Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

14.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/59584

⸱

22. Mai 2019

 ,  , 
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier legen wir ein leicht anwendbares Protokoll vor, um die Speicherstabilität von extrazellulären Bläschen zu beurteilen, einer Gruppe natürlich vorkommender Nanopartikel, die von Zellen produziert werden. Die Vesikel werden als Modellenzym mit Glucuronidase beladen und unter unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Nach der Lagerung werden ihre physikalisch-chemischen Parameter und die Aktivität des verkapselten Enzyms ausgewertet.

Zusammenfassung

Extrakelluläre Bläschen (EVs) sind vielversprechende Ziele in der aktuellen Forschung, die als Medikamente, Drogenträger und Biomarker eingesetzt werden sollen. Für ihre klinische Entwicklung ist nicht nur ihre pharmazeutische Aktivität wichtig, sondern auch ihre Produktion muss bewertet werden. In diesem Zusammenhang konzentriert sich die Forschung auf die Isolierung von Elektrofahrzeugen, ihre Charakterisierung und ihre Lagerung. Das vorliegende Manuskript zielt darauf ab, ein oberflächliches Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Lagerbedingungen auf Elektrofahrzeuge zu ermöglichen, ohne genetische Manipulation oder spezifische funktionale Untersuchungen. So kann man sich schnell einen ersten Eindruck von der Stabilität von Elektrofahrzeugen unter einem bestimmten Speicherzustand verschaffen und aus verschiedenen Zellquellen abgeleitete Varianten leicht vergleichen. Die Stabilitätsmessung basiert auf den physikalisch-chemischen Parametern der EVs (Größe, Partikelkonzentration und Morphologie) und der Erhaltung der Ladungsaktivität. Letzteres wird durch die Saponin-vermittelte Verkapselung des Enzyms Beta-Glucuronidase in die EVs bewertet. Glucuronidase fungiert als Leihmutter und ermöglicht eine einfache Quantifizierung über die Spaltung eines fluoreszierenden Reportermoleküls. Das vorliegende Protokoll könnte ein Instrument für Forscher bei der Suche nach Speicherbedingungen sein, die die EV-Eigenschaften optimal behalten, um die EV-Forschung in Richtung klinischer Anwendung voranzutreiben.

Einleitung

Es handelt sich dabei um membrangebundene Nanopartikel, die von fast allen Zelltypen hergestellt werden. Für Säugetierzellen können Elektroautos in zwei Hauptgruppen mit unterschiedlichen Produktionswegen 1,2 unterteilt werden. Membranbläschen mit einer Größe von ca. 100-1000 nm werden durch direktes Kleben aus der Zellmembran hergestellt. Exosome, die 30-200 nm groß sind, werden von multivesiculären Körpern abgeleitet, die durch innere Einkeimende in Endosomen gebildet werden, die sich anschließend mit der Zellmembran verschmelzen, um mehrere Exosomen auf einmal freizugeben. Die Hauptfunktion dieser Bläschen ist der Transport von Informationen zwischen denZellen 3. Dazu werden Ladungen wie RNA, DNA und Proteine aktiv in sie einsortiert. EVs können eine Vielzahl von Auswirkungen auf ihre Ziele vermitteln, mit Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheitszustand. Auf der einen Seite vermitteln sie positive Effekte wie Geweberegeneration, Antigen-Präsentation oder Antibiotika-Effekte, die sie zu günstigen Zielen für ihre Entwicklung als Therapeutika4,5machen. Auf der anderen Seite können Elektrofahrzeuge die Tumorvasskularisierung 6fördern, bei Stressreaktionen 7 zu Nebenwirkung von Gegensenzeneffektenführenund bei Autoimmunerkrankungen 8 und Entzündungskrankheiten 9 eine Rolle spielen. Sie könnten daher eine Schlüsselkomponente für ein besseres Verständnis vieler pathologischer Effekte sein. Das Vorhandensein von veränderten Elektroautos bei vielfältigen Erkrankungen, wie Krebs10, 11,12undHerz-Kreislauf-Erkrankungen 13,und ihre einfache Zugänglichkeit in Blut und Urin macht sie ideal Biomarker. Schließlich machen ihre gute Bioverträglichkeit 14 und ihre ihm innewohnende Targeting-FähigkeitEVs auch für die Medikamentenzufuhr 15 interessant. In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Bewertung der Speicherstabilität von Elektrofahrzeugen, die von Säugetierzellen abgeleitet werden, eine wichtige Eigenschaft, die noch wenig erforscht ist.

