Herstellung von Amyloid---Sekret alginat Mikroperlen für den Einsatz bei der Modellierung der Alzheimer-Krankheit

Die Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen ist aufgrund der komplexen und komplizierten Natur des Gehirns eine Herausforderung. Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) wird angenommen, dass der fortschreitende Verlust der synaptischen Funktion und der Tod von Neuronen eine nachgelagerte Wirkung einer anhaltenden Überproduktion und Akkumulation von Amyloid-Beta-Peptiden nach abnormaler Verarbeitung des Amyloid-Vorläufers sind. Protein (APP) nach der Amyloid-Kaskadenhypothese¹.

Um die Mechanismen dieser Amyloid-induzierten Pathologie zu verstehen und bei der Identifizierung neuartiger Behandlungsziele zu helfen, haben Wissenschaftler verschiedene in vivo präklinische Modelle entwickelt. Eine Kategorie von Modellen nutzt eine Bolus-Injektion eines synthetischen A-Peptid in das Rattenhirn^2,3,4. Die Hauptbeschränkung solcher Modelle ist, dass sie auf einem Einzigen-Punkt-oder wiederholten Behandlungen mit A-Peptiden in hohen Konzentrationen in einem Rutsch abgelagert verlassen. Dies steht im Widerspruch zu der chronischen, anhaltenden Natur der Freisetzung von Aa bei Krankheit⁵. Eine weitere Kategorie von In-vivo-Modellen sind transgene Tiermodelle, ^{die eine oder mehrere genetische Mutationen im Zusammenhang mit den familiären Variationen der Krankheit 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. Da jedoch die familiäre AD nur weniger als 5 % aller Alzheimer-Fälle^{ausmacht 11}, ist die Relevanz dieser Modelle bei der Übersetzung in sporadische AD beim Menschen fraglich¹². Ein weiterer Nachteil des transgenen Ansatzes ist die beschleunigte A-Formation von Geburt an, die sich in Defiziten in der kognitiven Funktion und pathologischen Veränderungen zu schnell und aggressiv niederschlägt, um das Fortschreiten der Krankheit bei sporadischen Ad bei Patienten zu ähneln¹² . Zum Beispiel produziert das 5x FAD-Modell Plaques in nur 1,5 Monaten¹³.

Interessanterweise führen beide Kategorien zu Veränderungen der kognitiven Funktion von Relevanz für ad Forschung^2,3,4,5,6, und manchmal werden sie von der Auftreten von pathologischen Kennzeichen der Krankheit wie Amyloid Plaques^6,8, Tau Phosphorylation^6,7 und/oder synaptischen und neuronalen Verlust^{7,9, 14}. Aber während diese Arten von Modellen uns einen Einblick in die Auswirkungen hoher Amyloidkonzentrationen im Gehirn geben können, die oft mit späteren Stadien von AD in Verbindung gebracht werden, spiegeln sie nicht die früheren Veränderungen wider, die als Reaktion auf die chronische und anhaltende Exposition gegenüber dem A- Peptid¹², wie z. B. veränderte Expression von synaptischen Markern¹⁵ und Komponenten in der extrazellulären Matrix¹⁶. Daher besteht nach wie vor die Notwendigkeit, ein chronisches Modell zu erstellen, das die Auswirkungen einer anhaltenden A-Sekretion auf die In-vivo-Kognition genauer veranschaulicht und Veränderungen in der Pathologie veranschaulicht.

Zu diesem Zweck haben wir ein System entwickelt, das die konstante, nachhaltige Sekretion von Aa in kontrollierter Weise ermöglicht, indem amyloid-sekretionszellen in Hydrogel-Mikroperlen immobilisiert werden, die anschließend innerhalb des erwachsenen Rattengehirns implantiert werden können, um Aspekte zu modellieren. sporadisch AD.

