Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.
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Methodenartikel
Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mechanische Reize sind dafür bekannt, biologische Funktionen von Zellen und Geweben zu modulieren. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Druckstress die Knorpelarchitektur der Wachstumsplatte verändert und zu einer Wachstumsmodulation langer Knochen von Kindern führt. Um die Rolle der Druckspannung beim Knochenwachstum zu bestimmen, haben wir ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das durch pneumatischen Druck betätigt wird, um Wachstumsplattenchondrozyten, die in Alginat-Hydrogel-Zylinder eingebettet sind, dynamisch (oder statisch) zu komprimieren. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Methoden zum Herstellung und Charakterisieren dieses Geräts. Die Vorteile unseres Protokolls sind: 1) Fünf verschiedene Größen von Druckspannung können auf fünf technischen Replikationen in einer einzigen Plattform erzeugt werden, 2) Es ist einfach, Zellmorphologie über ein herkömmliches Lichtmikroskop zu visualisieren, 3) Zellen können schnell isoliert werden vom Gerät nach der Kompression, um nachgeschaltete Assays zu erleichtern, und 4) Die Plattform kann angewendet werden, um Mechanobiologie jeder Zellart zu studieren, die in Hydrogelen wachsen kann.
Einleitung
Mikroentwickelte Plattformen sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der molekularen, zellulären und Gewebebiologie, da sie eine dynamische Steuerung sowohl der physikalischen als auch der chemischen Mikroumgebungen ermöglichen1,2,3 ,4,5,6,7,8. So können mehrere Hypothesen gleichzeitig streng kontrolliert getestet werden. Im Falle des Wachstumsplattenknorpels gibt es zunehmend Hinweise auf eine wi....
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Protokoll
HINWEIS: Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe und Labormantel für jeden Schritt in diesem Protokoll.
1. Meister formherstellung
HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.1 - 1.3 in einer Dunstabzugshaube aus.
- Glasbehandlung
HINWEIS: Tragen Sie einen Gesichtsschutz, Handschuhe und einen Labormantel für Schritt 1.1.- Machen Sie Piranha-Lösung (60 ml) durch Mischen von Schwefelsäure(H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2) mit einem Volumenverhältnis von 3:1.
VORSICHT: Verwenden Sie piranha-Lösung und Aceton aufgrund der Explosionsgefahr nich....
- Machen Sie Piranha-Lösung (60 ml) durch Mischen von Schwefelsäure(H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2) mit einem Volumenverhältnis von 3:1.
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Ergebnisse
Dieser Artikel zeigt detaillierte Schritte der mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgerätefertigung (Abbildung 2). Das Gerät enthält 5 x 5 Arrays von zylindrischen Alginat-Chondrozytenkonstrukten, und diese Konstrukte können mit fünf verschiedenen Komprimierungsgrößen komprimiert werden(Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Höhe des pneumatischen Mikrokanals beträgt ca. 90 m, und die PDMS-.......
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Diskussion
Um die Auswirkungen der Druckspannung auf Wachstumsplattenchondrozyten zu testen, haben wir das mikrofluidische Chondrozytenkompressionsgerät (Abbildung 1) entwickelt, um verschiedene Druckgrade auf die Chondrozyten im Alginat-Hydrogelgerüst für 3D anzuwenden. Kultur auf hochdurchsatzweise. Um andere Forscher bei der Einführung unseres Geräts oder der Entwicklung ähnlicher Geräte zu unterstützen, haben wir in diesem Protokollartikel Details zu den Schritte zur Geräteherstellung bereitgestell.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Drs. Christopher Moraes und Stephen A. Morin für ihre Unterstützung bei gerätedesign und -herstellung. Diese Studie wurde durch das Bioengineering for Human Health Stipendium der University of Nebraska-Lincoln (UNL) und des University of Nebraska Medical Center (UNMC) und das Stipendium AR070242 vom NIH/NIAMS unterstützt. Wir danken Janice A. Taylor und James R. Talaska von der Advanced Microscopy Core Facility am University of Nebraska Medical Center für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| (3-Aminopropyl)triethoxysilan (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluor-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylplatte | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Luftpumpe | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | Wir haben das Modell verwendet, das 2015 gekauft wurde. Anfang 2016 wurden das interne Design und die Leistung der Luftpumpe (SP 500 EC-LC) geändert. Auch die Leistung der Luftpumpe hat sich im Laufe der Zeit verändert. Daher sollte der von einer SP 500 EC-LC Luftpumpe erzeugte Luftdruck vor dem Einsatz kalibriert werden. |
| Alginatpulver | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metallrohr) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Gefärbte rote wässrige fluoreszierende Partikel | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Schaumstoffpolster | GRAINGER | Artikel # 5GCE8 | |
| Funktion / Arbiträrsignalgenerator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Salzsäure | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Wasserstoffperoxid | Fisher BioReagenzien | BP2633500 | |
| Isopropylalkohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Objektträger | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasmareiniger | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxan (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5KG | |
| Netzteil | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Natriumhydroxid | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Magnetverteiler | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Magnetventil | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin Coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Entwickler | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Schwefelsäure | EMD Millipore | MSX12445 |
Referenzen
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskelet....
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Nachdrucke und Genehmigungen