Für die klinische Entwicklung von Elektrofahrzeugen gibt es noch viele Hindernisse für die Übermontage 16, einschließlich der Bewertung ihrer therapeutischen Wirkungen, Produktion, Reinigung und Lagerung17. Während-80 ° C weithin als Goldstandardfürdie EV-Lagerung 18 angesehen wird, sind die benötigten Gefrierschränke teuer, und die Aufrechterhaltung der benötigten Kühlkette von der Produktion bis zum Patienten kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus deuten einige Berichte darauf hin, dass die Lagerung bei-80 ° C den Elektro-und Restbetrag noch nicht optimal bewahrt und einen Verlust an EV-Funktionalität19,20verursacht. Andere Methoden, wie das Gefriertrocknen 21,22 oder die Spritztrocknung 23, wurden als mögliche Alternativen zur Tiefkühllagerung von Elektrofahrzeugen vorgeschlagen.

Die optimale Möglichkeit, die Speicherstabilität zu beurteilen, wäre, die EVs in funktionellen Assays zu testen oder durch die Auswertung eines bestimmten Markers, zum Beispiel ihrer antibakteriellenAktivität 19. Dies ist möglich, wenn die gewünschte Wirkung der Bläschen bekannt ist und eine bestimmte Gruppe von Elektrofahrzeugen untersucht werden soll. Wenn Elektro-und Zellquellen verglichen werden sollen (z.B. für die Medikamentenverkapselung) oder wenn es keine funktionelle Auslesung gibt, ist es nicht mehr möglich, Veränderungen aufgrund der Lagerung direkt zu beurteilen.

Auf der anderen Seite prognostiziert die einfache Bewertung von Veränderungen ihrer physikalisch-chemischen Parameter, wie Größe, Partikelwiederherstellung und Proteinkonzentration, nicht immer Veränderungen in der EV-Aktivität, wie in einem kürzlichveröffentlichten Patent 20 gezeigt wurde.

Hier stellen wir ein leicht anwendbares Protokoll zur Messung der Lagerstabilität von Elektrofahrzeugen zur Verfügung, indem wir ihre physikalisch-chemischen Parameter in Kombination mit der Aktivität eines verkapselten Beta-Glucuronidase-Enzyms als Ersatz für die Ladung der Elektrofahrzeuge bewerten. Die Belastung des Enzyms erfolgt durch Saponin-Inkubation, eine milde Methode,die mit EVs aus verschiedenen Quellen 21,24,25hergestelltwird. Saponin bildet in der EV-Membran vergängliche Poren, die die Enzymaufnahme in die Bläschen ermöglichen. Da Enzyme dazu neigen, ihre Aktivität zu verlieren, wenn sie ungünstigen Lagerbedingungen ausgesetzt sind, sind sie ein idealer Ersatz für die Bewertung der Erhaltung der Funktionsgüter der Elektrofahrzeuge.

Wir haben gezeigt, dass die Anwendung dieses Protokolls auf alle, die von menschlichen mesenchymalen Stammzellen (MSCs), menschlichen Nabelvein-Endothelzellen (HUVECs) und menschlichen Adenokarzinomen alveolare Epithelzellen (A549) abgeleitet werden, tatsächlich zu großen Unterschieden in der Speicherstabilität zwischen verschiedenen Zelllinien, die bei der Auswahl der EV-Quelle 21 berücksichtigt werden sollte.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Zellkultur und die Produktion von zellkonditionierten Medium