Alginat war das ausgewählte Biomaterial, da es biokompatibel ist und keine unerwünschten Reaktionen induziert, wenn es in vivo¹⁷implantiert wird. Die Zellverkapselung in Alginathydrogelen hat sich in den letzten vier Jahrzehnten gut etabliert. Das erste Beispiel für seine Übersetzung in die Klinik wurde für die Behandlung von Typ-1-Diabetes mellitus¹⁷berichtet. Der früheste Bericht über die erfolgreiche Verkapselung von Inselchen von Langerhans stammt aus dem Jahr 1980. Die Transplantation von Mikroperlen, die Insulin-Sekretzellen enthalten, revolutionierte die Behandlungsmöglichkeiten für Diabetiker, da sie die Bauchspeicheldrüsenfunktion wiederhergestellt enden, wodurch die Notwendigkeit einer Insulininjektionstherapie entfällt¹⁸. Diese Arbeiten berichten darüber, wie die Zellverkapselung sie vor äußeren Belastungen, ob mechanisch oder chemisch, schützen kann. In der Tat, Alginat Perlen wirken als Barriere und isolieren Zellen aus der Umgebung erhaltung ihren Phänotyp, während ausreichend Zugang zu den umgebenden Medien für Nährstoffe und Clearance der zellulären Nebenprodukte¹⁹. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Alginat den Abgleich der mechanischen Eigenschaften von Weichgewebe²⁰. Alginat-Hydrogele können auf eine Steifigkeit von 1-30 kPa abgestimmt werden, indem die Alginatkonzentration und die Vernetzungsdichte^20,21einfach variiert werden. Dies ist ein wesentlicher Aspekt, nicht nur um die phänotypische Expression von verkapselten Zellen in vitro zu erhalten, sondern auch um entzündliche Effekte nach der Enpfropftierung in vivo²²zu vermeiden.

In diesem Protokoll werden 7PA2-Zellen - eine chinesische Hamster-Ovarialzelllinie, die stabil mit einem menschlichen APP V717F mutierten Gen²³ transfiziert wird - verwendet. Diese Zellen produzieren kontinuierlich katalytische Produkte von APP, einschließlich A-_1-42^24,25, und wurden verwendet, um A a als Alternative zur synthetischen Produktion in präklinischen, akuten in vivo Studien zu erzeugen²⁶. Wir beschreiben eine Herstellungsmethode zur Immobilisierung von 7PA2-Zellen in "weichen" Alginat-Mikroperlen, die die nachhaltige Sekretion von Biomolekülen ermöglichen. Als Proof of Concept berichten wir über die Freisetzung des Peptids A_1-42 im Laufe der Zeit. Das verwendete Alginat ist ein niedrigviskoses Alginat mit einem Molekulargewicht von 120.000-190.000 g/mol und einem mannuronischen zu guluronischen Verhältnis von 1,56 (M/G).

In weiteren Studien können diese Mikroperlen sicher innerhalb von Regionen des Rattenhirns transplantiert werden, die für AD relevant sind (z.B. der Hippocampus), um die Auswirkungen der chronischen A-Sekretion auf das Verhalten in vivo und die Pathologie ex vivo zuuntersuchen. Darüber hinaus kann dieses System verwendet werden, um die Auswirkungen der chronischen A-Freisetzung in In-vitro- und Ex-vivo-Anwendungen zu untersuchen. Zum Beispiel können 7PA2-haltige Alginat-Mikroperlen in vitro mit neuronalen oder astrozytischen Kulturen kokultiviert werden, um die Auswirkungen der chronischen A-Exposition auf zelluläre Mechanismen im Zusammenhang mit AD zu bewerten. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um den Zusammenhang zwischen chronischer A-Produktion und Langzeitpotenzierung in der Ex-vivo-Elektrophysiologie zu untersuchen.

Das Highlight dieses Protokolls ist die Modularität und Flexibilität der Fertigungsmethode, die die Herstellung von Alginatperlen mit einer Zieldimension durch Feinabstimmung der Fertigungsparameter ermöglicht. Je nach Anwendung kann das Protokoll angepasst werden, um maßgeschneiderte Ziele in Bezug auf Mikroperlengröße, Dichte der gekapselten Zellen und Mikroperlensteifigkeit zu erhalten. Dieses Protokoll kann für die Verkapselung einer Vielzahl von Zelltypen verwendet werden, wodurch relevantere dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle entwickelt werden, um verschiedene Pathologien zu untersuchen. Wir berichteten vor kurzem darüber, wie Alginat-verkapselte Zellen verwendet werden können, um frühe Stadien der Krebsprogression zu modellieren²⁰.

