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Human neurale Organoide zur Untersuchung von Hirntumor und neurodegenerativen Erkrankungen

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DOI:

10.3791/59682

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28. Juni 2019

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1Laboratory of Tumor Immunology, Translational Research Center in Onco-Hematology, Department of Internal Medicine Specialties, Faculty of Medicine, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, University Medical Center, University of Geneva, 3Laboratory of Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring, Geneva University Hospitals, 4Tissue Engineering Laboratory, Hepia/HES-SO, University of Applied Sciences Western Switzerland, 5Laboratory of Experimental cell therapy, Department of Diagnostics, Geneva University Hospitals

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie stellt Protokolle vor und beschreibt Protokolle, um zwei spezifische menschliche neurale Organoide als relevantes und genaues Modell für die Untersuchung von 1) der Entwicklung des menschlichen Glioblastoms innerhalb menschlicher neuronaler Organoide ausschließlich beim Menschen und 2) neuronendopaminergen Organoiden abzuleiten. Differenzierung, die ein dreidimensionales Organoid erzeugt.

Zusammenfassung

Das Fehlen relevanter in vitro neuronaler Modelle ist ein wichtiges Hindernis für den medizinischen Fortschritt für Neuropathologien. Die Erstellung relevanter zellulärer Modelle ist entscheidend, um sowohl die pathologischen Mechanismen dieser Krankheiten besser zu verstehen als auch neue therapeutische Ziele und Strategien zu identifizieren. Um relevant zu sein, muss ein In-vitro-Modell die pathologischen Merkmale einer menschlichen Krankheit reproduzieren. Im Kontext neurodegenerativer Erkrankungen sollte jedoch ein relevantes In-vitro-Modell den Neurozellersatz als wertvolle therapeutische Chance bieten.

Ein solches Modell würde nicht nur das Screening therapeutischer Moleküle ermöglichen, sondern kann auch zur Optimierung der differenzierungsabhängigen Protokolle verwendet werden [z. B. im Zusammenhang mit der Transplantation bei der Parkinson-Krankheit (PD)]. Diese Studie beschreibt zwei In-vitro-Protokolle der Entwicklung des menschlichen Glioblastoms innerhalb eines menschlichen neuralen Organoids (NO) und 2) neuronendopaminergen (DA) Differenzierung, die ein dreidimensionales (3D) Organoid erzeugt. Zu diesem Zweck wurde ein gut standardisiertes Protokoll erstellt, das die Produktion größenkalibrierter Neurosphären ermöglicht, die aus der Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) abgeleitet sind. Das erste Modell kann verwendet werden, um molekulare und zelluläre Ereignisse zu offenbaren, die während der Glioblastom-Entwicklung innerhalb des neuronalen Organoids auftreten, während das DA-Organoid nicht nur eine geeignete Quelle von DA-Neuronen für die Zelltherapie bei Parkinson darstellt, sondern auch für Drogentests verwendet werden.

Einleitung

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) stuft Astrozytome als minderwertig (Grad I bis II) oder hochgradig (Klasse III und IV) ein. Glioblastom multiforme (GBM) ist ein Astrozytom Grad IV, der tödlichste der primären Hirntumoren, das gegen alle aktuellen Behandlungsformen resistent ist1. Trotz der Standardtherapie einschließlich Neurochirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie bleibt GBM tödlich und die 15-monatige Gesamtüberlebensrate hat sich in den letzten 15 Jahren nicht dramatisch verändert2. Um signifikante Fortschritte beim Verständnis der GBM-Pathogenese zu erzielen, ist die Verwendung relevanter Modelle von entscheidender Bedeutung. Bisher stützte sich die Studie von GBM auf Zelllinien, organotypische Nagetierscheiben und Xenotransplantation von patientenabgeleiteten Zellen in Mäuse oder transgene Mäuse, die spontane Tumoren entwickeln3,4. Obwohl diese Modelle nützlich waren, um Gehirnmetastasen und Tumoraggressivität zu untersuchen, sind sie durch Unterschiede zwischen den Arten eingeschränkt, und daraus resultierende Schlussfolgerungen können falsch in menschliches Gewebe übersetzt werden. Darüber hinaus werden bestehende Modelle mit menschlichen Zellen auch durch das Fehlen von Wirtsgewebe/Tumor-Wechselwirkungen3,4begrenzt. Experimentelle Modelle sind entscheidend für die Übersetzung von der Grundlagenforschung in therapeutische Ziele. Daher kann die Beschreibung eines Protokolls zur Herstellung von in vitro humanen neuralen Organoiden, die mit GBM-initiierenden Zellen (GICs) kokultiviert sind, ein relevantes System bereitstellen, das morphologische und funktionelle Merkmale der GBM-Entwicklung imitiert. Dieses System reproduziert einige In-vivo-Merkmale der GBM-Entwicklung, wie die diffuse Migration von eindringenden Zellen und Nekrosebereichen, und es hebt die für die Tumorbiologie relevante Genexpression hervor. Wie bereits gezeigt, werden einige kritische microRNAs während der GIC-Entwicklung innerhalb des 3D-Nervengewebes5,6induziert.