  1. In der Regel werden Zellen unter den für die jeweilige Zelllinie erforderlichen individuellen Bedingungen kultiviert.
  2. Die Zellen 24-72 h in serumfreien Bedingungen oder in Medium mit EV-abgereichertem fetalen Rinderserum (FBS) für 24-72 h kultivieren.
    Hinweis: Wenn EV-erschöpfte FBS verwendet wird, verwenden Sie eine Methode, die nachweislich das Serum effizient erschöpft, um eine Kontamination mit Rinder-Serum-abgeleiteten EVs 26 zu verhindern.
  3. Sammeln Sie das Medium aus den Flaschen. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min, um die Zellen zu pustieren. Sammeln Sie vorsichtig das zellkonditionierte Medium (CCM), ohne die Pellezellen zu stören. Am besten nutzen Sie das CCM direkt oder lagern es über Nacht bei 4 ° C.
    Hinweis: Es ist immer besser, frisch produzierte CCM zu verwenden. Wenn die Speicherung über längere Zeiträume nicht umgangen werden kann, sollten alle relevanten Parameter nach den MISEV2018-Richtlinien26erfasst werden, wobei die möglichen Vorurteile der erworbenen Ergebnisse zu berücksichtigen sind.
  4. Beispielprotokoll für HUVECs
    1. Anbau von HUVEC-Zellen für 120 h in EGM-2-Medium, das FBS und andere Nahrungsergänzungsmittel enthält.
    2. Anbau von HUVEC-Zellen für 48 h im EBM-2-Basalmedium ohne Zusatzstoffe.
    3. Sammeln Sie das Medium aus den Flaschen und führen Sie den Zentrifugationsschritt wie oben angegeben durch (Schritt 1.3). In der Regel verwenden Sie 100 ml Medium für eine EV-Isolierung.

2. Ultraentrifugation of CCM

  1. Unmittelbar vor der Ultrakentrifugation (UC), zentrifugen Sie das CCM für 15 Minuten bei 3.000 x g und 4 ° C, um Zellschutt und große Agglomerate zu entfernen.
  2. Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf die UC-Rohre. Wenn Sie einen festen Winkelrotor verwenden, markieren Sie die Ausrichtung der Rohre in der Zentrifuge, um das Abrufen des EV-Pellets nach dem UC zu erleichtern. Zentrifuge für 2 h bei 120.000 x g,mit einem k-Faktor von 259,4.
  3. Nach dem UC den Supernatanten vorsichtig mit einem serologischen Piptier ablegen, um eine Störung der pellenden EVs zu vermeiden.
    Achtung: Das Pellet ist unsichtbar.
  4. 200 μL von 0,2 μm gefilterter Phosphat-gepufferten Saline (PBS) in die erste Röhre geben und PBS und das Restsupernatant verwenden, um das Pellet durch Pipetting auf und ab zu reanimieren. Die daraus resultierende EV-Federung auf das nächste Rohr der jeweiligen Probe übertragen und für die Wiederbelebungsrente verwenden. Gehen Sie auf diese Weise fort, um alle EVs der Probe in einem Endvolumen von etwa 300-350 μL wiederzubeleben.
  5. Nach der Wiedererlangung bestätigen Sie das Vorhandensein von Partikeln durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Verwenden Sie die Einstellungen, die für den angegebenen EV-Typ optimiert sind, wie die folgenden Einstellungen (Schritt 2.5.1).
    Hinweis: Die Papiere von Gardiner et al. 27 und Vestadet al. 28 enthalten wertvolle Informationen darüber, wie die Parameter für die Messung von Elektrofahrzeugen optimiert werden können.
    1. Um die unten beschriebenen Ergebnisse zu reproduzieren, verwenden Sie Instrumente (z.B. NanoSight LM14), die mit einem grünen Laser ausgestattet sind. Nehmen Sie drei Videos von 30 s mit einem Bildschirmgewinn von 1,0 und einem Kamerastand von 13 auf. Für die Analyse verwenden Sie einen Bildschirmgewinn von 1,0 und eine Erfassungsschwelle von 5.
  6. Verwenden Sie das Pellet sofort, wenn möglich; Ansonsten bei 4 ° C über Nacht lagern.