Das Konzept des Verkapselungsprozesses basiert auf der Extrusion eines laminaren Strahls von Zellen, die in Alginatlösung durch eine Düse schweben. Ein vibrierender Kopf stört den Jet mit einer kontrollierten Frequenz, was zu gleich großen Tröpfchen auf Alginatbasis führt. Ein externes elektrisches Feld ermöglicht die Trennung der gebildeten Alginat-tröpfchen, die bei Kontakt mit einer mit divalenten Ionen angereicherten Lösung, wie z.B. Kalziumionen, schnell miteinander vernetzen können, wobei ihre kugelförmige Form erhalten bleibt. Die Inkubation in der Gelationslösung ermöglicht die Bildung von kugelförmigen Mikroperlen, die Zellen in einem homogenen physikalischen Hydrogel^{enthalten 27}. Die Zielgröße von Mikroperlen und Alginathydrogelen ermöglicht den Nährstoff- und Sauerstoffaustausch mit Zellkulturmedien über einen längeren Zeitraum (Wochen). Abbildung 1 Eine zeigen eine schematische Darstellung des verwendeten Verkapselungsapparates (Abbildung 1B).

Abbildung 1 : Das Verkapselungssystem. (A) Schematische Darstellung des Kapselungssystems. Eine Alginat-Zellsuspension wird in eine Spritze (2) geladen und mit einer Extrusionsgeschwindigkeit an der Spritzenpumpe (1) durch ein Reservoir geleitet. Im Reservoir vibriert ein Vibrationshut (3) bei einer Frequenz, die von einem Wellenformgenerator (4) eingestellt wird, um den Strom in gleichen Intervallen zu stören und gleich große Tröpfchen zu bilden. Da die Lösung durch eine Düse (5) gespeist wird und Tröpfchen gebildet werden, wird ein elektrostatisches Potential über eine Elektrode (7) aufgebracht, die von einem Spannungsgenerator (6) eingestellt wird, der die Oberfläche der Tröpfchen leicht auflädt, so dass sich der Strom infolge der Abstoßung ausbreiten kann. elektrostatischeKräfte. Wenn Tröpfchen mit dem Gelationsbad (8) interagieren, führt die von Ca²⁺gesteuerte Vernetzung von Alginat zur Bildung von kugelförmigen Mikroperlen. (B) Foto des Verkapselers vor der Herstellung von Alginat-Mikroperlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Größe der Mikroperle kann je nach Verwendungszweck verändert werden. Um die Größe der Mikroperle zu kontrollieren, werden die verschiedenen parameter, die in Abbildung 1A und im Protokoll beschrieben sind, entsprechend angepasst. Der Innendurchmesser der verwendeten Düse hat einen erheblichen Einfluss auf die Größe der Tröpfchen; Die weitere Anpassung der Verkapselungsparameter, nämlich Extrusionsgeschwindigkeit, Schwingungsfrequenz und Spannung, ist der Schlüssel zu einer konsistenten Größenverteilung. Tabelle 1 beschreibt, wie die verschiedenen Parameter die Größe von Mikroperlen ändern können, die mit diesem System erreicht werden.

Parameter	Düsengröße	Schwingungsfrequenz	Durchflussrate	Elektrodenspannung
Perlengröße				–

Tabelle 1: Herstellungsparameter und deren Einfluss auf die Größe der Mikroperle. Die Tabelle zeigt, wie jeder Parameter die resultierende Größe der hergestellten Mikroperlen beeinflussen kann, unabhängig von der Düse und der Viskosität der verwendeten Lösung.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie 100 ml von 4 % (w/v) Alginat-Stammlösung vor.
   1. 4,4 g Alginat-Natriumsalz wiegen und das Trockenpulver zu 100 ml HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) mit 150 mM NaCl (0,877 g) in entionisiertem Wasser hinzufügen, das eine Hydratation ermöglicht.
   2. Verwenden Sie einen Magnetrührer mit einer Geschwindigkeit von 500 Umdrehungen pro Minute (Rpm) und erhitzen Sie bis zu 50 °C, um eine vollständige Alginathydratation zu ermöglichen.
      HINWEIS: Das Alginat kann ein oder zwei Stunden benötigen, um vollständig hydratisiert zu werden. Um Zeit zu sparen, kann die Alginatlösung einen Tag vor dem Verkapselungsprotokoll gebildet und bei 4 °C bis zum nächsten Tag gelagert werden. Wenn Alginat gekühlt wurde, vorsichtig auf 37 °C mit einem Wasserbad oder einer Kochplatte erhitzen und unmittelbar vor Gebrauch mit einem Magnetrührer rühren.
   3. Steriler Filter der Alginatlösung mit einem 0,22 m Porenpolyethersulfon (PES) Filter vor Gebrauch. Eine Filterung wird bei 37 °C empfohlen, um einen einfachen Fluss von Alginat zu ermöglichen. Die Viskosität steigt, wenn die Temperatur sinken darf.
2. Bereiten Sie 1.000 ml von 0,5 M CaCl₂vor.
   1. Wiegen Sie 55,49 g wasserfreien CaCl₂ und lösen Sie sich in 1.000 ml HBS auf (20 mM HEPES und 150 mM NaCl in 1.000 ml entionisiertem Wasser).
   2. Sterilfilter mit einem 0,22-mm-Poren-PES-Filter.
3. 100 ml Auflösungsmischung vorbereiten.
   1. Bereiten Sie eine 100 mM HEPES (23,83 g) und 500 mM Trinatriumcitrat-Dihydrat (147,05 g) Lösung in phosphatgepufferter Salin vor.
   2. Stellen Sie sich mit NaOH oder HCl auf pH 7.4 ein.