PD ist eine wichtige neurodegenerative Erkrankung und mit der Degeneration mehrerer neuronaler Subtypenverbunden 7. Auch wenn ein fortschreitender Auftreten der Symptome (z. B. Bradykinesie, asymmetrisches Restzittern, Steifigkeit und Haltungsinstabilität) die Krankheit charakterisiert, ist ihre genaue Ätiologie nicht eindeutig erwiesen. Tatsächlich haben viele Studien Gezeigt, dass wichtige Risikofaktoren aus einer Kombination von genetischen und ökologischen Faktoren resultieren können. Parkinson-Symptome sind mit der bilateralen Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substancia nigra (SN) verbunden, was zum Verschwinden von dopaminergen (DA) Axonen führt, die auf das Striatum8,9projizieren. Daher ist die Reduktion der striatalen Dopaminspiegel mit dem Fortschreiten der motorischen Dysfunktion bei PD-Patienten korreliert. Dopaminerge Neuronen enthalten Tyrosinhydroxylase (TH), ein Schlüsselenzym bei der Synthese von katecholaminergen Neurotransmittern, die die Aminosäure L-Tyrosin in L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA, ein Dopamin-Vorläufer) in Dopamin10umwandelt. Der frühe Verlust der TH-Aktivität gefolgt von einem Rückgang der TH-Proteinexpression ist ein Kennzeichen von PD.

Diese Studie beschreibt zwei Protokolle mit menschlichen neuronalen Organoiden, wobei eines speziell auf einen Midbrain-ähnlichen Phänotyp ausgerichtet ist, der mit TH-positiven Zellen angereichert ist.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Universität Genf.

1. Erhaltung und Kultur undifferenzierter menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs)

  1. Führen Sie die Wartung und Erweiterung von hSECs unter feederfreien Bedingungen durch Vorbeschichtung von Geschirr mit einer spezifischen extrazellulären Matrix durch.
    1. 300 l extrazelluläre Matrix bei 4 °C auftauen (typische Bereichskonzentration 18-22 mg/ml, auf Eis halten) und vorsichtig mit 15 ml kaltem DMEM-Medium mischen, um eine vorzeitige Gelation der extrazellulären Matrix zu vermeiden. Fügen Sie den beiden T150-Flaschen 7,5 ml der extrazellulären Matrize hinzu.
    2. Inkubieren Sie die mit extrazellulärer Matrix beschichteten Gerichte mindestens 1 h (maximal über Nacht) bei 37 °C.
    3. Entfernen Sie die mittleren und Samen-HESCs auf eine Dichte von 6,5 x 104 Zellen/cm2.
  2. Bewahren Sie H1 (hESC-Zelllinie) in hESC medium und 1% Penicillin/Streptomycin auf.
  3. Passieren Sie die Zellen mit enzymatischem Verfahren: 7,5 ml enzymatische Lösung zu einem T75cm2 Kolben über einen Zeitraum von 1-2 min bei 37 °C hinzufügen. Sobald die Zellen vollständig abgetrennt sind, 7,5 ml DMEM-F12 hinzufügen und dann zentrifugieren für 5 min bei 300 x g. Um ein besseres Überleben zu ermöglichen, re-plate Zellen mit der gewünschten Dichte auf extrazelluläre Matrix-beschichtete Gerichte, im gleichen Medium mit Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK) Inhibitor (10 'M) für 24 h.

