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Immunology and Infection

न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल के मास साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए पूरे अस्थि मज्जा की तैयारी

Published: June 19, 2019 doi: 10.3791/59617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, 2Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

Summary

यहाँ, हम ताजा अस्थि मज्जा (बीएम) उच्च आयामी द्रव्यमान cytometry के लिए माउस या मानव से अलग प्रक्रिया करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत (समय की उड़ान, CyTOF) न्यूट्रोफिल वंश कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा Cytometry.

Abstract

इस आलेख में, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पूरे बीएम CyTOF विश्लेषण के लिए ताजा बीएम में न्यूट्रोफिल-लाइनेज कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके न्यूट्रोफिल वंश कोशिकाओं पर ध्यान देने के साथ hematopoietic प्रणाली का मूल्यांकन करने के लिए एक माइलॉयड पूर्वाग्रह 39-एंटीबॉडी CyTOF पैनल का उपयोग किया। CyTOF परिणाम एक खुला संसाधन आयामी कमी एल्गोरिथ्म, viSNE के साथ विश्लेषण किया गया था, और डेटा इस प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत किया गया था. हमने इस प्रोटोकॉल के आधार पर नए न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल की आबादी की खोज की है। ताजा पूरे बीएम तैयारी के इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 1), CyTOF विश्लेषण पूरे बीएम से अज्ञात सेल आबादी की खोज करने के लिए, 2), ल्यूकेमिया के रूप में रक्त विकारों के साथ रोगियों के लिए पूरे बीएम दोष की जांच, 3), के अनुकूलन की सहायता फ्लोरोसेंट सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल है कि ताजा पूरे बीएम का उपयोग।

Introduction

पिछले कुछ दशकों में, साइटोमेट्री तरीकों बीएम में hematopoietic प्रणाली की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है। इन विधियों में फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री और भारी धातु लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके CyTOF की नई विधि शामिल है। वे अपने अद्वितीय सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल की पहचान द्वारा एक विषम जैविक नमूना में कई सेल प्रकार की खोजों के लिए नेतृत्व किया है. अधिक चैनलों के साथ जुड़े स्पेक्ट्रम ओवरलैप फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री अनुप्रयोगों में उच्च डेटा अशुद्धि की ओर जाता है। इसलिए, अवांछित कोशिकाओं को नियमित रूप से फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए ब्याज की सेल आबादी को समृद्ध करने के लिए हटा दिया जाता है। उदाहरण के लिए, Ly6G (या Gr-1) और CD11b परिपक्व माइलॉयड सेल मार्कर और Ly6G+ (या Gr-1+) और CD11b+ कोशिकाओं को नियमित रूप से चुंबकीय संवर्धन किट का उपयोग करके बी एम नमूनों से हटा रहे हैं माना जाता है के प्रवाह से पहले साइटोमेट्री विश्लेषण हेमाटोपोएटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) या एक डंप कॉकटेल चैनल1,2,3में इन मार्करों के संयोजन के द्वारा . एक अन्य उदाहरण यह है कि न्यूट्रोफिल को नियमित रूप से मानव रक्त नमूने से हटा दिया जाता है ताकि प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को समृद्ध किया जा सके। माउस या मानव से अलग पूरे अस्थि मज्जा, तथापि, शायद ही कभी साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए बरकरार जांच की है.