2. Einrichten des Verkapselungssystems

1. Reinigen Sie die laminare Durchflusshaube.
   1. Sterilisieren Sie die laminare Durchflusshaube, die den Verkapselungskondensator enthält, mit UV-Exposition, gefolgt von Spritzen mit 70% v/v Ethanollösung.
   2. Spülen Sie das Verkapselungssystem mit 10 ml 70% v/v Ethanollösung gefolgt von 10 ml sterilem entionisiertem Wasser.
   3. Befestigen Sie die 300 m Düse und wiederholen Sie Schritt 2.1.2.
   4. Sprühen Sie die Flasche mit der gefilterten Alginatlösung, die Flasche mit gefilterter Calciumchloridlösung und allen Werkzeugen, Geräten und leeren Kulturplatten, die mit 70 % v/v Ethanollösung verwendet werden, und legen Sie sie in die laminare Durchflusshaube. Vor der Verwendung ein UV-Licht für 30 min wieder einschalten, um gründlich zu sterilisieren.
   5. Bereiten Sie einen Mitbecher mit einer biologischen Desinfektionslösung auf und legen Sie den Becher in die Haube.
   6. Füllen Sie ein Becherglas mit 100 ml steriler CaCl₂ (wässriger) Lösung und fügen Sie einen magnetischen Rührer hinzu. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 100 Rpm ein. Legen Sie das Becherglas auf eine magnetische Plattform in einer Höhe von 18 cm von der Spitze der Düse. Dieser Becher wird verwendet, um Alginat-Perlen zu sammeln und ihre Gelation zu ermöglichen.
2. Bereiten Sie Zellen für die Kapselung vor.
   1. Entfernen Sie Zellen aus dem Inkubator und lösen Sie sich mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung vom konfluenten Kolben und inkubieren Sie bei 37 °C für 5-10 min.
   2. Isolieren Sie eine Probe zur Schätzung der Zelldichte und zentrieren Sie dann die verbleibenden Zellen bei 1.000 U/min für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.
   3. Das Pellet in HBS (20 mM HEPES und 150 mM NaCl) wieder aufheben, um die endgültige gewünschte Zellkonzentration zu verdoppeln (z. B. für eine Endkonzentration von 1,5 x 10⁶ Zellen/ml, setzen Sie die Zellen in HBS wieder auf, um eine Konzentration von 3 x 10⁶ Zellen/ml zu erreichen).
   4. Mischen Sie in einem 50 ml Zentrifugenrohr die Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit einer Alginatlösung von 4 % (w/v), um eine Endsuspension mit der gewünschten Zellkonzentration (z. B. 1,5 x 10⁶ Zellen/ml) in einer Alginatlösung von 2 % (w/v) zu erhalten.
3. Legen Sie die Kapselungsparameter fest.
   1. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Verkapselungsmaschine auf die maximale Extrusionsgeschwindigkeit (8,9 ml/min), die Spannung auf 1,0 kV und die Frequenz auf 5.500 Hz ein.
      HINWEIS: Diese Parameter wurden zuvor optimiert, um Mikroperlen mit einem Durchmesser von 550 m zu erhalten.