2. hESC-abgeleitete neuronale Organoide für GBM-Studien

  1. 24 h vor Beginn der 3D-Kultur, ersetzen Sie das hESC-Medium durch ein serumfreies Medium, das durch 10 M ROCK-Hemmer ergänzt wird (beide Komponenten sind notwendig, um das Zellüberleben und die spontane Neurosphärenbildung während der Aggregationsphase in einem Mikrowell zu unterstützen Platte). Die Zellen sollten bei 60% Konfluenz sein. Am nächsten Tag (Tag 0) hESC-Kolonien als Einzelzellen ablösen: das Medium entfernen, dann mit PBS ohne Ca2+/Mg2+abspülen, 5 ml enzymatische Auflösungslösung hinzufügen und bei 37 °C für 1-2 min brüten.
  2. Sammeln Sie die Zellen in serumfreiem Medium mit 10 M ROCK-Hemmer und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und zählen Sie die Zellen in 10 ml serumfreies Medium, ergänzt mit 10 'M ROCK-Hemmer.
  3. Parallel dazu spülen Sie die Mikrowellplatte mit 2 ml serumfreiem Medium pro Brunnen ab und zentrifugieren Sie die Platte bei 1200 x g für 5 min, um alle Blasen zu entfernen, was die Bildung von Neurosphären verhindern kann.
  4. Bereiten Sie 28,2 x 106 Zellen in 12,5 ml serumfreiem Medium vor, ergänzt durch 10 'M ROCK-Hemmer. Verteilen Sie 1000 Zellen/Mikrowell. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und legen Sie die Platte über Nacht bei 37 °C (maximal 36 h) in den Inkubator. Zum Beispiel: Um 30 menschliche neuronale Organoide zu erhalten, verwenden Sie einen T150-Kolben bei 70%-80% des Zusammenflusses (ca. 30 Millionen Zellen).
  5. Am nächsten Tag (Tag 1) sammeln Sie die Kugeln (mit einem P1000) und legen Sie sie in eine 6-Brunnen-Platte. In jedem Brunnen, fügen Sie 2 ml B27 medium und DMEM-F12 GlutaMAX und Neurobasal Medium (Mix bei 1:1), ergänzt mit 1% B27 Ergänzungen und 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA). Um eine schnelle neuronale Induktion zu fördern, ergänzen Sie das Medium mit einem Dual-SMAD-Hemmungscocktail, der aus 10 M TGF/Activin/Nodal-Inhibitor und einem 0,5-M-Knochenmorphogenprotein-Inhibitor (BMP) besteht. Von diesem Schritt vorwärts werden die Kugeln in Rotation kultiviert (60 Rpm, Orbital-Shaker). Die Drehung ist entscheidend, um zu verhindern, dass die Kugeln zusammen oder an der Platte kleben.
  6. Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage: biegen Sie die Platte und lassen Sie die Kugeln fallen für 5 min, entfernen Sie die Hälfte des Mediums (2 ml), und fügen Sie 2 ml frisches B27 Medium mit Wachstumsfaktoren und Inhibitoren ergänzt. Zentrifugieren Sie die Kugeln nicht.
  7. Führen Sie die neuronale Induktion gemäß dem folgenden Zeitverlauf durch:
    1. Von den Tagen 1-4 Kultur die Kugeln in B27 Medium mit Dual-SMAD ergänzt. Der Dual-SMAD-Hemmungscocktail (10 M TGF/Activin/Nodal-Inhibitor und 0,5 M BMP-Hemmer) fördert die neuronale Induktion.
    2. Von den Tagen 4-11, fördern die Proliferation von hESC-abgeleiteten neuronalen Rosetten (in die Sphären), durch Zugabe von 10 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 10 ng/ml Basis-Fibroblastenfaktor (bFGF) zum B27-Medium, ergänzt mit Dual-SMAD-Cocktail.
      HINWEIS: Am 11. Tag sollten die meisten Zellen positiv für Nestin sein.
    3. Von den Tagen 11-13, Kultur die Kugeln in B27 Medium mit 0,5 M BMP-Hemmer ergänzt.
    4. Von den Tagen 13-21, Kultur die Kugeln in B27 Medium ergänzt mit 10 ng/mL glial abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF), 10 ng/mL Gehirn abgeleitetneurotrophen Faktor (BDNF) und 1 'M von '-Sekretase-Hemmer. GDNF und BDNF fördern die neuronale und gliale Differenzierung. Der Inhibitor der S-Sekretase ermöglicht eine größere neuronale Reifung.
    5. Am 21. Tag die Kugeln (ca. 1.000 Kugeln) auf eine hydrophile Polytetrafluorethylenmembran (PTFE) (6 mm Durchmesser, 0,4 m) auf einem Kulturplatteneinsatz für 6 Brunnenplatten ablagern. Beenden Sie jede Drehung aus diesem Schritt. Das Vorhandensein von Rosetten, beobachtet mit einem Hellfeldmikroskop, deutet auf die Einleitung einer neuronalen Differenzierung hin. Die neuronalen Rosetten können 2-3 Tage nach der Beschichtung von Kugeln auf der PTFE-Membran beobachtet werden.
    6. Fügen Sie 1 ml B27 Medium mit Wachstumsfaktoren und Inhibitoren (wie folgt) zu jedem Bohrplatz unter der Membraneinsatz, alle 2-3 Tage (in der Regel am Montag, Mittwoch und Freitag), für eine folgende 3 Wochen der Differenzierung.
    7. Von den Tagen 21-25 kultivieren menschliche neurale Organoide im selben neuronalen Reifungsmedium (vgl. Schritt 2.7.4).
    8. Von den Tagen 25-28 nur b27 medium mit 1 'M'-Sekesehemmer ergänzen.
    9. Ab den Tagen 28-39, hören Sie auf, den Sekretase-Inhibitor hinzuzufügen und setzen Sie die humane neuronale Organoidkultur nur im B27-Medium fort.
      HINWEIS: Nach 3 Wochen sind neuronale Organoide bereit für die GIC-Implantation. Entlang der neuronalen Reifung wurden eine Abnahme des neuronalunen unreifen Markers Nestin und eine Zunahme der reifen neuronalen Marker 3-Tubulin und GFAP beobachtet.

