Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Zusammenfassung

Hierin beschreiben wir zwei Ansätze zur Charakterisierung von Zellpolarisationsereignissen in B-Lymphozyten während der Bildung eines IS. Die erste betrifft die Quantifizierung der Organellenrekrutierung und Zytoskelett-Umlagerungen an der synaptischen Membran. Der zweite ist ein biochemischer Ansatz, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Zentrosoms zu charakterisieren, die polarisiert werden, um die Immunsynapse zu polarisieren.

Zusammenfassung

Die Erkennung von oberflächengebundenen Antigenen durch den B-Zell-Rezeptor (BCR) löst die Bildung einer Immunsynapse (IS) aus, bei der sowohl signalierte als auch Antigenaufnahme koordiniert werden. Die IS-Bildung beinhaltet eine dynamische Aktin-Umgestaltung, begleitet von der polarisierten Rekrutierung zur synaptischen Membran des Zentromes und der damit verbundenen intrazellulären Organellen wie Lysosomen und des Golgi-Apparats. Erste Stadien der Aktin-Umgestaltung ermöglichen es B-Zellen, ihre Zelloberfläche zu erhöhen und die Menge an Antigen-BCR-Komplexen zu maximieren, die an der Synapse gesammelt werden. Unter bestimmten Bedingungen, wenn B-Zellen Antigene erkennen, die mit starren Oberflächen verbunden sind, ist dieser Prozess mit der lokalen Rekrutierung und Sekretion von Lysosomen gekoppelt, die die Antigenextraktion erleichtern können. Aufgenommene Antigene werden in spezialisierte Endolysosome-Fächer zur Verarbeitung in Peptide verinnerlicht, die zur weiteren Darstellung von T-Helferzellen auf den Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC-II) geladen werden. Daher ist das Studium der Organellendynamik im Zusammenhang mit der Bildung eines IS entscheidend, um zu verstehen, wie B-Zellen aktiviert werden. In diesem Artikel werden wir sowohl bildgebende als auch eine biochemische Technik zur Untersuchung von Veränderungen in der intrazellulären Organellenpositionierung und Zytoskelett-Umlagerungen diskutieren, die mit der Bildung eines IS in B-Zellen verbunden sind.

Einleitung

B-Lymphozyten sind ein wesentlicher Bestandteil des adaptiven Immunsystems, das für die Produktion von Antikörpern gegen verschiedene Bedrohungen und eindringende Krankheitserreger verantwortlich ist. Die Effizienz der Antikörperproduktion wird durch die Fähigkeit von B-Zellen bestimmt, Antigene zu erfassen, zu verarbeiten und zu präsentieren, die entweder in einer löslichen oder oberflächengebundenen Form^1,2angetroffen werden. Die Erkennung von Antigenen, die an der Oberfläche einer präsentierenden Zelle befestigt sind, durch die BCR führt zur Bildung eines engen interzellulären Kontakts, der ALS IS

Protokoll

HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden mit IIA1.6 B-Zellen durchgeführt.

1. B-Zell-Aktivierung mit antigenbeschichteten Perlen

1. Herstellung von antigenbeschichteten Perlen
   1. Um B-Zellen zuaktivieren, verwenden Sie NH 2-Perlen, die kovalent mit Antigen (Ag-beschichtete Perlen) beschichtet sind, die mit 50 l (ca. 20 x 10⁶ Perlen) von 3 'm NH 2-Perlen mit aktivierenden (BCR-Ligand+) oder nicht aktivierenden (BCR-Ligand-) Antigenen hergestellt werden.
   2. Für IIA1.6 B-Zellen verwenden Anti-IgG-F(ab')₂ Fragment als BCR-ligand+ und anti-IgM-F(ab')₂ oder Rinderserumalbumin ....

Ergebnisse

Der vorliegende Artikel zeigt, wie B-Zellen mit immobilisiertem Antigen auf Perlen oder Coverlips aktiviert werden können, um die Bildung eines IS zu induzieren. Wir liefern Informationen darüber, wie die Polarisation verschiedener Organellen durch Immunfluoreszenz identifiziert und quantifiziert werden kann und wie Proteine charakterisiert werden können, die dynamische Veränderungen in ihrer Assoziation zum Zentromat erfahren, das mit hilfe eines biochemischen Ansatz.

