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Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

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DOI:

10.3791/59621

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1. Juni 2019

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hierin beschreiben wir zwei Ansätze zur Charakterisierung von Zellpolarisationsereignissen in B-Lymphozyten während der Bildung eines IS. Die erste betrifft die Quantifizierung der Organellenrekrutierung und Zytoskelett-Umlagerungen an der synaptischen Membran. Der zweite ist ein biochemischer Ansatz, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Zentrosoms zu charakterisieren, die polarisiert werden, um die Immunsynapse zu polarisieren.

Zusammenfassung

Die Erkennung von oberflächengebundenen Antigenen durch den B-Zell-Rezeptor (BCR) löst die Bildung einer Immunsynapse (IS) aus, bei der sowohl signalierte als auch Antigenaufnahme koordiniert werden. Die IS-Bildung beinhaltet eine dynamische Aktin-Umgestaltung, begleitet von der polarisierten Rekrutierung zur synaptischen Membran des Zentromes und der damit verbundenen intrazellulären Organellen wie Lysosomen und des Golgi-Apparats. Erste Stadien der Aktin-Umgestaltung ermöglichen es B-Zellen, ihre Zelloberfläche zu erhöhen und die Menge an Antigen-BCR-Komplexen zu maximieren, die an der Synapse gesammelt werden. Unter bestimmten Bedingungen, wenn B-Zellen Antigene erkennen, die mit starren Oberflächen verbunden sind, ist dieser Prozess mit der lokalen Rekrutierung und Sekretion von Lysosomen gekoppelt, die die Antigenextraktion erleichtern können. Aufgenommene Antigene werden in spezialisierte Endolysosome-Fächer zur Verarbeitung in Peptide verinnerlicht, die zur weiteren Darstellung von T-Helferzellen auf den Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC-II) geladen werden. Daher ist das Studium der Organellendynamik im Zusammenhang mit der Bildung eines IS entscheidend, um zu verstehen, wie B-Zellen aktiviert werden. In diesem Artikel werden wir sowohl bildgebende als auch eine biochemische Technik zur Untersuchung von Veränderungen in der intrazellulären Organellenpositionierung und Zytoskelett-Umlagerungen diskutieren, die mit der Bildung eines IS in B-Zellen verbunden sind.

Einleitung

B-Lymphozyten sind ein wesentlicher Bestandteil des adaptiven Immunsystems, das für die Produktion von Antikörpern gegen verschiedene Bedrohungen und eindringende Krankheitserreger verantwortlich ist. Die Effizienz der Antikörperproduktion wird durch die Fähigkeit von B-Zellen bestimmt, Antigene zu erfassen, zu verarbeiten und zu präsentieren, die entweder in einer löslichen oder oberflächengebundenen Form1,2angetroffen werden. Die Erkennung von Antigenen, die an der Oberfläche einer präsentierenden Zelle befestigt sind, durch die BCR führt zur Bildung eines engen interzellulären Kontakts, der ALS IS3,4bezeichnet wird. Innerhalb dieser dynamischen Plattform findet sowohl die BCR-abhängige downstream Signalisierung als auch die Internalisierung von Antigenen in Endolysosome-Fächer statt. Aufgenommene Antigene werden auf MHC-II-Molekülen verarbeitet und zusammengesetzt und anschließend T-Lymphozyten präsentiert. Produktive B-T-Wechselwirkungen, die als B-T-Zellkooperation bezeichnet werden, ermöglichen es B-Lymphozyten, die entsprechendenSignale zu empfangen, die ihre Differenzierung in Antikörper produzierende Plasmazellen oder Gedächtniszellen 8 fördern.

Zwei Mechanismen wurden an der Antigenextraktion durch B-Zellen beteiligt. Die erste stützt sich auf die Sekretion von Proteasen, die von Lysosomen stammen, die an der synaptischen Spalte5,6rekrutiert und fusioniert werden. Die zweite hängt von Myosin IIA-vermittelten Zugkräften ab, die die Invagination von Antigen-haltigen Membranen auslösen, die in Clathrin-beschichteten Gruben verinnerlicht sind7. Die Art der Antigenextraktion beruht auf den physikalischen Eigenschaften der Membran, in der Antigene gefunden werden. Dennoch durchlaufen B-Zellen in beiden Fällen zwei große Umgestaltungsereignisse: die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und die Polarisierung von Organellen zum IS. Actin-Zytoskelett-Remodellierung beinhaltet eine erste Ausbreitungsphase, in der aktinabhängige Vorsprünge an der synaptischen Membran die Oberfläche in Kontakt mit dem Antigen erhöhen. Es folgt eine Kontraktionsphase, in der BCRs, gekoppelt mit Antigenen, im Zentrum des IS durch die konzertierte Aktion von Molekularmotoren und Aktin-Zytoskelett-Remodeling8,9,10 konzentriert werden. 11. Die Polarisation von Organellen beruht auch auf der Umgestaltung des Aktin-Zytoskeletts. Zum Beispiel wird das Zentromat vom Kern entkoppelt, durch lokale Depolymerisation des assoziierten Aktins, die die Neupositionierung dieser Organelle zum IS5,12ermöglicht. In B-Zellen führt die Neupositionierung des Zentromes zu einem Zellpol (IS) die Lysosomenrekrutierung zur synaptischen Membran, die bei Derortion die Extraktion und/oder Verarbeitung von oberflächengebundenen Antigenen erleichtern kann6. Lysosomen, die beim IS rekrutiert werden, werden mit MHC-II angereichert, das die Bildung von Peptid-MHC-II-Komplexen in endosomalen Kompartimenten begünstigt, die den T-Zellen13präsentiert werden sollen. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass der Golgi-Apparat eng an den IS14rekrutiert wurde, was darauf hindeutet, dass Von Golgi abgeleitete Vesikel aus dem sekretoreichen Pfad an der Antigenextraktion und/oder -verarbeitung beteiligt sein könnten.