3. Isolierung und Kultivierung von glioblastom-initiierenden Zellen (GICs)

  1. Isolieren Sie GICs, indem Sie eine hochwertige menschliche GBM-Biopsie fragmentieren. Übertragen Sie das Tumorstück in ein Becher, das 0,25% Trypsin in 0,1 mM EDTA (4:1) enthält, und rühren Sie es langsam bei 37 °C für 30-60 min (je nach Tumorgröße).
  2. Die dissoziierten Zellen in 75 cm2 Gewebekulturkolben mit 2.500-5.000 Zellen pro cm2 in GIC-Medium: DMEM/F-12 medium (1:1) mit 1% N2, 1% B27 und 1% G5-Ergänzungen (zur Begünstigung des GIC-Überlebens), ergänzt mit bFGF und EGF (beide bei 10 ng/Ml, zur Förderung der Stängel) und 1% von Penicillin/Streptomycin.
  3. Sobald der GIC etabliert ist und wächst, entfernen Sie die N2 und G5 Ergänzungen aus dem GIC-Medium.
  4. Einen Tag vor dem Hinzufügen der Zellen auf das Organoid, dissoziieren Sie die GICs und zählen Sie sie.
  5. Spülen Sie die Mikrowell-Platte mit 2 ml GIC-Medium und zentrifugieren Sie die Platte mit der maximalen Geschwindigkeit, um Blasen zu entfernen (1000 x g). Platzieren Sie die GICs bei 1.000 Zellen, um eine Gliosphäre pro Mikrowell zu erhalten. Über Nacht bei 37 °C inkubieren (Abbildung 1C). Dieser Schritt ist der Schlüssel und ermöglicht gut kalibrierte GICs (ein Beispiel für nekrotische und übergroße GICs ist in Abbildung 2A,C) dargestellt.
  6. Um eine GBM-Invasion zu initiieren, fügen Sie eine Gliomasphäre auf das Neuralgewebe mit einer großen Rohrleitungsspitze mit einer großen Bohrung (Abbildung 1F) hinzu. Legen Sie die 6 Brunnenplatte vorsichtig wieder in den Inkubator.

4. hESC-abgeleitete dopaminerge Organoide für PD-Studien

  1. Tag 0: Amplify hESCs in 2D-Kultur bis zu 60% Konfluenz (Tag 0), dann ersetzen Stammzellmedien verwendet, um Pluripotenz-Features von hESCs durch ein Serum-freies Medium zu erhalten. Beginnen Sie die neuronale Induktion, indem Sie das Kulturmedium mit einem 0,5-M-BMP-Hemmer und einem 10-M-TGF-/Activin/Nodal-Inhibitor (Dual-SMAD-Inhibitionscocktail) ergänzen und dann 10-M-ROCK-Hemmer für 24 h hinzufügen, um die Überlebensrate der Zellen während des Durchgangs zu erhöhen.
  2. Tag 1: Bereiten Sie die Mikrowell-Platte mit 2,5 ml pro Brunnen serumfreies Medium vor, ergänzt durch 0,5 M BMP-Hemmer, 10 M TGF/Activin/Nodal-Inhibitor und 10-M-ROCK-Hemmer. Um Zellen in Richtung des ventralen Musters des Neuralrohrs anzugeben, fügen Sie 100 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 (FGF8) und 2 m geglätteten Agonisten hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte (nur mit medium und ohne Zellen) bei 1200 x g für 5 min, um Luftblasen aus den Mikrobrunnen zu entfernen.
    1. Nach 1 Tag neuronaler Induktion in 2D, entfernen Sie das Medium und waschen Sie schnell mit PBS ohne Ca2+/MgCl2+. Dissoziieren Sie die Kolonien in Einzelzellen Suspension durch Zugabe von 7,5 ml rekombinante enzymatische Lösung in einem T75cm2 Kolben. 2 min bei 37 °C inkubieren und dann mit 7,5 ml DMEM-F12 komplettieren.
    2. Sammeln Sie die Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und zählen Sie die Zellen in dem gleichen Medium, das verwendet wird, um die Mikrowellplatte vorzubereiten.
    3. Passen Sie das mittlere Volumen an, um eine Zellsuspension zu erhalten, die es ermöglicht, Neurosphären mit 1000 Zellen pro Mikrowell zu bilden (z. B. enthält die hier verwendete Mikrowellplatte 4.700 Mikrobrunnen pro Brunnen). So bereiten Sie 4,7 Millionen Zellen in 2,5 ml Medium vor und fügen Sie es zu den vorherigen 2,5 ml Medium bereits in der Platte platziert.
    4. Um die Zellen in jedem Mikrobrunnen richtig zu verteilen, schütteln Sie die Platte vorsichtig und zentrifugieren Sie die Mikrowellplatte 300 x g für 5 min. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 24 h, um Kugeln zu erzeugen.
  3. Tag 2: Spülen Sie die Mikrobrunnen vorsichtig mit dem Medium und sammeln Sie dann die Kugeln in gewebebehandelte Sechs-Brunnen-Platte übertragen. Ersetzen Sie Medium durch neurobasales Medium, ergänzt durch 1% B27, 1x NEAA, 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin. Zusätzlich, Fügen Sie Regionalisierungsfaktoren SHH, FGF8, geglättete Agonist, und Dual-SMAD Hemmung kleine Moleküle.
    1. Kugelkugeln bei 37 °C (60 Rpm, Orbitalshaker) in Rotation platzieren und alle 2-3 Tage halbmittel frisch ergänzt wechseln.
  4. Tag 3: Um die neuronale Induktion zu verbessern und in neuronale Vorläufer mit einer Midbrain-Identität umzuwandeln, ergänzen Sie das Medium mit 3 'M GSK-3'-Hemmer, der den Wnt/-Catenin-Weg aktiviert. Halten Sie den GSK-3-Inhibitor im Medium bis zum 13. Tag auf. Aufgeteilt in zwei neue gewebebehandelte 6 Brunnenplatten, um beide Kugeldichten pro Brunnen zu reduzieren und eine Kugelaggregation zu vermeiden.
    HINWEIS: An Tag 8 sollten die meisten Zellen positiv für Nestin sein.
  5. Tag 8: Beginn der neuronalen Reifung: Ersetzen Sie die Regionalisierungsfaktoren SHH, FGF8, geglätteter Agonist und Dual-SMAD-Hemmungscocktail mit 0,5 mM Dibutyryl-cAMP (zur Begünstigung der Reifung), 20 nM-Inhibitor der Histondeacetylase (für den Zellzyklusaustritt), 1 M-Sekresäse Inhibitor- und Wachstumsfaktoren, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL transformierender Wachstumsfaktor 3 (TGF3) und 5 ng/mL FGF20 (beide bevorzugen das Überleben von DA-Vorläufern). Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage.
  6. Tag 21: Generieren Sie das neuronale Organoid: Samen um 100 Neurosphären unter luft-flüssigen Grenzbedingungen auf PTFE-Membran (6 mm Durchmesser). Übertragen Sie die Membran auf einen Kulturplatteneinsatz (0,4 mm) und fügen Sie 1,2 ml neuronales Reifungsmedium hinzu, das für die Neurosphärendifferenzierung verwendet wird, wie zuvor beschrieben.
    1. Beenden Sie jede Drehung aus diesem Schritt. Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis der erforderliche Differenzierungszeitpunkt erreicht ist.
      HINWEIS: In Bezug auf die neuronale Reifung wurden eine Abnahme des neuronalunen unreifen Markers Nestin und eine Zunahme der reifen neuronalen Marker 3-Tubulin und GFAP beobachtet. Hohe TH- und NURR1-Ausdrücke wurden beobachtet (Abbildung 3C) und bestätigen die neuronale organoide Reife11.

