Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden. hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.
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Methodenartikel
Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und Zellen ist ideal für die Untersuchung biologischer und physiologischer Prozesse wie der Regenerationsprozess des Skelettmuskels. Es gibt anerkannte Herausforderungen bei der Arbeit mit menschlichen primären adulten Stammzellen, insbesondere menschlichen Muskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsien abgeleitet sind, einschließlich geringer Zellausbeute aus gesammeltem Gewebe und einem hohen Grad an Spenderheterogenität Wachstums- und Todesparameter zwischen den Kulturen. Während die Integration von Heterogenität in experimentelles Design eine größere Stichprobengröße erfordert, um signifikante Effekte zu erkennen, ermöglicht es uns auch, Mechanismen zu identifizieren, die der Variabilität der hMPC-Erweiterungskapazität zugrunde liegen, und ermöglicht es uns, die Sbeinen-Erweiterungskapazität besser zu verstehen. Heterogenität in der Skelettmuskelregeneration. Neuartige Mechanismen, die die Expansionsfähigkeit von Kulturen unterscheiden, haben das Potenzial, zur Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Regeneration der Skelettmuskulatur zu führen.
Einleitung
Skelettmuskel ist das größte Organsystem im menschlichen Körper, macht 30 bis 40% der ganzen Körpermasse1. Neben seiner anerkannten Rolle in der Fortbewegung, Skelettmuskel hält Körpertemperatur und Körperhaltung, und spielt eine zentrale Rolle in ganzkörperlichen Nährstoff Homöostase. Die Forschung unter Beteiligung menschlicher Teilnehmer, Tiere und Zellkulturmodelle ist wertvoll, um Fragen der Skelettmuskelbiologie und Regeneration zu beantworten. Isolation und Kultur der menschlichen Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs) bietet ein robustes Modell, das es ermöglicht, Zellkulturtechniken und Manipulationen auf menschliche Proben anzuwenden. Ei....
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Protokoll
Dieses Protokoll wurde vom Institutional Review Board der Cornell University genehmigt. Alle Teilnehmer wurden auf die zugrunde liegenden gesundheitlichen Bedingungen untersucht und gaben ihre Einwilligung in Kenntnis der Sachlage ab.
1. Beschaffung von menschlichem Muskelgewebe über die Skelettmuskelbiopsie
- Identifizieren Sie den Vastus lateralis Muskel durch Palpation, anatomische Landmarken und aktive Kontraktion des Muskels.
- Palpate die vastus lateralis, indem der Teilnehmer ihre Quadrizeps-Muskel straffen und den Bauch des Muskels zu finden, etwa 1/3 des Weges von der Patella zur Hüfte, und nur ventrolateral zum Obe....
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Ergebnisse
Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der hMPC-Isolierung aus menschlichem Muskelgewebe können in Abbildung 1dargestellt werden. hMPCs können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur von Zellen, die für 7-AAD negativ sind und daher lebensfähig sind. Die Auswahl der Zellen, die sowohl für die Zelloberflächenma.......