Insgesamt sind intrazelluläre Organelle und Zytoskelett-Umlagerungen in B-Zellen während der Synapsenbildung die wichtigsten Schritte, die eine effiziente Antigenerfassung und -verarbeitung ermöglichen, die für ihre weitere Aktivierung erforderlich sind. In dieser Arbeit führen wir detaillierte Protokolle zur Durchführung von Bildgebung und biochemischer Analyse in B-Zellen ein, um die intrazelluläre Remodellierung von Organellen im Zusammenhang mit der Bildung eines IS zu untersuchen. Diese Techniken umfassen: (i) Immunfluoreszenz und Bildanalyse von B-Zellen, die mit antigenbeschichteten Perlen aktiviert sind, und auf antigenbeschichteten Abdeckungen, die die Visualisierung und Quantifizierung intrazellulärer Komponenten ermöglichen, die zum IS mobilisiert werden und (ii ) Isolierung von zentromangereicherten Fraktionen in B-Zellen durch Ultrazentrifugation auf Saccharosegradienten, die die Identifizierung von Proteinen ermöglicht, die mit dem Zentromom assoziiert sind und potenziell an der Regulierung der Zellpolarität beteiligt sind.

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Protokoll

HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden mit IIA1.6 B-Zellen durchgeführt.

1. B-Zell-Aktivierung mit antigenbeschichteten Perlen

  1. Herstellung von antigenbeschichteten Perlen
    1. Um B-Zellen zuaktivieren, verwenden Sie NH 2-Perlen, die kovalent mit Antigen (Ag-beschichtete Perlen) beschichtet sind, die mit 50 l (ca. 20 x 106 Perlen) von 3 'm NH 2-Perlen mit aktivierenden (BCR-Ligand+) oder nicht aktivierenden (BCR-Ligand-) Antigenen hergestellt werden.
    2. Für IIA1.6 B-Zellen verwenden Anti-IgG-F(ab')2 Fragment als BCR-ligand+ und anti-IgM-F(ab')2 oder Rinderserumalbumin (BSA) als BCR-Ligand-. Um primäre B-Zellen oder IgM+ B-Zelllinie zu aktivieren, verwenden Sie Anti-IgM-F(ab')2 als BCR-Ligand+ und BSA als BCR-Ligand-.
      HINWEIS: Um die Bindung von Liganden an den Fc-Rezeptor zu vermeiden, verwenden Sie F(ab') oder F(ab')2 Antikörperfragmente anstelle von Antikörpern in voller Länge.
    3. Um mit der Herstellung von Ag-beschichteten Perlen fortzufahren, legen Sie die Perlen in eiweißarme, bindende Mikrozentrifugenröhren, um die Erholung der Perlen während der Probenmanipulation zu maximieren. 1 ml 1x phosphatgepufferte Saline (PBS) hinzufügen, um Perlen und Zentrifugen bei 16.000 x g für 5 min zu waschen.
    4. Setzen Sie die Perlen mit 500 l 8% Glutaraldehyd aus, um die NH 2-Gruppen zu aktivieren und drehen Sie 4 h bei Raumtemperatur (RT).
      VORSICHT: Die Glutaraldehyd-Stammlösung sollte nur in einer chemischen Rauchhaube verwendet werden. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Materialsicherheitsdatenblatt (MSDS).
    5. Zentrifugenperlen bei 16.000 x g für 5 min, entfernen Sie das Glutaraldehyd und waschen Sie die Perlen drei weitere Male mit 1 ml 1x 1x PBS.
      VORSICHT: Die Glutaraldehydlösung sollte als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden.
    6. Setzen Sie die aktivierten Perlen in 100 l mit 1x PBS wieder auf. Die Probe kann in zwei eiweißarme Mikrozentrifugen-Röhren unterteilt werden: 50 l für den BCR-Ligand+ und 50 l für BCR-Ligand-.
    7. Zur Herstellung der Antigenlösung verwenden Sie zwei 2 ml eiweißarme, bindende Mikrozentrifugen-Röhrchen, die 100 g/ml Antigenlösung in 150 l PBS enthalten: Ein Rohr mit BCR-Ligand+ und ein anderes mit BCR-Ligand-.
    8. Fügen Sie jeder Tube, die 150 l Antigenlösung enthält, einen Wirbel mit 50 l aktivierten Perlenzusolutionen hinzuzufügen und sich über Nacht bei 4 °C zu drehen.
    9. Fügen Sie 500 l von 10 mg/ml BSA hinzu, um die verbleibenden reaktiven NH 2-Gruppen auf den Perlen zu blockieren und 1 h bei 4 °C zu drehen.
    10. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen mit kalten 1x PBS drei weitere Male.
    11. Setzen Sie die aktivierten Perlen in 70 l mit 1x PBS wieder auf.
    12. Um die endgültige Konzentration von Ag-beschichteten Perlen zu bestimmen, verdünnen Sie ein kleines Volumen von Perlen in PBS (1:200) und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Dann bei 4 °C lagern, bis es verwendet wird.
      HINWEIS: Ag-beschichtete Perlen sollten nicht mehr als 1 Monat gelagert werden.
  2. Herstellung von Poly-L-Lysin-Abdeckungen
    1. Vor dem B-Zell-Aktivierungstest mit Ag-beschichteten Perlen poly-L-Lysin-beschichtete Abdeckungen (PLL-Coverlips) zubereiten. Verwenden Sie ein 50 ml-Rohr mit 40 ml 0,01 % w/v PLL-Lösung und tauchen Sie die Abdeckungen mit 12 mm Durchmesser in die Lösung ein. Drehen Sie über Nacht bei RT.
    2. Die Abdeckungen mit 1x PBS waschen und auf einem 24-Well-Plattendeckel mit Paraffinfolie trocknen lassen. Fahren Sie mit der B-Zellenaktivierung fort.
  3. B-Zellaktivierung
    1. Um die B-Zellaktivierung mit Perlen zu starten, verdünnen Sie zunächst die IIA1.6 B-Zelllinie auf 1,5 x 106 Zellen/ml in CLICK-Medium (RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Alanin-L-Glutamin + 55 'M Beta-Mercaptoethanol + 1 mM Pyruvat + 100 U/mL Penicillin + 100 g/ml Streptomycin) + 5% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum [FBS]).
    2. Kombinieren Sie 100 l (150.000 Zellen) von IIA1.6 B-Zellen mit Ag-beschichteten Perlen im Verhältnis 1:1 in 0,6 ml-Röhren. Mit einem Wirbel und Samen vorsichtig auf PLL-Coverlips mischen. Inkubieren Sie für verschiedene Zeitpunkte in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C / 5% CO2). Die typischen Aktivierungszeitpunkte sind 0, 30, 60 und 120 min. Legen Sie die PLL-Abdeckungen für Zeit 0 in den 24-Well-Plattendeckel auf Eis. Fügen Sie die Zellen-Ag-beschichtete Perlenmischung und brüten für 5 min auf Eis.
      HINWEIS: Es ist wichtig, durch Wirbel zu mischen, anstatt nach oben und unten zu pfeifen, da dies die Anzahl der Perlen in der Probe reduzieren könnte, aufgrund ihrer Ansammlung in der Kunststoffspitze der Pipette. Verwenden Sie Perlen, die mit BCR-Ligand- als Negativkontrolle für jeden Test beschichtet sind. Wir empfehlen, zuerst die längste Inkubationszeit und dann die folgenden Zeitpunkte zu aktivieren. Berechnen Sie Aktivierungsintervalle für Proben, sodass sie gleichzeitig fixiert werden können.
    3. Fügen Sie jedem Deckelblatt 100 l kalte 1x PBS hinzu, um die Aktivierung zu stoppen und mit dem Immunfluoreszenzprotokoll fortzufahren. Siehe Protokoll Abschnitt 3.