हाल ही में, CyTOF hematopoietic प्रणाली4,5,6की जांच करने के लिए एक क्रांतिकारी उपकरण बन गया है. CyTOF के साथ, फ्लोरोफोर-लेबल एंटीबॉडी को भारी तत्व रिपोर्टर-लेबल एंटीबॉडी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। इस विधि स्पेक्ट्रम ओवरलैप की चिंता के बिना एक साथ 40 से अधिक मार्करों की माप के लिए अनुमति देता है. यह पूर्व कमी कदम या एक डंप चैनल के बिना बरकरार जैविक नमूना के विश्लेषण में सक्षम है. इसलिए, हम पारंपरिक 2-डी प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों से उच्च-सामग्री आयामीता के साथ हेमेटोपोएटिक प्रणाली को व्यापक रूप से देख सकते हैं। कमी या गेटिंग प्रक्रिया के दौरान अतीत में छोड़ी गई कोशिका आबादी को अब CyTOF4,5 द्वारा उत्पन्न उच्च आयामी डेटा के साथ प्रकाश में लाया जा सकताहै। हमने एक एंटीबॉडी पैनल तैयार किया है जो एक साथ माइलॉयड लिनेज7पर ध्यान देने के साथ ही हेमाटोपोइटिक प्रणाली में 39 पैरामीटरों को मापता है . पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा की तुलना में, CyTOF द्वारा उत्पन्न अभूतपूर्व एकल सेल उच्च आयामी डेटा की व्याख्या और दृश्यावलोकन चुनौतीपूर्ण है। अभिकलनीय वैज्ञानिकों ने उच्च आयामी डेटासेट के दृश्य के लिए विमीयता न्यूनीकरण तकनीक विकसित की है। इस आलेख में, हमने एल्गोरिथ्म, viSNE का उपयोग किया है, जो t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) तकनीक का उपयोग CyTOF डेटा का विश्लेषण करने के लिए और उच्च-आयामी संरचना को संरक्षित करते समय 2-आयामी मानचित्र पर उच्च-आयामी परिणाम प्रस्तुत करने के लिए करता है के डेटा8,9,10. TSNE प्लॉट पर, समान कक्ष सबसेट में संकुल होते हैं और कक्षों की सुविधा को हाइलाइट करने के लिए रंग का उपयोग किया जाता है. उदाहरण के लिए, चित्र 1 पर माइलॉयड कोशिकाओं को CyTOF (चित्र 1)4से प्राप्त 33 सतह मार्करों के उनके अभिव्यक्ति पैटर्न की समानता के आधार पर कई सेल सबसेट में वितरित किए जाते हैं। यहाँ हम हमारे पहले की सूचना के साथ माउस अस्थि मज्जा की जांच की 39-मार्कर CyTOF पैनल viSNE विश्लेषणद्वारा 7. हमारे CyTOF डेटा के viSNE विश्लेषण एक अज्ञात सेल आबादी है कि दोनों HSPC ( CD117+ )और न्यूट्रोफिल (Ly6G+ )विशेषताओं से पता चला पता चला (चित्र 2)7.

अंत में, हम CyTOF विश्लेषण के लिए ताजा पूरे अस्थि मज्जा प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में माउस अस्थि मज्जा का इस्तेमाल किया, जबकि इस प्रोटोकॉल भी मानव अस्थि मज्जा के नमूने की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव अस्थि मज्जा के नमूने के लिए विशिष्ट विवरण भी प्रोटोकॉल में नोट कर रहे हैं के रूप में अच्छी तरह से. इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इसमें ऊष्मायन समय और तापमान जैसे विवरण शामिल हैं जिन्हें पूरे अस्थि मज्जा में न्यूट्रोफिल-लाइनेज कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया था ताकि बरकरार पूरे अस्थि मज्जा पर जांच को सक्षम किया जा सके। इस प्रोटोकॉल भी आसानी से फ्लोरोसेंट सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है.

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Protocol

सभी प्रयोगों एलर्जी और इम्यूनोलॉजी पशु देखभाल और उपयोग समिति के लिए ला Jolla संस्थान के अनुमोदित दिशा निर्देशों के बाद, और कृन्तकों के उपयोग के लिए अनुमोदन में उल्लिखित मानदंडों के अनुसार एलर्जी और इम्यूनोलॉजी के लिए ला Jolla संस्थान से प्राप्त किया गया था स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड.

1. हार्वेस्ट माउस अस्थि मज्जा (बीएम)