3. Glucuronidase-Verkapselung in EVs

  1. In das wiederaufgebrachte Pellet, Beta-Glucuronidase (10 mg/mL in PBS) zu einer Endkonzentration von 1,5 mg/mL und Saponin (10 mg/mL in H2 O)zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/mL hinzufügen. Gut vermischen durch Wirbeln für 3 s.
  2. Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit durchmischtem Mischen durch sanftes Flimieren der Röhre. Nach der Inkubation direkt durch die Größe-Ausschlusschromatographie (SEC) reinigen (siehe Abschnitt 5).
    Hinweis: Glucuronidase-Proben nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren, um eine Enzymabbauung durch das Einfrieren zu verhindern.

4. Liposomproduktion

  1. Zur Vorbereitung der Liposome für den Vergleich mit Elektrofahrzeugen, 1, 2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DMPC) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC) in einer 2:3 Molarenform in Chloroform auf eine Endkonzentration von 5 mM auflösen. Bereiten Sie 1 mL Aliquots in Hochleistungs-Flüssigchromatographien (HPLC) vor und lassen Sie sie über Nacht zu einem Lipidfilm trocknen.
    CAUTION: Chloroform ist giftig und vermutet, dass es sich um eine Cancerogenik handelt. TNeine Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung.
  2. Die Lipidfolie mit 1 mL PBS mit 1,5 mg/mL Glucuronidase erniedrigen. Die Extrudermontage auf 42 ° C erhitzen und die Lipidaufhängung 11x durch eine 200 nm Polycarbonatmembran extrudieren. Direkt durch SEC reinigen (siehe Abschnitt 5).

5. Reinigung durch SEC

  1. Bereiten Sie die SEC-Spalte mit dem folgenden Protokoll vor.
    1. Verwenden Sie nur frisches gereinigtes Wasser und frisch zubereitete Puffer. Alle Puffer durch einen 0,2 μm Membranfilter filtern und entgas geben, um die Bildung von Luftblasen in der Säule zu verhindern.
    2. Für die Herstellung einer SEC-Säule verwenden Sie eine agarose Gel-Filtrationsmatrix (z.B. Sepharose Cl-2b) oder ein anderes SEC-Medium, das geeignet ist, Elektro-und Liposome von Proteinverunreinigungen und überschüssigem Enzym zu trennen. Entfernen Sie zunächst die 20% EtOH-Lösung, in der das Medium gespeichert ist, um eine Luftblasenbildung in der Säule zu verhindern. Zu diesem Zweck zentrifugen Sie das SEC-Medium bei 3.000 x g für 10 min, entfernen Sie die EtOH und ersetzen Sie es durch entgiftetes Wasser.
    3. Füllen Sie eine Glassäule (mit einem Innendurchmesser von 10 mm) mit dem SEC-Medium auf die 15 mL-Marke.
      Hinweis: Die Lautare unterscheiden sich bei Spalten mit unterschiedlichen Abmessungen. Achten Sie darauf, dass sich das Gel vollständig ansiedeln lässt.
    4. Vor einem Durchlauf die Spalte mit mindestens zwei Spaltenbänden PBS ausgleichen. Um die Säule zu lagern, waschen Sie sie zuerst mit einem Säulenvolumen Wasser, gefolgt von mindestens zwei Säulenbänden von 20% EtOH. Nach der Lagerung die Säule zuerst mit einem Säulenvolumen Wasser waschen, bevor Sie mit PBS ausgleichen.
    5. Verwenden Sie bis zu 400 μL EV oder Liposomaufhängung in einer Trennung. Sammeln Sie Bruchteile von 1 mL. Nach SEC lagern Sie entweder die gereinigten Elektrofahrzeuge (siehe Abschnitt 7) oder unterziehen sie einem Glucuronidase-Test (siehe Abschnitt 6).
  2. Bestätigen Sie die Trennung von Elektro-und Liposomen von kontaminierenden Proteinen und freier Glucuronidase. Dazu korrelieren die Partikelkonzentrationen der gesammelten Bruchteile mit der Proteinkonzentration und der Glucuronidase-Aktivität.
    1. Die Partikelkonzentration durch NTA bewerten (siehe 2.5)
    2. Bewerten Sie den Proteingehalt anhand von Bicinchoninsäure-Assay (BCA) oder einem anderen geeigneten Proteinquantifizierungs-Test. Führen Sie den Test nach dem Herstellerprotokoll durch.
    3. Bewerten Sie die Glucuronidase-Aktivität durch Glucuronidase-Assay (siehe Abschnitt 6).
  3. Bewerten Sie optional die EV-Morphologie durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und die Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
    1. Für die Vorbereitung von TEM-Proben, 10 μL EV-Aufhängung in ein TEM-Gitter, Inkubat für 10 min, und dann mit einem Filterpapier überschüssige Flüssigkeit wegzublättern. Führen Sie die Fixierung für 10 min mit 10 μL von 4% Paraformaldehyd und blot away von überschüssigem. 3x mit Wasser waschen. Mit 30 μL von 1% Phosphor-Zungsiesäure-Hydrat werden die Bläschen um 20 s inkubiert. Nach dem Abblenden die Exzesse, trocknen Sie die Bläschen über Nacht. Visualisieren durch TEM.
      CAUTION: Phospho-Täsensäure ist hochgradig ätzend; So schützen Haut und Augen.
    2. Für SEM die zuvor vorbereiteten TEM-Proben auf Carbon-Scheiben fixieren und mit einer 50 nm dicken Goldschicht ausspülen. Visualisieren durch SEM.