2. B-Zell-Aktivierung auf antigenbeschichteten Abdeckungen

  1. Herstellung von antigenbeschichteten Abdeckungen
    1. Bereiten Sie vor der Aktivierung die Antigenlösung vor (1x PBS mit 10 g/ml BCR-Ligand+ und 0,5 g/ml Rattenanti-Maus-CD45R/B220).
      HINWEIS: Erwägen Sie, die Abdeckungen am Tag vor dem Test vorzubereiten. B220 verbessert die B-Zellhaftung, jedoch reicht der BCR-Ligand+ aus, um die Streureaktion zu erzeugen.
    2. Den 12-mm-Deckel auf einen mit Paraffinfolie überzogenen 24-Well-Plattendeckel auflegen, 40 L Antigenlösung auf jeden Deckelschlupf geben und bei 4 °C über Nacht inkubieren. Versiegeln Sie die Platte, um eine Verdunstung der Antigenlösung zu vermeiden.
    3. Die Deckelmitlipse mit 1x PBS waschen und lufttrocken.
  2. B-Zellaktivierung
    1. Um die Aktivierung zu starten, verdünnen Sie IIA1.6 B-Zellen auf 1,5 x 106 Zellen/ml in CLICK medium + 5% FBS.
    2. Fügen Sie 100 l Zellen auf einen antigenbeschichteten Deckelschlupf (Ag-Coverslip) und aktivieren Sie für verschiedene Zeitpunkte in einem Zellinkubator bei 37 °C / 5% CO2. Die typischen Aktivierungszeitpunkte sind 0, 30 und 60 min.
      HINWEIS: Wie in Abschnitt 1 empfehlen wir, mit dem längsten Aktivierungszeitpunkt zu beginnen, um alle Proben gleichzeitig zu fixieren.
    3. Legen Sie für Zeit 0 den 24-Well-Plattendeckel mit dem Ag-Coverslip auf Eis und fügen Sie die Zellen hinzu. 5 min auf Eis inkubieren.
    4. Saugen Sie die Medien auf jedem Ag-Coverslip vorsichtig an und fügen Sie dann 100 l kalte 1x PBS hinzu, um die Aktivierung zu stoppen. Fahren Sie mit dem Immunfluoreszenzprotokoll fort. Siehe Abschnitt 3.

3. Immunfluoreszenz

HINWEIS: Um eine Kreuzreaktivität des sekundären Antikörpers mit dem BCR von IIA 1.6 B-Zellen zu vermeiden, verwenden Sie keine von der Maus abgeleiteten primärantikörper.

  1. Entfernen Sie die 1x PBS und fahren Sie mit der Fixierung jedes Coverslips fort.
    HINWEIS: Um zu entscheiden, welches Fixierungsmedium verwendet werden soll, überprüfen Sie das Datenblatt Antikörper/Farbstoff. Zum Beispiel für die Actin-Etikettierung durch Phalloidin verwenden Paraformaldehyd (PFA) Fixierungsmedium, und für die Zentromit-Etikettierung durch Pericentrin verwenden Methanol-Fixierung.
    1. Fügen Sie 50 l 1x PBS hinzu, ergänzt mit 4% PFA, und brüten sie für 10 min bei RT.
      VORSICHT: Formaldehyd ist giftig. Bitte lesen Sie die MsDS, bevor Sie mit dieser Chemikalie arbeiten. PFA-Lösungen sollten nur unter einer chemischen Dunstabzugshaube mit Handschuhen und Einer Schutzbrille hergestellt werden. PFA-Lösung sollte als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden.
    2. Alternativ können Sie 50 l kaltes Methanol hinzufügen und 20 min brüten.
  2. Dreimal mit 1x PBS waschen.
    HINWEIS: Coverlips können an dieser Stelle maximal drei Tage lang bei 4 °C in 1x PBS gelagert werden.
  3. Entfernen Sie 1x PBS und fügen Sie jedem Abdeckschein 50 l Blockierpuffer (2% BSA + 0,3 M Glycin in 1x PBS) hinzu. Bei RT für 10 min inkubieren.
  4. Saugen Sie vorsichtig und fügen Sie 50 l Permeabilisationspuffer (PB) (0,2% BSA + 0,05% Saponin in 1x PBS). Inkubieren bei RT für 20 min.