  1. एक वाणिज्यिक विक्रेता से C57BL/6J चूहों खरीद. एक रोगज़नक़ मुक्त सुविधा में microisolator पिंजरों में मानक कृंतक चाउ आहार और घर फ़ीड.
  2. प्रयोगात्मक उद्देश्य के लिए पुरुष चूहों, 6-10 सप्ताह की उम्र का प्रयोग करें। सीओ2 साँस लेना गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद द्वारा Euthanize.
  3. पेट की ओर के साथ एक बाँझ शल्य पैड पर माउस प्लेस. 70% इथेनॉल छिड़काव द्वारा पेट और hindlimbs क्षेत्र की त्वचा बाँझ. पेट की गुहा को खोलने में कटौती करने के लिए सर्जिकल कैंची को अलग करने की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  4. हिंडलिंब का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को निकालें। टखने के ठीक नीचे माउस टिबिया को पकड़ने के लिए कुंद-टिप ड्रेसिंग संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। कुंद टिप ड्रेसिंग forceps नीचे टिबिया को स्थिर करने के लिए घुमावदार ड्रेसिंग forceps की एक और जोड़ी का प्रयोग करें. टिबिया को तोड़ें और कुंद-टिप ड्रेसिंग संदंश के साथ मांसपेशियों को चीरकर हड्डी को बेनकाब करें।
    नोट: टिबिया घुटने के जोड़ से शिथिल है और कुंद-टिप ड्रेसिंग सम्प्स का उपयोग करके आसानी से बाहर उठाया जा सकता है।
  5. ठंड 1x पीबीएस में टिबिया प्लेस.
  6. इसके बाद, स्थिर घुमावदार ड्रेसिंग बल्स को नीचे फीमर पर ले जाएं। घुटने के जोड़ के नीचे कुंद-टिप ड्रेसिंग संदंश स्लाइड करें और घुटने की टोपी को पकड़ें। इसे धीरे से खींच कर घुटने की टोपी को अलग कर दें। घुटने की टोपी से जुड़ी मांसपेशियों को चीरकर फीमर को उजागर करें। घुमावदार ड्रेसिंग संदंश द्वारा उजागर फीमर को पकड़ो और सर्जिकल कैंची को विभाजित करने का उपयोग करके हड्डी के नीचे से फीमर को काट लें।
  7. ठंड 1x पीबीएस में फीमर रखें।
  8. एक 18 जी सुई के साथ 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में एक छेद पंच.
  9. टिबिया और फीमर दोनों को एक ही 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें, जिसमें हड्डियों के खुले सिरा को छेद में नीचे की ओर ले जाना होता है।
  10. एक 1.7 एमएल microcentrifuge ट्यूब में टिबिया और फीमर दोनों युक्त 0.5 एमएल ट्यूब रखें।
  11. माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज में 30 एस के लिए 5,510 x ग्राम पर टिबिया और फीमर दोनों युक्त डबल-परत वाली ट्यूब ों को स्पिन करें।
  12. सुनिश्चित करें कि बीएम हड्डियों से निकाला जाता है और ट्यूब के तल पर छर्रों। पवित्र हड्डियों युक्त 0.5 एमएल ट्यूब टॉस. माउस BM अगले चरणों के लिए तैयार है।
    नोट: मानव बीएम नैदानिक संसाधनों पर काटा जाता है के रूप में पहलेवर्णित 11.