3. Herstellung

1. Fertigen Sie die Mikroperlen.
   1. In einer 20 ml Spritze 5 ml der Zellalginatsuspension beladen und eine Spritze am Verkapselungsmittel befestigen.
   2. Starten Sie den Verkapselungskörper, indem Sie den Durchfluss aktivieren, der die Zellalginatsuspension durch den Feeder drückt. Ein Strom von Tröpfchen wird durch die Düse extrudiert.
   3. Sammeln Sie die ersten 1 ml im Abfallbecher, um den anfänglichen ungleichmäßigen Strom zu löschen.
   4. Fahren Sie die restlichen 4 ml weiter, sodass die Tröpfchen in das CaCl 2-Gelationsbad fallen können. Jeder Milliliter kann separat (aber sukzessive) ausgeführt und bei Bedarf in vier verschiedenen Gelationsbädern gesammelt werden.
      HINWEIS: Bei Kontakt mit dem Gelationsbad vernetzen sich die Alginatinatinin in den Tröpfchen sofort mit den Kalziumionen im Gelationsbad und bilden kugelförmige Mikroperlen.
   5. Nach einer Minute, entfernen Sie das Gelationsbecher von der magnetischen Plattform und lassen Sie die Mikroperlen für weitere 4 minuten ohne Rührung sitzen (Zeit notwendig, um eine vollständige Gelation über die Mikroperlen bei Raumtemperatur zu ermöglichen).
2. Holen Sie mikroperlen ab.
   1. Entfernen Sie alle großen Alginat-Trümmer oder Artefakte mit einer sterilen Pinzette, und verwenden Sie dann eine sterile Kunststoffpipette, um sie in einen 74-mm-Netzfilter zu übertragen, um die Mikroperlen aus dem Gelationsbad abzurufen.
   2. Übertragen Sie die Mikroperlen mit dem entsprechenden Kulturmedium in ein Zentrifugenrohr und lassen Sie sie 5 min im Zellkulturmedium ausdematrieren.
   3. Auf eine Kolben-, Teller- oder Petrischale zur Inkubation und weitere Experimente übertragen.
      HINWEIS: Gelationsbad sollte nicht wiederverwendet werden.

4. Prüfung und Verwendung von Mikroperlen

1. Testen Sie die Qualität der Mikroperlen.
   1. Um die Zelllebensfähigkeit (oder andere biologische Auslesungen) nach Verkapselung und Kultur zu bewerten, stören Sie die Mikroperlen vorsichtig, um die gekapselten Zellen mithilfe des Auflösungsmixes freizusetzen.
      HINWEIS: Das erforderliche Volumen der Auflösungsmischung hängt von der Anzahl der pro Test verwendeten Mikroperlen ab. Eine empfohlene Ration beträgt 4 ml Auflösungsmischung zu jeder 1 ml gekapselten Zellen. Dieser Schritt muss nur an einer einzigen Probe für jede Mikroperlenpopulation durchgeführt werden.
   2. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator, ergänzt mit 5%_CO2 bei 37 °C für 10 min.
   3. Schätzen Sie die Zelllebensfähigkeit für Zellen, die jetzt wie üblich in Lösung sind, indem Sie Zellen mit Trypanblau färben und eine Hämozytometerkammer verwenden.
      HINWEIS: Wenn sie automatisierte Zellzähler für Schätzungen der Zelllebensfähigkeit verwenden, sollte darauf geachtet werden, dass Alginatartefakte die Anzahl stören. In diesen Fällen wird die Naualzellzählung empfohlen.
   4. Um die Stabilität von Mikroperlen zu bewerten, messen Sie den durchschnittlichen Durchmesser für eine Probe aus jeder Mikroperlenpopulation über einen Zeitverlauf mit einem Mikroskop und einer Bildgebungssoftware. Dramatische Nachleinen des Durchmessers können auf einen Alginatabbau hindeuten.
2. Verwenden Sie Mikroperlen für die Erkennung von abgesonderten A.
   1. Probenzellkulturmedien aus 7PA2-Zellen, die in Standardbedingungen (2D) in 24-Stunden-Intervallen kultiviert werden und zur weiteren Analyse bei -20 °C speichern.
   2. Beispielzellkulturmedien aus gekapselten 7PA2-Zellen, die in Standardbedingungen (3D) in 24-Stunden-Intervallen kultiviert werden und zur weiteren Analyse bei -20 °C speichern.
   3. Nachweis der Sekretion von Aa von 7PA2-Zellen in gesammelte konditionierte Medien durch enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) (Abbildung 4).
3. Verwenden Sie die Mikroperlen für weitere Untersuchungen in relevanten Anwendungen.
   HINWEIS: Verkapselte 7PA2-Zellen können verwendet werden, um die Auswirkungen einer anhaltenden A-Sekretion in einem oder einem Modell zu bewerten.
   1. Für Mikroperlentransplantation innerhalb der Ratte Hippocampus in Gehirnen, erzeugen 1 mm dicke koronale Abschnitte der Ratte Gehirn und verwenden chirurgische Werkzeuge, um Mikroperlen in den gewünschten Bereich einfügen (Abbildung5).
   2. Verkapseln Sie verschiedene Zelltypen in Alginat-Mikroperlen nach den beschriebenen Protokollen, um die nachhaltige Freisetzung der Biomoleküle von Interesse zu bewerten. Relevante In-vitro- und In-vivo-Systeme können weiter modelliert werden.
   3. Detektieren Sie die Expression membrangebundener Marker von gekapselten Zellen mithilfe von Durchflusszytometrie und/oder Immunfluoreszenz.
      HINWEIS: Ein Beispiel für die Verwendung einer ähnlichen Methode zur Herstellung von Mikroperlen, die frühe Stadien des Tumormassenwachstums und der Biomarkerexpression modellieren, wird von Rios ²⁰beschrieben.