5. Quantifizierung der TH- und Nurr1-Genexpression zur Validierung der dopaminergen Differenzierung

  1. RNA-Extraktion: Am angegebenen Tag der Differenzierung lyse 40 Neurosphären mit 350 L RLT-Puffer (im RNA-Extraktionskit enthalten) ergänzt mit 3,5 l 2-Mercaptoethanol. Extrahieren Sie die RNA aus den lysierten Neurosphären mit einem RNA-Extraktionskit nach den Anweisungen des Herstellers.
  2. Quantifizieren Sie die gesamten RNA-Konzentrationen.
  3. Führen Sie die Umgekehrte Transkription von 300 ng der gesamten RNA-Extraktion mit Reverse-Transkriptions-Kit für quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durch und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
  4. Führen Sie qPCR-Analysen auf Echtzeit-PCR-Erkennungssystemen durch, basierend auf der asymmetrischen Cyanin-Farbstoff-Erkennung. Normalisieren Sie die Daten mit Haushaltsgenen: Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und Dehnungsfaktor 1-alpha (EF1). Sequenzen von Primern sind in Tabelle 1beschrieben.

6. Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Detektion

  1. Verwenden Sie Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischer Detektion, um das Vorhandensein von Dopamin zu erkennen. Dopamin wurde durch Lysing neuronaler Organoide in 100 ml 0,1 N Perchlorsäure (HClO4) für 15 min bei 4 °C mit einem kräftigen Wirbeln alle 5 min extrahiert. Nach der Zentrifugation den Überstand bei -20 °C für Dopamin-Dosierung sammeln und lagern.
  2. Verwenden Sie eine C-18-Säule (5 m, 4,6 mm x 150 mm), um die Analyten durch umgekehrte Phase HPLC im isokratischen Modus mit einer Durchflussrate von 1 ml/Minute zu trennen. Der Nachweis von Dopamin sollte mit einem coulometrischen Detektor mit einer Konditionierungszelle von +200 mV durchgeführt werden.

7. Rohdatenaufzeichnung mit Microelectode-Array -Plattform (MEA)

  1. Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um Neurosphären in die Mitte eines porösen MEA-Geräts zu übertragen.
  2. Verwenden Sie einen Verstärker und ein Datenerfassungssystem für elektrophysiologische Aufnahmen. Messen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) als Standardabweichung der Spannung während einer 5-min-Aufnahme, indem Sie das Signal als durchschnittliche Spitzenspannung der in den gleichen 5 min Perioden aufgezeichneten Spitzen verwenden.