2. CyTOF के लिए दाग बीएम कोशिकाओं

  1. 1 एमएल 1x लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर में बीएम को पुन: निलंबित करें। मानव बीएम के लिए, 1x लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर के एक 10x मात्रा में पूरे बीएम resuspend. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर ट्यूब स्पिन। मानव बीएम के लिए, चरण 2.3 पर आगे बढ़ने से पहले चरण 2.1 और 2.2 दोहराएँ.
  3. अति-निश् चलाकर गोली को अबाधित छोड़ दें। ठंड 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। 70 डिग्री कोशिका छन्नी के माध्यम से एक 15 एमएल शंकु नली में गोली फ़िल्टर करें। बीएम कोशिकाओं को अब पूरी तरह से मांसपेशियों और हड्डी के मलबे से ट्यूब में अलग कर रहे हैं. ट्यूब में ठंड 1x पीबीएस के 9 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
  4. 15 एमएल ट्यूब को 350 x ग्राम पर 5min पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें।
  5. अति-निश् चित को सावधानी से प्रेरित करें और बीएम कोशिकाओं को 10 एमएल कोल्ड पीबीएस के साथ पुन: निलंबित करें। गिनती के लिए कोशिकाओं की एक aliquot ले लो. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  6. अलीकोट 5 x 106 बीएम कोशिकाओं CyTOF धुंधला के लिए एक नया 15 एमएल ट्यूब में।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर 15 एमएल ट्यूब alicot स्पिन।
  8. सावधानी से supernatant aspirate और नमूने के लिए एक व्यवहार्यता सूचक के रूप में CyTOF धुंधला बफर के 1 एमएल में 125 एनएम Cisplatin के साथ बीएम कोशिकाओं को फिर से करना। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  9. ऊष्मायन के बाद, ट्यूब के लिए CyTOF धुंधला बफर के 4 एमएल जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर ट्यूब स्पिन। मानव बीएम के लिए, CyTOF धुंधला बफर में 10% मानव एबी सीरम जोड़ें.
  10. अति-निश्चित करें और बी.सी.एल. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। मानव बीएम के लिए इस कदम को छोड़ें.
  11. नमूना करने के लिए घर का बना CyTOF एंटीबॉडी कॉकटेल5 के 50 डिग्री एल जोड़ें तो कुल धुंधला मात्रा 100 डिग्री सेल्सियस है. मिश्रण करने के लिए धीरे पिपेट। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। एंटीबॉडी कॉकटेल के अंतिम मात्रा दोनों माउस बीएम और मानव बीएम नमूने के लिए 100 डिग्री एल है.
  12. कोशिकाओं को धोने के लिए ऊष्मायन के बाद प्रत्येक ट्यूब के लिए CyTOF धुंधला बफर के 2 एमएल जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर ट्यूब स्पिन।
  13. दो washes की कुल के लिए चरण 2.12 दोहराएँ.
  14. 16% स्टॉक ampule से एक ताजा 1.6% formaldehyde समाधान तैयार करें. 1x पीबीएस के 9 भागों के साथ शेयर formaldehyde के 1 भाग को अलग करें।
  15. ध्यान से supernatant aspirate और 1 एमएल ताजा 1.6% एफए समाधान के साथ गोली resuspend. आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर ट्यूब स्पिन।
  17. अति-निकेण्टी को सावधानीपूर्वक प्रेरित करें तथा सेल पेलेट को 1 एमएल फिक्स/पर्म बफर में 125 एनएम अंतराकलेशन विलयन के साथ पुनः निलंबित करें।
  18. नमूना को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इंटरकैलेशन समाधान में इनक्यूबेट करें।

3. CyTOF अधिग्रहण के लिए सेल तैयार

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर धीरे भंवर और स्पिन कोशिकाओं।
  2. CyTOF धुंधला बफर के 2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर स्पिन कोशिकाओं और आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें।
  3. 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें2हे कोशिकाओं की गणना करने के लिए प्रत्येक ट्यूब से एक छोटी मात्रा (लगभग 10 डिग्री सेल्सियस) आरक्षित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर स्पिन कोशिकाओं।
  5. चरण 3.3 और 3.4 दोहराएँ.
  6. अति-नांटेंट को सावधानी से प्रेरित करें और गोली में कोशिकाओं को छोड़ दें। बीएम कोशिकाओं को अब CyTOF अधिग्रहण के लिए 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए resuspension के लिए तैयार हैं.

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Representative Results

चित्र 1 CyTOF प्रयोगों से एक उदाहरण परिणाम के रूप में प्रस्तुत किया है. इस tSNE साजिश पर कई माउस ऊतकों भर में कोशिकाओं को एक 33-पैरामीटर CyTOF पैनल द्वारा मापा उनकी सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल की समानता के आधार पर सबसेट में संकुल थे. अधिक समान गुणों वाले कक्ष स्वचालित रूप से प्रत्येक कक्ष पर 33 मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, या डीसी जैसे एक साथ संकुल थे।

चित्र 2 इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करमाउस BM CyTOF प्रयोग के लिए एक उदाहरण परिणाम के रूप में प्रस्तुत किया है. प्रोटोकॉल पूरे बीएम की अखंडता को संरक्षित, एक पहले से अज्ञात सेल आबादी की खोज के लिए अग्रणी है कि सह न्यूट्रोफिल (Ly6G+ चित्र 2A) और HSPC (CD117+, चित्र 2B) हस्ताक्षर सतह मार्करों साथ. इस सेल जनसंख्या हमारे CyTOF पैनल द्वारा मापा सतह मार्कर अभिव्यक्ति का एक विशिष्ट पैटर्न से पता चलता है (चित्र 2C) और Ly6G+ सेल अवक्षय1,2के कारण पिछले माइलॉयड जनक अनुसंधान द्वारा छोड़दिया गया था, 3. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस परिणाम के लिए क्लस्टर के छोटे सबसेट की खोज करने के लिए नेतृत्व viSNE नक्शा है कि Ly6G व्यक्त नहीं करता है लेकिन CD117+Ly6G+ कोशिकाओं को बारीकी से संकुल था, जो इन की समानता का पता चलता है इस CyTOF प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया 39 मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर न्यूट्रोफिल वंश के लिए कोशिकाओं.