  5. Bereiten Sie die Antikörper oder Farbstoffe in PB vor (verwenden Sie 30 l pro Deckblatt) und inkubieren Sie bei RT 1 h oder über Nacht bei 4 °C. Weitere Informationen finden Sie in der Tabelle der Materialien.
    1. Um das Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) oder Dasomom zu kennzeichnen, verwenden Sie die folgenden Antikörper: Anti-A-Tubulin (1:500), Anti-Cep55 (1:500), Anti-A-Tubulin (1:500), Anti-Pericentrin (1:1000).
      HINWEIS: Für die Zentromsomenbeschriftung können B-Zellen mit einem Centrin-GFP-Expressionsplasmid transfiziert werden.
    2. Für die Kennzeichnung Golgi Geräte verwenden Anti-Rab6a (1:500).
      HINWEIS: Es können auch andere Antikörper oder Farbstoffe verwendet werden.
    3. Verwenden Sie für die Etikettierung von Lysosomen Anti-Lamp1 (1:200).
      HINWEIS: Anti-H2-DM und Anti-MHC-II können auch verwendet werden, um Antigen-Verarbeitungsfächer15,16zu kennzeichnen.
    4. Zur Kennzeichnung von endoplasmatischem Retikulum verwenden Sie Anti-Sec61a (1:500).
    5. Für Actin-Zytoskelett beachten Sie Folgendes: Polymerisiertes Actin kann durch Phalloidin konjugiert zu fluoreszierenden Farbstoffen visualisiert werden.
      HINWEIS: B-Zellen, die mit einem LifeAct-GFP/RFP-Expressionsplasmid transfiziert werden, können auch verwendet werden, um Actin zu kennzeichnen.
  6. Waschen Sie die Abdeckungen dreimal mit PBS.
  7. Den sekundären Antikörper oder die Farbstoffe in PBS verdünnen (30 l pro Deckslip verwenden) und 1 h bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Proben direkt dem Licht auszusetzen, um die Qualität des Fluoreszenzsignals zu erhalten.
  8. Waschen Sie die Abdeckungen dreimal mit PBS.
  9. Entfernen Sie die PBS-Lösung aus den Abdeckungen.
  10. Fügen Sie dem Mikroskopschlitten 4 L Desageagenzien hinzu. Montieren Sie den Deckelrutsch auf die Rutsche mit der Zellseite nach unten. Lassen Sie die Dias 30 min bei 37 °C oder bei RT über Nacht trocknen.
    HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung eines "Anti-Fade"-Montagereagenzes (siehe Materialtabelle).
  11. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder auf einem Konfokal- oder Epifluoreszenzmikroskop mit einem 60-fachen oder 100-fachen Öl-Tauchobjektiv. Berücksichtigen Sie für jede Erfassung das durchlichte Licht oder das helle Feld, um B-Zellen, die mit Perlen interagieren, leicht zu identifizieren.
    HINWEIS: Nehmen Sie dreidimensionale (3D) Bilder auf, die die gesamte Zelle mit Z-Stacks abdecken. Wir empfehlen die Einnahme von 0,5 m dicken Stapeln, dies hängt jedoch vom Mikroskop ab.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Die folgenden Algorithmen werden für ImageJ-Software beschrieben. Dies kann jedoch mit einer entsprechenden Software durchgeführt werden. Beachten Sie auch, dass wir bei allen Fluoreszenzintensitätsmessungen die integrierte Fluoreszenzdichte ("RawIntDen" in ImageJ) verwenden, da dieser Parameter die Gesamtmenge der Fluoreszenz in jedem Pixel des Bildes berücksichtigt und dabei die Fläche berücksichtigt.