6. Glucuronidase Assay

  1. Um einen Vergleich zwischen verschiedenen Proben und Lagerbedingungen durch die Korrelation von Partikelzahl und Enzymaktivität zu ermöglichen, messen Sie zunächst die Partikelkonzentration der Probe durch NTA (siehe Schritt 2.5).
  2. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung für Fluorescein di-β-D-Glucuronide vor, indem Sie 1 μL der Verbindung (10 mg/mL in H2 O)auf 199 μL von PBS hinzufügen. Um eine endgültige Konzentration von 8,3 μg/mL zu erhalten, können Sie 25 μL dieser Lösung auf 125 μL gereinigte Elektroautos hinzufügen. Die Probe in eine schwarze 96-Wellplatte pikieren. Messen Sie den Zeitpunkt 0 h mit einem Plattenleser, mit 480 nm als Anregung und 516 nm als Emissionswellenlänge.
  3. Die Platte fest bedecken (z.B. mit transparenter Kunststofffolie, die für PCR-Platten verwendet wird), um die Verdunstung zu minimieren und im Dunkeln 18 h bei 37 ° C zu inkubieren. Messen Sie die Fluoreszen-Produktion mit den in Schritt 6.2 aufgeführten Plattenleserparametern.

7. Lagerung von Elektro-und Liposomen

NOTE: Für alle Speicherzwecke ist es ratsam, mit niedrig bindenden Rohren den EV-Verlust durch Adsorption zu reduzieren.

  1. Befolgen Sie die Parameter in diesem Abschnitt, um die unten angegebenen repräsentativen Ergebnisse zu reproduzieren. Verwenden Sie Proben, die aus 400 μL EV-Aufhängung bestehen.
    1. Bei 4 ° C oder-80 ° C aufbewahren oder zu den unten aufgeführten Schritten gehen.
    2. Lyophilize die EVs.
      1. Trehalose (40 mg/mL in H2 O)bis zu einer Endkonzentration von 4 mg/mL zu den gereinigten Elektrofahrzeugen hinzufügen. Die Proben bei-80 ° C mindestens 1 Stunde einfrieren.
      2. Lyophilisieren Sie die Proben mit den folgenden Parametern. Für die Haupttrocknung die Regaltemperatur auf 15 ° C und den Druck auf 0,180 mbar stellen und die Proben 46 h trocknen lassen. Für die abschließende Trocknung die Regaltemperatur auf 25 ° C und den Druck auf 0,0035 mbar stellen und die Proben 2 Stunden trocknen lassen.
      3. Um die Proben zu rehydrieren, fügen Sie H2 O hinzu, was der Menge der EV-Aufhängung entspricht, die am Anfang vorhanden ist (typischerweise 400 μL). Verwenden Sie keinen Puffer für die Rehydratation.