हमने चित्रा 2C में दिखाए गए CyTOF डेटा से मार्कर व्यंजक प्रोफ़ाइल का उपयोग 13-रंग FACS (fluorescence-सक्रिय सेल सॉर्टिंग) पैनल बनाने के लिए किया है जो हमें डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा न्यूट्रोफिल संतति को अलग करने की अनुमति देता है ( चित्र 3) .

Figure 1
चित्र 1: TSNE साजिश CyTOF से हुई का उदाहरण है। सकल tSNE आयामीता सभी चूहों ऊतकों से एकल कोशिका डेटा कम विश्लेषण साजिश रची और रंग 28 'unsupervised' समूहों द्वारा कोडित थे. प्रत्येक समूह की मोटे पहचान विभिन्न प्रकाशित विश्लेषणों के आधार पर एनोटेट की गई थीं। यह आंकड़ा संदर्भ4से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : लिन के स्वचालित एकल सेल विश्लेषण-CD117+Ly6A/E- अस्थि मज्जा में HSPC कोशिकाओं एक अलग न्यूट्रोफिल संतति जनसंख्या की पहचान करता है. Lin के viSNE नक्शे-CD117+Ly6A/E- HSPC कोशिकाओं को 5 स्वचालित समूहों को प्रदर्शित करने के लिए डॉट ओवरले के रूप में दिखाया गया है। (A) Ly6G और (B) CD117 अभिव्यक्ति पैटर्न लिन के viSNE नक्शे पर दिखाया गया है-CD1117+Ly6A/ (ग) संकेतित मार्करों के अभिव्यक्ति पैटर्न प्रत्येक क्लस्टर के हिस्टोग्राम ओवरले के रूप में दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा संदर्भ7से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : FACS gating रणनीति बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री (CyTOF) डेटासेट के साथ प्रदर्शन किया। मैन्युअल रूप से गेट किए गए लक्ष्य जनसंख्या सत्यापन के लिए स्वचालित viSNE मानचित्र के लिए वापस gated था. यह आंकड़ा संदर्भ7से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पिछले दशकों में, फ्लोरोसेंट आधारित प्रवाह साइटोमेट्री कोशिकीय वंशों और विषमता1,2,3का अध्ययन करने के लिए मुख्य विधि के रूप में प्रयोग किया गया था। हालांकि प्रवाह साइटोमेट्री बहु आयामी डेटा प्रदान की गई है, इस विधि पैरामीटर और वर्णक्रमीय ओवरलैप के विकल्पों द्वारा सीमित है. प्रवाह साइटोमेट्री की कमजोरी को दूर करने के लिए हम CyTOF का लाभ उठाया, जो फ्लोरोफोर के बजाय भारी धातु आइसोटोप का उपयोग करता है एंटीबॉडी है कि डिटेक्टर चैनलों या कोशिकाओं के autofluorscence के बीच crosstalk समाप्त लेबल करने के लिए, इसलिए, कई उपाय कर सकते हैं एकल-सेल स्तर पर एक साथ अधिक पैरामीटर और सेलुलर विविधता12का एक बहुत गहरा मूल्यांकन उत्पन्न करते हैं। कमी या गेटिंग प्रक्रिया के दौरान अतीत में छोड़ दी गई कोशिका आबादी, न्यूट्रोफिल-लाइनेज कोशिकाओं की तरह विशेष रूप से महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिकाओं जो लंबे समय से सजातीय13,14के लिए थे, CyTOF 2 की बेहतर विशेषता हो सकती है ,3,7.