  1. Analyse der Verteilung von Organellen in B-Zellen, die mit Ag-beschichteten Perlen aktiviert werden
    HINWEIS: Um die Polarisation von Zellkomponenten zum IS zu quantifizieren, definieren wir einen beliebigen Wert als Maß für die Nähe zum IS. Der Index liegt zwischen -1 (antipolarisiert) und 1 (Vollständig polarisiert, Objekt auf der Perle), wie zuvor von Reversat et al. vorgestellt.12.
    1. Schätzen Sie den Polaritätsindex für das Zentromat und das Golgi-Gerät (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Dieser Algorithmus kann für Organellen verwendet werden, die auf einen Punkt beschränkt sind.
      1. Definieren Sie zunächst die zu analysierenden Perlen- und Zellbereiche mithilfe der Kreiswerkzeugauswahl, um die Grenzen beider zu begrenzen, und speichern Sie sie dann als Interessenbereiche (ROI). Siehe Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4.
      2. Bestimmen Sie das Zellenzentrum (CC) und das Perlenzentrum (BC) durch Ausführen von Analyze | Messen Sie an Zell- bzw. Perlenbereichen. X- und Y-Werte, die aus dem Ergebnisfenster abgerufen werden, bestimmen die Mittelkoordinaten.
      3. Bestimmen Sie manuell das Zentrum des Zentromats oder Golgi-Geräts (Organelle) mit der Punktwerkzeugauswahl in ImageJ und führen Sie Analyze | Maßnahme. X- und Y-Werte, die aus dem Ergebnisfenster abgerufen werden, bestimmen die Koordinaten.
      4. Zeichnen Sie dann einen Winkel von CC zu Organelle (a) und CC zu BC (b) mit der Winkelwerkzeugauswahl und führen Sie Analyze | Maßnahme. Der Winkelwert im Ergebnisfenster zeigt den Winkel ()zwischen beiden Vektoren (a und b).
      5. Berechnen Sie den Polaritätsindex mit der folgenden Formel:
        figure-protocol-1
    2. Schätzung des Polaritätsindex für Lysosomen (Abbildung 1F).
      HINWEIS: Wir verwenden diesen Algorithmus, um die Polarität von Organellen zu analysieren, die eine dispersere Verteilung anzeigen, z. B. Lysosomen.
      1. Definieren Sie die zu analysierenden Perlen- und Zellbereiche mithilfe der Kreiswerkzeugauswahl, um die Grenzen beider zu begrenzen und als ROI zu speichern. Sobald die Perlen- und Zellbereiche abgeschreckt wurden, stellen Sie den Fluoreszenzkanal ein und projizieren Sie das Bild in einen Z-Stack (Bild| Stapel | Z-Project [Sum Slices]), führen Sie dann Analysieren | Messen und extrahieren Sie die Massenmittelpunktkoordinaten (MC) (MX und MY) aus den Ergebnisfenstern.
      2. Wenden Sie den gleichen Algorithmus an, der erwähnt wurde, bevor Sie Organelle für MC ändern. Somit wird der Winkel (b) durch CC-MC (a) und CC-BC (b) definiert.
      3. Berechnen Sie die Polarität mit der folgenden Formel:
        figure-protocol-2
    3. Schätzung der Lysosomenrekrutierung in den synaptischen Bereich (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Dieser Algorithmus wird verwendet, um eine Organelle neben dem IS zu quantifizieren.
      1. Sobald die Perlen- und Zellbereiche bestimmt wurden, bestimmen Sie den Winkel des Vektors zwischen CC und BC und drehen Sie das Bild dann, um einen 0°-Winkel zu erreichen.
      2. Stellen Sie den Fluoreszenzkanal ein und projizieren Sie das Bild in einen Z-Stack (Bild | Stapel | Z-Project [Sum slices]), eliminieren Sie alle Fluoreszenz, die außerhalb der Zelle und des Perlenbereichs zusammen fällt (bearbeiten | außen in ImageJ löschen).
      3. Zeichnen Sie mit der Auswahl des Rechteckwerkzeugs ein Rechteck neben der Perle und messen Sie die synaptische Flächenfluoreszenz (SAF). Dieses Rechteck ist ein Viertel der Zellenbreite.
      4. Wählen Sie das gesamte Bild aus, und führen Sie Analyze | Maßnahme zur Erzielung der gesamten Zellfluoreszenz (WCF).
      5. Berechnen Sie den Organellenfluoreszenzprozentsatz neben dem IS mit der folgenden Formel:
        figure-protocol-3
    4. Quantifizieren Sie die Rekrutierung von zellulären Komponenten zum Zentromom.