7PA2-Zellen werden erfolgreich in Alginat-Mikroperlen verkapselt
Nach der Vorbereitung werden mit diesem Protokoll erfolgreich einheitliche und sphärische Alginat-Mikroperlen erzeugt. Die Bilder in Abbildung 2A unten zeigen ein Beispiel dafür, wie das Ändern eines der Parameter (d. h. Spannung) den Fluss und die Streuung des Alginattröpfchenstroms verändert. Abbildung 2 B zeigt ein Beispiel für erhaltene Alginatperlen unmittelbar nach dem Gelationsprozess.

Abbildung 2 : Optimierung der Fertigungsmethode. (A) Fotos, die Veränderungen in der Strömungsdispersion zeigen. (B) Hellfeldbild mit alginatsphärischen Mikroperlen unmittelbar nach der Herstellung. (C) Beispiel für Optimierungsschritt: Abstimmung ausgewählter Fertigungsparameter, um die Zielgröße der Mikroperle zu erreichen. Ausgewählte Diagramme zur Veranschaulichung der Beziehung zwischen den einzelnen Parametern und der Größe der resultierenden Mikroperlen (Größenverteilung von mindestens n = 100 Mikroperlen). Beachten Sie, dass der Düseninnendurchmesser, die Viskosität der ausgeworfenen Lösung und die Gelierbedingungen auch die Größe der hergestellten Perlen beeinflussen können. Fehlerleisten stellen S.D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das beschriebene Protokoll ist flexibel und ermöglicht die Herstellung unterschiedlicher Größen von Alginat-basierten Mikroperlen, die je nach Anwendung unterschiedlich in der Zusammensetzung sind. In Abbildung 2Cberichten wir über den Einfluss von Alginatdurchfluss, Spannung und Frequenz auf die Mikroperlengröße mit einer 2% (w/v) Alginatlösung in HEPES (pH 7.2), die durch eine 300 m Düse extrudiert wird.

Da der Umfang dieser Studie darin bestand, Mikroperlen herzustellen, die in das Rattenhirn eingebettet werden können, haben wir die Fertigungsparameter angepasst, um einen durchschnittlichen Mikroperlendurchmesser im Bereich von 500-600 m zu erhalten. Für Die Qualitätskontrolle wurde die Methode optimiert, um eine minimale Variabilität über die Grundgesamtheit der hergestellten Perlen zu haben (d. h. eine geringe Größenverteilung). Bitte beachten Sie, dass (1) produzierte Perlen in das Rattenhirn mit einer Hamilton-Spritze mit einer 20G-Nadel injiziert werden können; und (2) eine Hemisphäre des Rattenhirns kann bis zu zwei oder drei Perlen dieser Größe beherbergen.