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Diskussion
Primäre hMPCs sind ein wichtiges Forschungsmodell, das verwendet wird, um skelettierte Muskelbiologie und den regenerativen Prozess zu verstehen. Darüber hinaus haben hMPCs das Potenzial, für die Therapie verwendet zu werden. Es gibt jedoch anerkannte Herausforderungen bei der Verwendung von primären hMPCs für Forschung und Therapie, einschließlich des begrenzten Verständnisses von Zellen, die vom Menschen abgeleitet sind10. Es gibt auch eine große Variation in der Expansionskapazität zwischen den.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken der Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility für ihre Hilfe bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung. Wir danken auch Molly Gheller für ihre Hilfe bei der Rekrutierung von Teilnehmern und Erica Bender für die Durchführung der Skelettmuskelbiopsien. Abschließend danken wir den Teilnehmern für ihre Zeit und ihre Teilnahme an der Studie. Diese Arbeit wurde vom National Institute on Aging of the National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01AG058630 (nach B.D.C. und A.E.T.), von einer Glenn Foundation for Medical Research und der American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (zu B) unterstützt. ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin, 2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin zur Entfernung von anhaftenden hMPCs aus Zellkulturgefäßen |
| 10 cm Zellkulturplatte | VWR | 664160 | Platten zur Kultivierung von hMPCs |
| 15 mL Falcon-Röhrchen | Falcon | 352196 | konische Röhrchen zur Verwendung in den hMPC-Isolations- und Kultivierungsprotokollen |
| 24-Well-Zellkulturplatte | Grenier Bio-One | 662 160 | Platten für die Kultivierung von hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability Staining zur Identifizierung lebender Zellen während der FACS-Sortierung |
| Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD29, Klon: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Konjugierter Antikörper für FACS |
| Schwarze 96-Well-Zellkulturplatte | Grenier Bio-One | 655079 | 96-Well-Zellkulturplatte, ideal für die Fluoreszenzbildgebung mit dem Celigo |
| S Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging Zytometer zur Verfolgung von hMPC-Kulturen | |
| Zellsieb | VWR | 352350 | Zellsieb zur Beseitigung großer Ablagerungen während der Muskelbiopsieverarbeitung |
| Kollagen Typ I (Ratte Corning | 354236 | Kollagen zum Beschichten von Zellkulturplatten | |
| Kollagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Wird für den Abbau von Kollagen und anderem Bindegewebe im Skelettmuskelbiopsiegewebe |
| verwendet Dimethylsulfoxid | VWR | WN182 | Wird für die Kryokonservierung von hMPCs |
| verwendet Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | Eine Protease zur enzymatischen Verdauung von Skelettmuskelbiopsiegewebe |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose Pulver | Gibco | 31600-034 | Low Glucose DMEM für die Muskelbiopsie-Verarbeitung |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS für die Muskelbiopsie-Verarbeitung |
| EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat | J.T. Baker | 4040-01 | Erforderlich für FACS-Puffer |
| Fötales Rinderserum | VWR | 89510-186 | Fötales Rinderserum für hMPC-Wachstumsmedien |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Basismedium für hMPCs |
| Hitzeinaktiviertes Pferdeserum | Gibco | 26-050-070 | Pferdeserum zur Herstellung von hMPC-Differenzierungsmedien |
| Hämozytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Wird zur Zellzählung |
| verwendet Winterschlaf A | Gibco | A1247501 | Medien zur Konservierung der Skelettmuskelbiopsie |
| Gewebe Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat | Life Technologies | H21492 | DNA-Farbstoff zur Identifizierung aller Zellen mit dem Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Wird für das kontrollierte Einfrieren von hMPCs |
| verwendet Moxi-Puffer | Orflo | MXA006 | Puffer für automatisierte Zellzähler |
| Moxi-Kassetten | Orflo | MXC002 | Cassesttes für automatisierte Zellzähler |
| Moxi z Mini Automatisierter Zellzähler | Orflo | Automatisierter Zellzähler | |
| Mr. Frosty Gefrierbehälter | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Kommerziell erhältlicher Zellgefrierbehälter mit kontrollierter Rate |
| Normales Ziegenserum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Ziegenserum für FACS-Puffer |
| PE-Cy7 Maus Anti-humanes CD56 , Klon: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Konjugierter Antikörper für FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100x Lösung | Corning | 30-002-CI | Antibiotika, die dem Nährmedium zugesetzt |
| Propidiumiodid | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA-Färbung zur Identifizierung toter Zellen unter Verwendung des |
| rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors | Promega | G5071 | Supplement in hMPC-Wachstumsmedien zur Verhinderung der spontanen Differenzierung |
| Einfriermedium für Wiederherstellungszellkulturen | Gibco | 12648-010 | Medien zur Kryoperfassung von Muskelbiopsie-Schlämmen |
| Natriumbicarbonat | Fisher Scientific | S233-3 | hinzugefügt zu Ham's F12 |
| sterile 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden | VWR | 60818-565 | Röhrchen für FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Kompensationsperlen für die Kalibrierung der FACS-Einstellungen |
Referenzen
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