      HINWEIS: Dieser Algorithmus, angepasst von Obino et al.5, wird verwendet, um die Anreicherung von Organellen im Zentromatbereich zu quantifizieren. Kurz gesagt betrachten wir den Zentromsomenbereich als den Bereich, in dem die zentromassoziierte Organellefluoreszenz konstant bleibt oder über 70% im Fluoreszenz-/Radiusdiagramm. Es ist wichtig, diesen Parameter unter Ruhebedingungen festzulegen, da sich dieser Radius bei der Aktivierung ändern kann.
      1. Sobald Perlen- und Zellbereiche bestimmt wurden, definieren Sie die Lokalisierung des Zentromes mit der Punktwerkzeugauswahl (Abbildung 3B).
      2. Bestimmen Sie zunächst die maximale Fläche um das Zentrom, die quantifizierbar ist, indem Sie einen Kreis mit einem Radius von 3 m um das Zentromähnlich zeichnen.
      3. Verwenden Sie das ImageJ-Plugin Radial Profile, das die Fluoreszenz in konzentrischen Kreisen misst und ein Fluoreszenz-/Radiusdiagramm anzeigt.
      4. Identifizieren Sie den maximalen Radius, innerhalb deses mindestens 70 % der Fluoreszenzintensität beibehalten wird.
      5. Berechnen Sie das Fluoreszenzdichteverhältnis nach folgender Formel:
        figure-protocol-4=figure-protocol-5
        ANMERKUNG: Das Fluoreszenzdichteverhältnis gibt die Konzentration einer Organelle am Zentromims im Vergleich zu ihrer Verteilung in der gesamten Zelle an.
  2. Analyse der Zellausbreitung und -verteilung von Organellen in B-Zellen, die auf Ag-Coverlips aktiviert sind
    1. Schätzung der Organellenverteilung am IS (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Dieser Algorithmus ermöglicht die Quantifizierung der XY-Verteilung von Organellen und deren Konzentration im Zentrum des IS. Wir definieren ein Verhältnis der Fluoreszenzdichte zwischen dem zentralen und dem gesamten synaptischen Bereich. Die erhaltenen Werte können von negativ bis positiv variieren, was auf eine periphere bzw. zentrale Verteilung der Organelle hindeutet.
      1. Bestimmen Sie das Segment, in dem die Zelle mit der Abdeckung in Kontakt steht.
        HINWEIS: Um die Zellgrenzen abzugrenzen, kann man die Plasmamembran oder den Aktin kennzeichnen, der in der Peripherie des IS angereichert ist.
      2. Ändern Sie den Typ des Slices in 8-Bit, dann binarisieren (Prozess | Binär | Make Binary) und verbinden Sie die nächsten Außenseiterpunkte Prozess | Binär | umriß. Begrenzen Sie die Grenzen des Zellenbereichs (CA) mithilfe der Polygonwerkzeugauswahl.
        HINWEIS: Dieser Schritt ist nützlich, um den Kontrast der Zellgrenzen zu erhöhen und die Identifizierung zu erleichtern. An dieser Stelle ist es auch möglich, das Analyse-Partikel-Plugin von ImageJ anzuwenden, um die Zertifizierungsstelle automatisch zu bestimmen. Andere Zellen im gleichen Feld können jedoch die Ergebnisse stören.
      3. Nehmen Sie CA-Parameter (Höhe und Breite) und begrenzen Sie einen zentralen abgerundeten Bereich, der durch ein Viertel der Höhen- und Breitenwerte von den Grenzen getrennt ist, diesen Bereich als Zellenmittelpunktbereich (Cell Center Area, CCA) an.
      4. Berechnen Sie die Fluoreszenzdichteverteilung in der Mitte des IS mit der folgenden Formel:
        figure-protocol-6
    2. Messen der Organellenverteilung in Z-Ebenen (Abbildung 4C).
      HINWEIS: Diese Analyse bestimmt die allgemeine Verteilung der Organelle-Fluoreszenz über Z-Ebenen von B-Zellen, die auf Ag-Coverlips aktiviert sind, und zeigt den Prozentsatz der Fluoreszenz pro Z-Fraktion.
      1. Um die Fluoreszenzverteilung in Z zu quantifizieren, bestimmen Sie zunächst die Ebene des IS, in der die Zelle mit dem Ag-Coverslip in Kontakt steht, und dann die Ebene, die der oberen Grenze der Zelle entspricht.
      2. Zeichnen Sie eine Linie über die Zellenmitte.
      3. Schneiden Sie das Bild in Z (Bild| Stapel | Reslice), um ein XZ-Bild zu erhalten.
      4. Messen Sie die Höhe und teilen Sie das XZ-Bild in 10 aufeinander folgende Rechtecke der gleichen Höhe (Z-Fraktion) von unten (IS-Schnittstelle) nach oben (obere Seite der Zelle) und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal in jedem.
      5. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität jeder Z-Fraktion um die Summe der Gesamtfluoreszenz der 10 Fraktionen.
      6. Zeichnen Sie den Prozentsatz der Fluoreszenzintensität pro Z-Anteil der Zelle.