Ergebnisse

Die kritischen Schritte dieses Protokolls müssen gut identifiziert und ordnungsgemäß behandelt werden. Daher ist in Abbildung 1A und Abbildung 3A für NO plus GBM und DA neurale Organoide ein Diagramm der Kulturbedingungen dargestellt, das den Zeitraffer für jeden Schritt sowie die für das Differenzierungsprotokoll verwendeten Verbindungen angibt. Abbildung 1B,C,D,E,F zeigt die Zellen, Kugeln und NEin und zeigt die typische Morphologie für jeden Schritt. Abbildung1G,H,I veranschaulicht Die Immunfluoreszenzfärbung mit einigen neuronalen Markern.

figure-results-1
Abbildung 1 : Menschliches neurales Organoid (NO) Differenzierungsprotokoll. (A) Standardisiertes Protokoll zur Erzeugung von NO aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESC). (B) hESCs werden auf extrazellulärer Matrix im hESC-Medium gepflegt. (C) Microwell-Platten wurden verwendet, um kalibrierte Neurosphären zu erzeugen. Nach 2 Wochen wurden Neurosphären auf den Einsatz mit einer PTFE-Membran (Skala bar = 50 m) plattiert. (D) Makroskopische Ansicht von NO in den Einsatz in einem Brunnen einer 6-Well-Platte. In den ersten Tagen wurden Rosetten beobachtet (schwarzer Pfeil) (E). (F) Makroskopische Ansicht einer NO plus GIC Kugel auf der Oberseite. (G-I) Immunfluoreszenzanalyse der NO plus GIC-Kugel (EGFR-positiv; Skalenbar = 50 m) (G) und NO allein, die eine Immunreaktivität für den neuronalen Marker III-Tubulin und leicht positiv für Nestin zeigte; Synapsin 1 zeigte jedoch ein schwaches Signal (H,I) (Skalenstäbe = 100 bzw. 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

figure-results-2
Abbildung 2 : Abbildung von nekrotischen Kugeln und unreifes NEIN. Die Neurosphären (A) und NO (B) können einer Nekrose unterzogen werden, wenn sie im Brunnen zu zahlreich oder überdimensioniert sind (C) (Skala bar = 10 m). (D) Ein mit einem Tomatenreporter infizierter GIC hilft, die Tumorzellinvasion in NO, Scale bar, 10 'm zu verfolgen. Beispiel für unreifes NO mit Neuralrohren (E) und ohne Neuralrohre (F) (Skala bar = 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3 : Standardisiertes Protokoll zur Erzeugung von DA-Neuralorganoid elektrophysiologische und morphologische Analysen. (A) Standardisiertes Protokoll zur Erzeugung von DA-Neuralorganoiden. (B) Immunfluoreszenzanalyse von DA-Neuralorganoid; TH-immunreaktive Zellen, die Nurr1, einen Midbrain-spezifischen Marker (Skala bar = 50 m), mitexkieren. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt: SEM (n = 3). (C) Graphen stellen die Kinetik der TH- und Nurr1-Genexpression dar, die von qRT-PCR ausgewertet wird. (D) Vertreter HPLC: Dopamin-Peak (Pfeil) wurde von HPLC von DA neuralem organoidem Lysat nachgewiesen. (E) Beispiel für Rohdaten, die mit der MEA-Plattform aufgezeichnet wurden. Jede Spitze wird durch eine vertikale Linie (Zeitstempel) angezeigt, während die verbleibende Spur Rauschen ist. (F) Bild, das eine Neurosphäre darstellt, die auf dem MEA abgelagert ist. (G) Überlagerung typischer Spitzen (blaue und rote Kurven), die aus den Rohdaten erfasst wurden. Die schwarze Fettkurve gibt den Durchschnitt der entsprechenden roten Kurven an. (H) Rasterdiagramm mit den Zeitstempeln, die jeder erkannten Spitze zugeordnet sind. Die verschiedenen Farben heben die verschiedenen Elektroden hervor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

genFowardRückwärts
Nurr1GGCTGAAGCCATGCCTTGTGTGAGGTCCATGCTAAACTTGACA
ThGCACCTTCGCGCAGTTCTCCCGAACTCCACCGTGAA
EEF1AGCAAAAAGACCCACCAATGGCCTGGATGGTTCAGGATA
GAPDHGCACAAGAGGAAAAGAGAGAGAACCAGGGGAGATTCAGTGTGGGT

Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Primer.

Diskussion

Einer der kritischsten Aspekte dieses Protokolls umfasst die Aufrechterhaltung der hESC-Pluripotenz während der Zellkultivierung und die genaue Überwachung der Sphären und der neuronalen organoiden Morphologie. hESCs sind sehr empfindlich, und jede Manipulation kann zu einer frühen unkontrollierten Differenzierung sowie zu Zelltod führen. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit zu erhöhen und das Auftreten abnormaler Karyotyp-Ereignisse zu vermeiden, wird empfohlen, mehrere Chargen von hESCs an der niedrigsten Passage nach Dervalidierung ihrer Chromosomenstabilität zu kryokonservieren. Darüber hinaus wird empfohlen, für jedes Experiment eine neue Durchstechflasche aufzutauen und das Verhalten der Zellen jeden Tag zu überprüfen. Wenn die Kugeln weniger brefraktiv mit ungewöhnlich höherer Größe sind, werden sie wahrscheinlich beginnen zu aggregieren und zu sterben.

