4. Bewerten Sie die Myotube-Bildung direkt durch Immunfärbung für embryonale Myosin-Schwerekette, die typischerweise nach 7-10 Tagen Differenzierung nachweisbar ist.
    HINWEIS: Die Zeit, die für die Bildung von Myotuben benötigt wird, kann je nach Spender und Anzahl der Zellen, wenn die Differenzierung eingeleitet wurde, leicht variieren; Daher wird empfohlen, die Kulturen jedes Spenders einzeln zu überwachen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der hMPC-Isolierung aus menschlichem Muskelgewebe können in Abbildung 1dargestellt werden. hMPCs können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur von Zellen, die für 7-AAD negativ sind und daher lebensfähig sind. Die Auswahl der Zellen, die sowohl für die Zelloberflächenma...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Primäre hMPCs sind ein wichtiges Forschungsmodell, das verwendet wird, um skelettierte Muskelbiologie und den regenerativen Prozess zu verstehen. Darüber hinaus haben hMPCs das Potenzial, für die Therapie verwendet zu werden. Es gibt jedoch anerkannte Herausforderungen bei der Verwendung von primären hMPCs für Forschung und Therapie, einschließlich des begrenzten Verständnisses von Zellen, die vom Menschen abgeleitet sind10. Es gibt auch eine große Variation in der Expansionskapazität zwischen den...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken der Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility für ihre Hilfe bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung. Wir danken auch Molly Gheller für ihre Hilfe bei der Rekrutierung von Teilnehmern und Erica Bender für die Durchführung der Skelettmuskelbiopsien. Abschließend danken wir den Teilnehmern für ihre Zeit und ihre Teilnahme an der Studie. Diese Arbeit wurde vom National Institute on Aging of the National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01AG058630 (nach B.D.C. und A.E.T.), von einer Glenn Foundation for Medical Research und der American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (zu B) unterstützt. . D.C.) und vom President es Council for Cornell Women (bis A.E.T.).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin, 2,21 mM EDTACorning25-053-ClTrypsin zur Entfernung von anhaftenden hMPCs aus Zellkulturgefäßen
10 cm ZellkulturplatteVWR664160Platten zur Kultivierung von hMPCs
15 mL Falcon-RöhrchenFalcon352196konische Röhrchen zur Verwendung in den hMPC-Isolations- und Kultivierungsprotokollen
24-Well-ZellkulturplatteGrenier Bio-One662 160Platten für die Kultivierung von hMPCs
7-AAD Viability Staining SolutioneBioscience00-6993-50Viability Staining zur Identifizierung lebender Zellen während der FACS-Sortierung
Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD29, Klon: TS2/16BioLegend303016Konjugierter Antikörper für FACS
Schwarze 96-Well-ZellkulturplatteGrenier Bio-One65507996-Well-Zellkulturplatte, ideal für die Fluoreszenzbildgebung mit dem Celigo
S Celigo SNexcelcom BioscienceImaging Zytometer zur Verfolgung von hMPC-Kulturen
ZellsiebVWR352350Zellsieb zur Beseitigung großer Ablagerungen während der Muskelbiopsieverarbeitung
Kollagen Typ I (Ratte Corning354236Kollagen zum Beschichten von Zellkulturplatten 
Kollagenase DRoche11 088 882 001Wird für den Abbau von Kollagen und anderem Bindegewebe im Skelettmuskelbiopsiegewebe
verwendet DimethylsulfoxidVWRWN182Wird für die Kryokonservierung von hMPCs
verwendet Dispase IISigma Life SciencesD4693Eine Protease zur enzymatischen Verdauung von Skelettmuskelbiopsiegewebe
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose PulverGibco31600-034Low Glucose DMEM für die Muskelbiopsie-Verarbeitung
Dulbecco's Phosphat Buffered SalineGibco21600-010PBS für die Muskelbiopsie-Verarbeitung
EDTA Dinatriumsalz-DihydratJ.T. Baker4040-01 Erforderlich für FACS-Puffer
Fötales RinderserumVWR89510-186 Fötales Rinderserum für hMPC-Wachstumsmedien
Ham's F12Gibco21700-026Basismedium für hMPCs
Hitzeinaktiviertes PferdeserumGibco26-050-070Pferdeserum zur Herstellung von hMPC-Differenzierungsmedien
HämozytometeriNCytoDHC-N0105Wird zur Zellzählung
verwendet Winterschlaf AGibcoA1247501Medien zur Konservierung der Skelettmuskelbiopsie
Gewebe Hoechst 33342, Trihydrochlorid, TrihydratLife TechnologiesH21492DNA-Farbstoff zur Identifizierung aller Zellen mit dem Celigo S
IsopropanolFisher ScientificA416P-4Wird für das kontrollierte Einfrieren von hMPCs
verwendet Moxi-PufferOrfloMXA006Puffer für automatisierte Zellzähler
Moxi-KassettenOrfloMXC002Cassesttes für automatisierte Zellzähler
Moxi z Mini Automatisierter ZellzählerOrfloAutomatisierter Zellzähler
Mr. Frosty GefrierbehälterThermo Fisher Scientific5100-0001Kommerziell erhältlicher Zellgefrierbehälter mit kontrollierter Rate
Normales Ziegenserum (10%)Thermo Fisher Scientific50062ZZiegenserum für FACS-Puffer
PE-Cy7 Maus Anti-humanes CD56 , Klon: B159BD Pharmingen557747Konjugierter Antikörper für FACS 
Penicillin/Streptomycin 100x LösungCorning30-002-CIAntibiotika, die dem Nährmedium zugesetzt
PropidiumiodidThermo Fisher ScientificP3566DNA-Färbung zur Identifizierung toter Zellen unter Verwendung des
rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-WachstumsfaktorsPromegaG5071Supplement in hMPC-Wachstumsmedien zur Verhinderung der spontanen Differenzierung
Einfriermedium für WiederherstellungszellkulturenGibco12648-010Medien zur Kryoperfassung von Muskelbiopsie-Schlämmen
NatriumbicarbonatFisher ScientificS233-3hinzugefügt zu Ham's F12
sterile 5-ml-Röhrchen mit rundem BodenVWR60818-565Röhrchen für FACS
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42Kompensationsperlen für die Kalibrierung der FACS-Einstellungen
wurden

Referenzen

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657(2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
  5. Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2(2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

DurchflusszytometrieImaging ZytometerZellisolationGewebedigestionPax7 ExpressionCD56 CD29 MarkerKonfluenzanalyseZelldifferenzierung
Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.