5. Isolierung der zentromangereicherten Fraktion von ruhenden und aktivierten B-Zellen

HINWEIS: Halten Sie alle Lösungen während des Experiments bei 4 °C, um einen Proteinabbau zu vermeiden. Dieses Protokoll wurde von früheren Arbeiten17,18angepasst.

  1. Aktivieren Sie 2 x 107 B Zellen mit Ag-beschichteten Perlen in 2 ml KLICKmedium + 2% hitzeinaktivierte FBS (Verhältnis 1:1). Betrachten Sie nicht aktivierte B-Zellen als ruhende B-Zellen.
  2. Cytochalasin D (2 m) und Nocodazol (0,2 m) hinzufügen und 1 h bei 37 °C brüten.
    HINWEIS: Diese Medikamente werden verwendet, um das Zentromos sanft vom Kern zu lösen, indem Actin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli depolymerisiert werden, um eine nukleare Kontamination zu vermeiden.
  3. Waschen Sie jede Probe mit 5 ml kaltem 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) und dann mit 1 ml 0,1x TBS, ergänzt mit 8% Saccharose.
  4. Resuspend the cells with 150 'L of centrosome lysis buffer (1 mM HEPES, pH 7.2, 0.5% NP-40, 0.5 mM MgCl2, 0.1% beta-Mercaptoethanol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) oder Proteasehemmer-Cocktail) und Pipette bis zur Viskosität abnimmt, was darauf hinweist, dass die Zelllyse in der Probe identifiziert wird. Legen Sie die Probe in ein 1,5 ml Rohr.
  5. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die Organellen vom Zellkern zu trennen.
  6. Den Überstand vorsichtig wiederherstellen und auf ein 1,5 ml-Rohr mit 300 l Gradientenpuffer (GB) (10 mM PIPES pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% Beta-Mercaptoethanol) mit 60% Saccharose legen.
  7. Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C, um die Zentromys in der 60%igen Saccharosefraktion zu konzentrieren.
  8. In der Zwischenzeit bereiten Sie einen diskontinuierlichen Gradienten in 2 ml Ultrazentrifugenrohren vor, indem Sie 450 l GB + 70 % Saccharose mit 270 l GB + 50 % Saccharose und dann 270 l GB + 40 % Saccharose überlagern.
  9. Nach der ersten Zentrifugation (zentromkonzentrierte Fraktion) den oberen Bruch (weniger dichter Teil) entsorgen, bis die Schnittstelle erreicht ist, und wirbeln Sie die verbleibende Probe im Rohr. Dann überlagern Sie auf dem diskontinuierlichen Gradienten, der zuvor mit der zentromigen angereicherten Probe vorbereitet wurde.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den Gradienten nicht zu stören, alle Pipettiervorgänge müssen sorgfältig durchgeführt werden.
  10. Zentrifuge bei 40.000 x g für 1 h bei 4 °C bei minimaler Beschleunigung und mit absetzender Zentrifugebremse, um eine Störung des Gefälles zu vermeiden.
  11. Sammeln Sie 12 Fraktionen von 100 l in separate Röhren, beginnend von oben.
  12. Identifizieren Sie die zentromisch angereicherten Fraktionen durch Immunoblot unter Verwendung von S-Tubulin als Zentromit-Marker.
    HINWEIS: Wir finden in der Regel zentromangereicherte Extrakte zwischen den Fraktionen 6 und 8.