Eine Verbesserung dieses Systems ist entweder perfusion oder die Implementierung eines vaskularisierten Systems (durch Zugabe von Endothelzellen oder innerhalb eines 3D-Fluid-Mikrochips)12,13. Die Kontrolle der Dicke des neuronalen Organoids (300 m) ermöglicht jedoch eine effiziente passive Perfusion von Sauerstoff und Nährstoffen und verhindert Nekrose. Eine weitere Verbesserung ist die Einführung von Immunzellen (Mikroglia). Mit diesen Einschränkungen im Hinterkopf, neuronale Organoide plus ein GIC-System kann ein relevantes Werkzeug aus mehreren Gründen sein. Erstens ermöglicht dieses System das Screening von Arzneimitteln, um zu überwachen, wie eine therapeutische Verbindung ein Organoid oder eine Tumorzelle beeinflussen kann. Zweitens können Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen untersucht und Mikro-Umweltdeterminanten, die individuellen und kollektiven Invasionen zugrunde liegen, visualisiert und untersucht werden5,6,13.

Im Kontext der Parkinson-Krankheit kann ein in DA-Neuronen angereichertes neuronales Organoid ein relevantes und genaues 3D-Modell darstellen, um die Krankheitsentwicklung zu untersuchen. In früheren Studien wurden Parkinsons von Patienten abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen, die zu DA-Neuronen differenziert wurden, verwendet, um die betroffenen neuronalen Subtypen zu untersuchen. Bemerkenswert ist, dass einige krankheitsbedingte Phänotypen, wie z.B. die Anhäufung von '-Synuclein und die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress,14,15beobachtet wurden. Darüber hinaus kann das neuronale Organoid als Werkzeug verwendet werden, um therapeutische Moleküle zu überprüfen. Es sollten jedoch spezifische und relevante Auslesungen eingerichtet werden, um das Überleben und die Funktionalität von DA-Neuronen zu bewerten, wie z. B. Dopaminproduktion und elektrophysiologische Aktivität. Insgesamt bietet dieses Protokoll zwei standardisierte und genaue Stammzell-basierte Ansätze zur Erzeugung neuronaler Organoide.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Die Autoren danken la Ligue Genevoise Contre le Cancer (Genf, Schweiz), der ISREC Foundation (Lausanne, Schweiz) und der Clayton Foundation for Research (Houston, TX, USA) für die finanzielle Unterstützung. Darüber hinaus danken die Autoren HES-HO und dem Wyss Center für die finanzielle Unterstützung. Wir danken dem Krause-Labor für die hilfreichen Diskussionen und Unterstützung und Dr. Halah Kutaish für das Korrekturlesen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-Platte (6-Well-Platte)Falcon / Corning07-201-588
ABI Prism 7900 HT Detektionssystem  (Real-Time PCR-Nachweissysteme)Applied Biosystems
Aggrewell 400 (Mikrotiterplatten)StemCell Technologies34421
Verstärker (W2100-HS32) (Verstärker)Multi Channel Systems
Anti-EGFR (phospho Y1101) AntikörperAbcamab761951/100 Verdünnung
Anti-GFAP AntikörperDako Z334 1/1000 Verdünnung
Anti-Nestin, humaner AntikörperMillipore ABD69 1/400 Verdünnung
Anti-Synapsin I AntikörperChemicon AB1543P 1/500 Verdünnung
B27 Ergänzungen (B27)Life Technologies / Invitrogen1238Für beide Protokolle, Stammlösung 100x, endgültige Lösung 1x
Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor  (BDNF)ZellführungGFH1-2Für beide Protokolle,  Stammlösung 100 & Mikro; g/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
CHIR-99021 (GSK-3β InhibitorAxon Medchemct99021Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 7,5 mM in DMSO, 3 & Mikro; M
Verbindung E a γ – Sekretase-Hemmer (γ – CalbiochemCAS 209986-17-4Für beide Protokolle (Gamma-Sekretase-Inhibitor XXI),  Stammlösung 5 mM in DMSO, endgültige Lösung 1 & Mikro; M
Coulochem III  (Parameter des coulometrischen Detektors)Thermowissenschaftliches
Dibutyrylcyclic-AMP (Dibutyryl cAMP)SigmaD0627Für dopaminerge Protokolle, Stammlösung 0,5 M in DMSO, 0,5 mM
Dimethylsulfoxid Pure (DMSO)Sigma-AldrichC6164Verbindungen Lösungsmittel, gebrauchsfertig
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies12491-015Für Zellkulturen, fertig zur Verwendung
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12)Gibco11320033Für Zellkulturen, gebrauchsfertig
EDTA 0,1 mM (EDTA)Life TechnologiesAM9912Für Zellkulturen, gebrauchsfertig