Nach der Optimierung ergab die Verkapselung von 7PA2-Zellen in einer Konzentration von 1,5 x 106 Zellen/ml, die in einer 2% (w/v) Alginatlösung mit HEPES gepuffert und in einem 0,5 M Calciumchlorid-Gelationsbad abgelegt wurden, die gewünschten Mikroperlen. Abbildung 3 Eine unten zeigt gekapselte 7PA2-Zellen gleichmäßig in Mikroperlen nach einem Tag in Standard-ZellkulturBedingungen verteilt. Die 7PA2-Zellproliferation wurde mit einem MTS-Assay gemäß Herstellerprotokoll getestet. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Verhalten von 7PA2-Zellen, die mit oder ohne Alginat über einen Zeitraum von sieben Tagen angebaut wurden (Abbildung 3B). Bei der Inkubation von gekapselten Zellen unter Standardkulturbedingungen wird erwartet, dass sich die Zellen während der Dauer des Experiments weiter ausbreiten, und es ist daher mit kleinen Graden des Zellaustritts zu rechnen, wie in anderen Werken berichtet28. Die Auswirkungen können dadurch gemildert werden, dass sie bei einer geringeren Zelldichte verkapselt werden oder die Serumkonzentration, in der Mikroperlen inkubiert werden, reduziert werden.

Abbildung 3 : Gekapselte 7PA2-Zellen. (A) Hellfeldbild von gekapselten 7PA2-Zellen, die eine gleichmäßige Zellverteilung in der Alginat-Mikroperle zeigen. Fertigungsparameter wurden so eingestellt, dass 150 7PA2-Zellen pro Perle erhalten werden. Über 7 Tage Kultur wurden keine signifikanten Unterschiede bei Alginatperlen beobachtet. (B) Es gab keinen beobachteten Unterschied zwischen der Gesamtproliferation von 7PA2-Zellen, die mit Alginat inkubiert wurden, im Vergleich zu Zellen, die ohne Alginat inkubiert wurden. 7PA2-Zellen wachsen und wandern über das Volumen der Alginatperlen; Verringerung der Serumkonzentration kann als Verlangsamung des Zellwachstums angesehen werden. Fehlerleisten stellen S.D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Alginat-Mikroperlen, die 7PA2-Zellen verkapseln, sind im Laufe der Zeit stabil
Um die Größe und Form der erhaltenen Alginat-Mikroperlen zu untersuchen, wurde nach der Herstellung und Gelation eine Mikroskopanalyse durchgeführt. Der durchschnittliche Durchmesser für die Mikroperlen, die mit dem ausgewählten Protokoll erhalten wurden, beträgt 550 x 2 m.

Theoretisch kann die Anzahl der Zellen, die in einer Mikroperle mit einem Durchmesser von 550 m erwartet werden, wie folgt berechnet werden:

wobei V = Volumen und r = Radius. Das Volumen einer einzelnen Mikroperle ist V = 8,8 x 10-5 ml; daher die Anzahl der Zellen pro Mikroperle zum Zeitpunkt der Verkapselung = (1,5 x 106) x (8,8 x 10-5) bei 130 Zellen.

Experimentell haben wir die Anzahl der gekapselten Zellen unmittelbar nach der Herstellung gezählt. Alginatperlen wurden mit dem Auflösungsmix sanft gestört und Zellen mit Trypanblaulösung gefärbt. Die Lebensfähigkeitsschätzung und -zählung der Zellen wurde mit einem Hämozytometer durchgeführt; Die erzielten Ergebnisse zeigten durchschnittlich 116 x 17 lebende Zellen pro Mikroperle (n = 5, Daten nicht gemeldet). Wie erwartet wurde unmittelbar nach der Verkapselung ein geringer Unterschied zwischen theoretischer und experimenteller Zellzahl beobachtet. Für einige Anwendungen, und insbesondere um die Menge der freigegebenen A a im Laufe der Zeit zu bestimmen, ist es wichtig, die Anzahl der Zellen in jeder Alginat-Perle gekapselt vorherzusagen.

Interessanterweise hat der Verkapselungsprozess keinen signifikanten Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit. Ergebnisse werden in einer früheren Arbeit berichtet, in der Darmkrebszellen (d. h. HCT-116) mit einer ähnlichen Methode gekapselt wurden, ohne Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit in Alginat-Mikroperlen im Vergleich zu 2D-Kontrollen20.

Um die Stabilität des bei der Verkapselung verwendeten Alginats zu messen, haben wir Mikroperlendurchmesser über einen Zeitraum von 14 Tagen (n = 100) gemessen. Es wurden 14 Tage nach der Verkapselung keine Veränderungen des durchschnittlichen Durchmessers im Vergleich zu unmittelbar nach der Verkapselung beobachtet (Daten wurden nicht gemeldet).