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Ergebnisse

Der vorliegende Artikel zeigt, wie B-Zellen mit immobilisiertem Antigen auf Perlen oder Coverlips aktiviert werden können, um die Bildung eines IS zu induzieren. Wir liefern Informationen darüber, wie die Polarisation verschiedener Organellen durch Immunfluoreszenz identifiziert und quantifiziert werden kann und wie Proteine charakterisiert werden können, die dynamische Veränderungen in ihrer Assoziation zum Zentromat erfahren, das mit hilfe eines biochemischen Ansatz.

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Diskussion

Wir beschreiben eine umfassende Methode, um zu untersuchen, wie B-Lymphozyten ihre intrazelluläre Architektur neu organisieren, um die Bildung eines IS zu fördern. Diese Studie umfasst den Einsatz von bildgebenden Verfahren zur Quantifizierung der intrazellulären Verteilung von Organellen, wie Zentrom, Golgi-Apparat und Lysosomen während der B-Zellaktivierung, und wie sie zum IS polarisieren. Zusätzlich beschreiben wir einen biochemischen Ansatz zur Untersuchung von Veränderungen in der Zentromsomenzusammensetzung bei de...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

M.-I.Y. wird durch ein Forschungsstipendium von FONDECYT #1180900 unterstützt. J.I., D.F. und J.L. wurden durch Stipendien der Comisién Nacional de Ciencia y Tecnologa unterstützt. Wir danken David Osorio von der Pontificia Universidad Catélica de Chile für die Videoaufnahme und -bearbeitung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cellsATCCTIB-208Murinares B-Zell-Lymphom vom Balb/c-Typ, das auf seiner Oberfläche einen IgG-enthaltenden BCR ohne FcγIIR exprimiert
100% MethanolFisher ScientificA412-4
10 mm Durchmesser Deckgläser Dicke Nr. 1 kreisförmigMarienfield-Superior111500
2-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 Fluor- Esel anti-Kaninchen IgG LifeTech A212061:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Alexa Fluor 546 Ziege anti-Kaninchen  IgGThermo Fisher Scientific A-110711:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Alexa Fluor 647-konjugiertes PhalloidinThermo Fisher Scientific A212381:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zum Mischen der Transfektionsreagenzien mit der DNA
Amaxa Nucleofector Modell 2bLonzaAAB-1001Programm L-013 verwendet
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrin Abcamab4448 1:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Anti-rab6Abcamab959541:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Anti-sec61Abcamab155751:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Kulturplatte T25BD353014
Fiji SoftwareFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutaminThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydSigma G7651 
GlycinWinkler BM-0820
Ziege-anti-Maus IgG-AntikörperJackson ImmunoResearch315-005-003IIA1.6 positives Ligand
Ziege-anti-Maus IgM-AntikörperThermo Fisher Scientific31186IIA1.6 negatives Ligand
HyClone Fetales bovines SerumThermo Fisher ScientificSH30071.03Bei 56 oC für 30 min inaktivieren
KClWinklerPO-1260
Leica SP8 TCS MikroskopLeica
NaClWinklerSO-1455
Nikon Eclipse Ti-E Epifluoreszenzmikroskop Nikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehydMerck30525-89-4Auf 4% mit PBS in einem Sicherheitsschrank verdünnen, im Moment verwenden
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Flüssig
Polybead Amino Mikrosphären 3,00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysinSigmaP8920Mit sterilem Wasser verdünnen
Kaninchen-Anti-alpha-Tubulin-AntikörperAbcamab61601:1000 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Kaninchen-Anti-Maus-Lamp1-AntikörperCell signaling32431:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Kaninchen-Anti-cep55 Abcamab1704141:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Kaninchen-Anti-Gamma-Tubulin-Antikörper Abcamab16504 1:1000 für Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
Saponin Merck558255
NatriumpyruvatThermo Fisher Scientific11360070
SaccharoseWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
Röhrchen 50 mlCorning353043

Referenzen

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Schlagwörter

B Zell AktivierungCentrosom RekrutierungLysosom SekretionActin RemodellierungImmunfluoreszenzf rbungKonfokalmikroskopieWestern Blot AnalyseSaccharose Gradientenzentrifugation

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