Diskussion

Wir beschreiben eine umfassende Methode, um zu untersuchen, wie B-Lymphozyten ihre intrazelluläre Architektur neu organisieren, um die Bildung eines IS zu fördern. Diese Studie umfasst den Einsatz von bildgebenden Verfahren zur Quantifizierung der intrazellulären Verteilung von Organellen, wie Zentrom, Golgi-Apparat und Lysosomen während der B-Zellaktivierung, und wie sie zum IS polarisieren. Zusätzlich beschreiben wir einen biochemischen Ansatz zur Untersuchung von Veränderungen in der Zentromsomenzusammensetzung bei de.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells	ATCC	TIB-208	Murinares B-Zell-Lymphom vom Balb/c-Typ, das auf seiner Oberfläche einen IgG-enthaltenden BCR ohne FcγIIR exprimiert
100% Methanol	Fisher Scientific	A412-4
10 mm Durchmesser Deckgläser Dicke Nr. 1 kreisförmig	Marienfield-Superior	111500
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Alexa 488 Fluor- Esel anti-Kaninchen IgG	LifeTech	A21206	1:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Alexa Fluor 546 Ziege anti-Kaninchen  IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11071	1:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Alexa Fluor 647-konjugiertes Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A21238	1:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Amaxa Nucleofection kit V	Lonza	VCA-1003	Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zum Mischen der Transfektionsreagenzien mit der DNA
Amaxa Nucleofector Modell 2b	Lonza	AAB-1001	Programm L-013 verwendet
Amino- Dynabeads	ThermoFisher	14307D
Anti-pericentrin	Abcam	ab4448	1:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Anti-rab6	Abcam	ab95954	1:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Anti-sec61	Abcam	ab15575	1:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
BSA	Winkler	BM-0150
CaCl2	Winkler	CA-0520
Kulturplatte T25	BD	353014
Fiji Software	Fiji col.
Fluoromount G	Electron Microscopy Science	17984-25
Glutamin	Thermo Fisher Scientific	35050061
Glutaraldehyd	Sigma	G7651
Glycin	Winkler	BM-0820
Ziege-anti-Maus IgG-Antikörper	Jackson ImmunoResearch	315-005-003	IIA1.6 positives Ligand
Ziege-anti-Maus IgM-Antikörper	Thermo Fisher Scientific	31186	IIA1.6 negatives Ligand
HyClone Fetales bovines Serum	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03	Bei 56 oC für 30 min inaktivieren
KCl	Winkler	PO-1260
Leica SP8 TCS Mikroskop	Leica
NaCl	Winkler	SO-1455
Nikon Eclipse Ti-E Epifluoreszenzmikroskop	Nikon
Parafilm	M	P1150-2
Paraformaldehyd	Merck	30525-89-4	Auf 4% mit PBS in einem Sicherheitsschrank verdünnen, im Moment verwenden
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Flüssig
Polybead Amino Mikrosphären 3,00μm	Polyscience	17145-5
Poly-L-Lysin	Sigma	P8920	Mit sterilem Wasser verdünnen
Kaninchen-Anti-alpha-Tubulin-Antikörper	Abcam	ab6160	1:1000 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Kaninchen-Anti-Maus-Lamp1-Antikörper	Cell signaling	3243	1:200 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Kaninchen-Anti-cep55	Abcam	ab170414	1:500 Verdünnung empfohlen, sollte aber optimiert werden
Kaninchen-Anti-Gamma-Tubulin-Antikörper	Abcam	ab16504	1:1000 für Western Blot
RPMI-1640	Biological Industries	01-104-1A
Saponin	Merck	558255
Natriumpyruvat	Thermo Fisher Scientific	11360070
Saccharose	Winkler	SA-1390
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Röhrchen 50 ml	Corning	353043