Gekapselte 7PA2-Zellen geben im Laufe der Zeit A- frei
Konditionierte Medien, die aus 2D- und 3D-Kulturen von 7PA2-Zellen analysiert werden, zeigen einen konstanten Anstieg derA-1-42-Spiegel. Zellkulturmedien wurden alle 24 Stunden und bis zu vier Tage abgetastet und mit ELISA analysiert. Unsere Daten zeigen, dass die Freisetzungsrate von A1-42 aus Mikroperlen (3D) im Profil der aus der 2D-Kultur freigesetzten rate ist (Abbildung 4).

Abbildung 4 : Rate derA-1-42-Sekretion aus 7PA2-Zellen. (A) Die A-Freisetzung (% normalisiert nach 4 Tagen) aus 2D- und 3D-In-vitro-Modellen hat ein ähnliches Profil. Beide Modelle weisen über den Zeitraum von vier Tagen einen konstanten Anstieg des A-Niveaus auf, und wie erwartet wird eine stetige Konzentration nicht erreicht. (B) Die Konzentration von A1-42 normalisierte sich auf die Anfangszellzahl und zeigte eine ähnliche Sekretion von A1-42 im Laufe der Zeit, unabhängig von den Kultivierungsmethoden. Weder das Vorhandensein von Alginat noch der Prozess der Verkapselung (3D-In-vitro-Modell) verändern die Sekretion von A1-42. Fehlerleisten stellen S.D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mögliche Anwendung von gekapselten 7PA2-Zellen
Wir berichten, dass 7PA2-Zellen, die in Alginat-Mikroperlen eingekapselt sind, effektiv für die nachhaltige Freisetzung von A1-42verwendet werden können und daher verwendet werden, um die Wirkung der chronischen A-Sekretion in jedem präklinischen Modell zu testen. In Abbildung 5 unten zeigen wir die Vorteile der Verwendung von Alginat-Mikroperlen, die leicht injiziert werden können und sich im Gehirn einer Ratte befinden. Ex-vivo-Abschnitte werden hier zu Illustrationszwecken verwendet, indem eine Millimeter-Alginatperle mit hergestellten Alginat-Mikroperlen verglichen wird.

Abbildung 5 : Verwendung von Mikroperlen für relevante präklinische Anwendungen. Mikroperlen für die Transplantation in das Rattenhirn müssen klein genug sein, um eingebettet zu werden, ohne eine Läsion zu groß zu erzeugen, um Schäden am Bauchdeschym des Gehirns zu vermeiden und die normale Gehirnfunktion zu beeinträchtigen. Bild (A) zeigt einen Größenvergleich zwischen einer millimetergroßen Perle und einer Mikrometer-Skala nebeneinander. (B) Das Implantieren einer millimetergroßen Perle im Gehirn für In-vivo-Zwecke würde nicht funktionieren. Bild (C) zeigt eine Mikroperle, die mit diesem Protokoll hergestellt wurde. Die Größe eignet sich zum Einsetzen in den Hippocampus der Ratte, ohne eine nachteilige Wirkung auf die normale Physiologie zu haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die obigen Bilder unterstreichen die Bedeutung der Kontrolle der Größe der Mikroperle für solche Studien. Hier zeigen wir den Vorteil der Verwendung von Mikroperlen mit Durchmessern unter 600 m. Dies ermöglicht die Verwendung von minimal-invasiver Injektion (z. B. Hamilton-Spritze), um die Position der injizierten Perlen im Gehirn besser zu kontrollieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verkapselung von 7PA2-Zellen die Kontrolle über die Größe von Mikroperlen, die Anzahl der gekapselten Zellen und die Vorhersage von Aa gibt, das von den Mikroperlen abgesondert wird (z. B. Konzentration, Freisetzungsprofil). Die Kontrolle der Größe der Mikroperlen ist aus zwei Gründen unerlässlich: 1) eine fein abgestimmte Kontrolle über die Konzentration des freigesetzten A- zu ermöglichen, und 2) um eine Implantation in einem kontrollierten Bereich des Rattengehirns zu ermöglichen. Die hier erzielten Ergebnisse beschreiben die einfache Abstimmung von Alginat-Mikroperlen und zeigen mögliche Anwendungen für weitere Studien auf.

Die Autoren haben nichts zu verraten.