8. Analyse nach der Lagerung

  1. Um die Enzymaktivität zu beurteilen, entfernen Sie zuerst die freie Glucuronidase, die während der Lagerung aus dem EVs durchgesickert sein kann. Dies wird durch einen zusätzlichen Reinigungsschritt erreicht, der entweder von SEC (siehe Schritt 5) oder asymmetrischer Strömungsfeldfraktionierung (AF4) durchgeführt wird (siehe Schritt 8.1.2).
    Hinweis: Bitte beachten Sie, dass beide Methoden zu einer Verdünnung der EV-Probe führen; Verwenden Sie also ausreichend EV-Konzentrationen vor der Speicherung, um zu vermeiden, dass Sie sich unterhalb der NTA-Quantifizierungsgrenze bewegen. Erwarten Sie eine 1:10 Verdünnung der Partikel durch SEC oder AF4.
    1. Für die SEC-Reinigung folgen Sie dem oben beschriebenen Protokoll (siehe Abschnitt 5).
    2. Die AF4-Reinigung durchführen.
      1. Das Instrument mit einem kleinen Kanal mit einem 350 μm-Abstandshalter und einer 30 kD-Molekularen Gewichtsabschnitt-Zellulose-Membran einrichten. Legen Sie einen 0,1 μm Porengrößenfilter zwischen der HPLC-Pumpe und dem AF4-Kanal. Verwenden Sie frisch zubereitete 0,1 μm gefilterte PBS als mobile Phase, um die Partikelbelastung und Geräusche in den lichtstreubenden Detektoren zu reduzieren.
      2. Erkennen Sie Proteine mit einem UV-Detektor auf 280 nm. Um Partikel zu erkennen, verwenden Sie die Mehrwinkellichtstreuung mit dem Laser-Set auf 658 nm.
      3. Verwenden Sie die folgende Laufmethode. Vorfokus für 1 min mit einem Fokusfluss von 1 mL/min; Dann 300 μL der Probe mit einer Geschwindigkeit von 0,2 mL/min einspritzen und den Fokusfluss 10 min hochhalten. Nach der Injektion wird die Probe bei 1 mL/min bei einem Kreuzfluss, der von 2 mL/min auf 0,1 mL/min im Verlauf von 8 min abnimmt, abgeltzt. Sammeln Sie Bruchteile von 1 mL, beginnend nach 12,5 min und fortgesetzt bis 27 Minuten.
    3. Führen Sie den Glucuronidase-Test wie oben beschrieben durch (siehe Abschnitt 6).
  2. Um die Größe und Konzentration zu beurteilen, verwenden Sie die NTA wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.5).
  3. Optional können TEM und SEM durchgeführt werden, um die Morphologie des EVitens nach der Lagerung zu beurteilen (siehe 5.3).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Speichereigenschaften von von HUVECs isolierten Elektrofahrzeugen. Die EVs wurden von UC isoliert, die Glucuronidase gekapselt, und nach SEC wurden die gereinigten Elektrofahrzeuge von NTA auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften hin bewertet. Eine Probe der Bläschen wurde anschließend einer AF4-Reinigung unterzogen und die Glucuronidase-Aktivität gemessen.