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)GibcoPHG0313Für GIC-Kulturen  Stammlösung 100 & Mikro; g/ml in reinem H2O, 10 ng/ml
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 (FGF20)Peprotech100-41Für das dopaminerge Protokoll,  Stammlösung 100 & Mikro; g/ml in reinem H2O, 5 ng/ml
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8  (FGF8)PeprotechGFH176-5für dopaminerge Protokolle  Stammlösung 100 & Mikro; g/mL in reinem H2O, 100 ng/mL
Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch (bFGF)GibcoPHG0024Für GIC-Kulturen  Stammlösung 100 & Mikro; g/ml in reinem H2O, 10 ng/ml
G5-Ergänzungen (G5)Invitrogen17503012Für GIC-Kultur, Stammlösung 100x, 1x
Gliazellabgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF)ZellführungGFH2-2Für beide Protokolle  Stammlösung 100 & Mikro; g/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
Hydrophile Polytetrafluorethylen  Membran (PTFE-Membran)BioCell-InterfaceDisjunktion
LDN-193189 (BMP-Inhibitor)Axon Medchem /Stemgen04-0072-02 /1509Dual/Smad,  Stammlösung 5 mM in DMSO, 0,5 &μ; M
L-Glutamin (L-Glutamin)Gibco25030081L-Glutamin (200 mM), Stammlösung 200 mM, 2 mM
Matrigel (extrazelluläre Matrix)BD Biosciences354277hESC-qualifizierte Matrix, Stammlösung 18-22 mg/ml, 180-220 &m; g/mL
Millicell-CM Kulturplatteneinsatz (0,4 &Mikro; m) (Einsatz der Kulturplatte)MilliporePICM03050
monoklonaler Anti-β-Tubulin III AntikörperSigma T8660 1/1000 Verdünnung
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital Shaker)Major ScienceMS-NRC-30
N2 Ergänzungen (N2)Invitrogen17502-048Für GIC-Kulturen, Stammlösung 100x, endgültige Lösung 1x
Nanotropfen (Nanotropfen)Thermo Fisher ScientificEingestellt
Neurobasal (Neurobasal)Life Technologies / Gibco21103049Erhaltung und Reifung embryonaler neuronaler Zellpopulationen , gebrauchsfertig
nicht-essentielle Aminosäuren  (NEAA)Gibco11140Nicht-essentielle Aminosäuren 100X, Stammlösung 100x, 1x
Nurr1 Antikörper (M-196)Santa CruzSc-55681/100 Verdünnung
Nutristem  (hESC-Medium)Biological Industries05-100-1AStammzellmedien, gebrauchsfertig
Penicilin / Streptomycin  (Penicilin / Streptomycin )Life Technologies / Gibco15140122Für Zellkulturen, Stammlösung 5 mg/ml, 50 & Mikro; g/mL 
Perchlorsäure 0,1N (HCLO4)Merck100519Für die HPLC gebrauchsfertige
phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+/Mg2+  (PBS ohne Ca2+/Mg2+ )Life Technologies14190250Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse Transkriptionskit)TakaraRR014A
Purmorphamin (geglätteter Agonist)CalbiochemSML0868Für dopaminerge Protokolle  Stammlösung 10 mM in DMSO, endgültige Lösung 2 & Mikro; M
Rho-assoziierte Kinase Y-27632 (ROCK)Abcam Biochemikalienab120129-1Gesteinsinhibitor,  Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 & Mikro; M
RNeasy Mini-Kit (RNA-Extraktionskit )Qiagen74104
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal-Inhibitor )AscentAsc- 163Dual-Smad,  Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 & Mikro; M
Sonic Hedgehog (SHH)ZellführungGFH168-5für dopaminerge Protokoll,  Stammlösung 100 & Mikro; g/mL in reinem H2O, 100 ng/mL
StemPro Accutase (enzymatische hESC-Lösung)GibcoA11105-01enzymatische hESC-Lösung, gebrauchsfertig
Symmetry C-18,5 mm (4,6 150mm2)  (Säule mit umgekehrter Phase)Waters Corporation
T150 Kolben (T150 Kolben)Falcon08-772-1F
TH Antikörper (F-11)Santa CruzSc-252691/200 Verdünnung
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ 3)ZellführungGFH109-2für das dopaminerge Protokoll,   Stammlösung 100 & Mikro; g/mL in reinem Ethanol, 1 ng/mL
Trichostatin A (Inhibitor der Histon-Deacetylase)SigmaT8552Für das dopaminerge Protokoll,   Stammlösung 100 & Mikro; M in DMSO, 20 nM
TrypLE (rekombinante enzymatische Lösung)Invitrogen12604021rekombinante enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
Trypsin 0,25% (enzymatische Lösung)Life Technologies15050065enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
W2100, Multi Channel Systems (Datenerfassungssystem)WAT045905
X-vivo (serumfreies Medium)LonzaBE04-743QSerum freies Medium, gebrauchsfertig
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Referenzen

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