CyTOF के इस शक्तिशाली साइटोमेट्री उपकरण को समायोजित करने के लिए सेल विषमता का अध्ययन और दुर्लभ सेल आबादी की विशेषता, प्रोटोकॉल है कि जैविक नमूनों की अखंडता की रक्षा विषमता अध्ययन के लिए अत्यंत व्यावहारिक हैं. यहाँ हम CyTOF के लिए पूरे बीएम प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल है कि बरकरार पूरे बीएम, जो माउस या मानव अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में नए सेल आबादी के व्यापक लक्षण सक्षम बनाता है वर्णित है. माउस और मानव से अलग पूरे अस्थि मज्जा सेल आबादी, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल वंश कोशिकाओं है कि अत्यधिक नाजुक और इस तरह के तापमान और संस्कृति की स्थिति के रूप में पर्यावरण परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल में, हमने इन संवेदनशील आबादी को अधिकतम स्तर तक संरक्षित करने के लिए प्रत्येक चरण के लिए तापमान और ऊष्मायन स्थितियों को अनुकूलित किया है। ऐसा करने से पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं की अखंडता अच्छी तरह से संरक्षित है. व्यक्तिगत मार्कर पैनल इस प्रोटोकॉल को शामिल के साथ, शोधकर्ताओं के विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में ब्याज की अधिक कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं.

हालांकि CyTOF नए सेल आबादी की खोज के लिए एक शक्तिशाली अंत बिंदु विश्लेषणात्मक उपकरण है और उनके मार्कर विशेषताओं द्वारा नई आबादी समारोह की भविष्यवाणी करने में सक्षम है, इस प्रौद्योगिकी आगे बहाव कार्यात्मक अध्ययन के लिए सीमित है. डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक अध्ययनों को सक्षम करने के लिए, हमने प्रत्येक क्लस्टर को प्रत्येक 39 मार्कर के उनके अभिव्यक्ति स्तर की व्यापक रूप से विशेषता बनाने के लिए उपयोग किया और चित्र 2Cमें दर्शाए अनुसार विशिष्ट मार्कर संयोजन पाए। हालांकि CyTOF डेटा वर्तमान छँटाई प्रौद्योगिकियों के लिए लागू नहीं किया जा सकता है, कई मापदंडों की माप पर अपने लाभ के साथ-साथ हमें सीमित मापदंडों के भीतर मार्करों का सबसे अच्छा संयोजन की पहचान करने के लिए सहायता कर सकता है. डेटा विश्लेषण के इस महत्वपूर्ण कदम हमें CyTOF परिणामों का पूरा लाभ लेने के लिए एक FACS-संगत फ्लोरोसेंट आधारित छँटाई पैनल डिजाइन करने के लिए सहायता प्रदान की. उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में, हमने चित्र 2C में इस जानकारी का उपयोग 13-रंग FACS पैनल बनाने के लिए किया है जो हमें डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा न्यूट्रोफिल संतति (NEP) को अलग करने की अनुमति देता है (चित्र3)। एक पाइप लाइन में CyTOF और FACS का उपयोग करके, इन तरीकों को एक साथ इस तरह के आकृति विज्ञान, बहुमुखी प्रतिभा, इन विट्रो परख में, और विवो अध्ययन में कार्यात्मक अध्ययन के लिए नए की खोज की सेल प्रकार के अलगाव सक्षम हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री प्रक्रिया के साथ सहायता के लिए LJI प्रवाह साइटोमेट्री कोर धन्यवाद देना चाहते हैं. यह काम NIH अनुदान R01HL134236, P01HL136275, और R01CA202987 (सभी C.C.H) और ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. और Y.P.$) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y Fluidigm Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb Fluidigm Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified Biolegend Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified Biolegend Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er Fluidigm Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified Biolegend Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd Fluidigm Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd Fluidigm Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er Fluidigm Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified Biolegend Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified Biolegend Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified Biolegend Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified Biolegend Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified Biolegend Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd Fluidigm Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd Fluidigm Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready ThermoFisher Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified Biolegend Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified Biolegend Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb Fluidigm Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb Fluidigm Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm Fluidigm Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified abcam Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho Fluidigm Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd Fluidigm (Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer CANDOR Bioscience Cat# 130050
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich Cat# A4503
Cisplatin-194Pt Fluidigm Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer ThermoFisher Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution GE Lifesciences Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Cat# 158127
Sodium azide Sigma-Aldrich Cat# S2002
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# X100
Trypsin EDTA 1x Corning Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer Finck et al., 2013 https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank Cytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0 Chen et al., 2016 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE van der Maaten and Hinton, 2008 https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

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References

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  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
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  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

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Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H. Q., Marcovecchio, P., Wu, R., Hinz, D., Kim, C., Hedrick, C. C. Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells. J. Vis. Exp. (148), e59617, doi:10.3791/59617 (2019).

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