Die Bläschen wurden dann für 7 d bei 4 ° C oder-80 ° C und bei 4 ° C in lyophilisierter Form ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, um die Stabilität von Elektrofahrzeugen unter verschiedenen Lagerbedingungen zu untersuchen. Mit der Kombination aus verkapselter Glucuronidase als funktioneller Auslesung und der Auswertung der physikalisch-chemischen Parameter der EVs ermöglicht das Protokoll eine einfache Speicherstabilitätsbewertung von Elektroautos und den Vergleich von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Zellen text. SEM und TEM als komplementäre Methoden ermöglichen einen Einblick in ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Das NanoMatFutur Junior Research Programm des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (Fördernummer 13XP5029A) unterstützte diese Arbeit. Maximilian Richter wurde von der Studienstiftung des Deutschen Volkes durch ein Promotionsstipendium unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-cholin (DMPC)Sigma-AldrichP2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-cholin (DPPC)Sigma-AldrichP4329-25MG
225 cm² ZellkulturkolbenCorning431082Verwendung mit 25 ml Medium
30 kDa regenerierte ZellulosemembranWyatt Technology Europe1854
350 &Mikro; m AbstandhalterWyatt Technology Europe
Automatisierter FraktionssammlerThermo Fisher Scientific
Beta-GlucuronidaseSigma-AldrichG7646-100KU
ChloroformFisher scientificC/4966/17
SäulenofenHitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose-DihydratSigma-AldrichT9531-10G
DAWN HELEOS II, Mehrwinkel-Lichtstreudetektor Wyatt Technology Europe
Durapore Membranfilter, PVDF,  0,1  &Mikro; m, 47  mmMerckVVLP04700Wird zur Vorbereitung von Puffern für AF4
EBM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3156Basalmedium für das Wachstum von Endothelzellen, das für die serumfreie Kultur von HUVEC-Zellen verwendet
wird Eclipse dualtecWyatt Technology Europe
EGM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3162Endothelzell-Wachstumsmedium, verwendet für die normale Kultur von HUVEC-Zellen
ELISA-PlattenversiegelungenR& D SystemsDY992zur Versiegelung von 96-Well-Platten für den Glucuronidase-Assay
EthanolFisher scientificE/0665DF/17
Extruder Set mit Halter/HeizblockAvanti Polar Lipids610000-1EA
FilterträgerAvanti Polar Lipids610014-1EAzur Liposomenvorbereitung
Fluorescein di-β-D-GlucoronidThermo Fisher ScientificF2915
Gibco PBS-Tabletten+CA10:F36Thermo Fisher Scientific18912014
Hettich Universal 320 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGWird zum Pelletieren von Zellen bei 300 g
verwendet Hettich Rotina 420 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGWird zum Pelletieren von größeren Abfällen bei 3000 g
verwendet HUVEC ZellenLonza Verviers, S.p.r.C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CMKimble420401-1030
Lyophilisierer ALPHA 2-4 LSCChrist
Mikrozentrifugenröhrchen, PolypropylenVWR international5255die Röhrchen, die für alle EV-Handhabungen verwendet werden, erwiesen sich als günstiger als vergleichbare Produkte anderer Anbieter in Bezug auf die Partikelrückgewinnung
Nanosight LM14 ausgestattet mit einem grünen LaserMalvern Pananalytical
Nanosight-Software Version 3.1Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm Track-Etch Polycarbonat-MembranenWhatman/GE Healthcare110406für die Liposomenpräparation verwendet
PEEK Inline-FilterhalterWyatt Technology Europe
PhosphotungssäurehydratSigma-Aldrich79690-25G
Polycarbonat-Flaschen für die UltrazentrifugationBeckman Coulter355622
QuantiPro BCA Assay KitSigma-AldrichQPBCA-1KT
SaponinSigma-Aldrich47036
Rasterelektronenmikroskopie Zeiss EVO HD 15Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2bGE Gesundheitswesen17014001
REM Kupfer Gitter mit KohlenstofffoliePlanoS160-4
Kleiner AF4-KanalWyatt Technology Europe
Sputter-Coater Q150R ESQuorum Technologies
Transmissionselektronenmikroskopie JEOL JEM 2011Oxford Instruments
Typ 45 Ti UltrazentrifugationsrotorBeckman Coulter339160
Ultimate 3000 Dionex AutosamplerThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isokratische PumpeThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex Online-VakuumentgaserThermo Fisher Scientific
Ultrazentrifuge OptimaTM L-90 KBeckman Coulter
UV-DetektorThermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 &Mikro; Mischzellulosefilter mit PorengrößeWhatman/GE Healthcare10401712Wird für die Filtration aller Puffer verwendet, die mit Elektrofahrzeugen und in SEC verwendet werden
verwendet

Referenzen

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450(2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746(2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356(2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259(2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190(2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465(2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377(2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671(2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Asymmetrische FeldflussfraktionierungGrößenausschlusschromatographieBeta-Glucuronidase-VerkapselungNanopartikel-Tracking-AnalyseTransmissionselektronenmikroskopieLyophilisierungsprotokollEnzymaktivitätsassayPartikelrückgewinnungsmessung
Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.