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Methodenartikel

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/59720

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11. Juli 2019

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1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.

Zusammenfassung

Es gibt viel über den Beginn und das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen zu verstehen, einschließlich der zugrunde liegenden Gene, die dafür verantwortlich sind. Das Forward-Genscreening mit chemischen Mutagenen ist eine nützliche Strategie für die Kartierung mutierter Phänotypen zu Genen zwischen Drosophila und anderen Modellorganismen, die konservierte Zellwege mit Menschen teilen. Wenn das mutierte Gen von Interesse in frühen Entwicklungsstadien von Fliegen nicht tödlich ist, kann ein Klettertest durchgeführt werden, um auf phänotypische Indikatoren für eine verminderte Gehirnfunktion, wie niedrige Kletterraten, zu überprüfen. Anschließend kann eine sekundäre histologische Analyse des Hirngewebes durchgeführt werden, um die neuroprotektive Funktion des Gens durch Bewertung von Phänendern der Neurodegeneration zu überprüfen. Gen-Mapping-Strategien umfassen meiotische und Mangel-Mapping, die auf diesen gleichen Assays verlassen können durch DNA-Sequenzierung gefolgt werden, um mögliche Nukleotid-Änderungen im Gen von Interesse zu identifizieren.

Einleitung

Neuronen sind zum größten Teil post-mitotisch und unfähig,1,2zu teilen. Bei den meisten Tieren gibt es neuroprotektive Mechanismen, um diese Zellen während der gesamten Lebensdauer des Organismus zu erhalten, besonders im Alter, wenn Neuronen am anfälligsten für Schäden sind. Gene, die diesen Mechanismen zugrunde liegen, können bei Mutanten identifiziert werden, die Neurodegeneration aufweisen, einem phänotyptischen Indikator für den Verlust des Neuroprotektions, mit einem vorwärts genetischen Protokoll. Vorwärtsgenetische Siebe, die chemische Mutagene wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) verwenden, sind aufgrund der zufälligen Punktmutationen, die sie induzieren, besonders nützlich, was zu einem von Natur aus unvoreingenommenen Ansatz führt, der Licht auf zahlreiche Genfunktionen in eukaryotischen Modellorganismen3,4,5 (im Gegensatz dazu erzeugt die Röntgenmutagenese DNA-Brüche und kann zu Einer Neuanordnung anstelle von Punktmutationen führen6).

Die gemeine Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein ideales Thema für diese Bildschirme aufgrund ihrer hohen Qualität, gut benoteten Genomsequenz, ihrer langen Geschichte als Modellorganismus mit hochentwickelten genetischen Werkzeugen und vor allem ihrer gemeinsamen Evolutionsgeschichte mit Menschen7,8. Ein begrenzender Faktor für die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist die frühe Letalität, die durch die mutierten Gene verursacht wird, was Tests im Altervon 9Jahren verhindern würde. Bei nicht-tödlichen Mutationen ist jedoch ein Klettertest, der negative Geotaxis ausnutzt, eine einfache, wenn auch umfangreiche Methode zur Quantifizierung beeinträchtigter motorischer Funktionsfähigkeit10. Um eine ausreichende bewegungsmotorische Reaktivität zu zeigen, sind Fliegen auf neuronale Funktionen angewiesen, um die Richtung zu bestimmen, ihre Position zu spüren und die Bewegung zu koordinieren. Die Unfähigkeit von Fliegen, als Reaktion auf Reize ausreichend zu klettern, kann daher auf neurologische Defektehinweisen 11. Sobald ein bestimmter defekter Kletterphänotyp identifiziert ist, können weitere Tests mit einem sekundären Bildschirm wie der histologischen Analyse von Hirngewebe verwendet werden, um Neurodegeneration in kletterdefekten Fliegen zu identifizieren. Nachfolgende Genkartierung kann dann verwendet werden, um die genomische Region auf dem Chromosom zu enthüllen, das das defekte neuroprotektive Gen von Interesse trägt. Um den chromosomalen Bereich von Interesse einzugrenzen, kann eine meiotische Kartierung mit mutierten Fliegenlinien durchgeführt werden, die dominante Markergene mit bekannten Positionen auf dem Chromosom tragen. Die Markergene dienen als Bezugspunkt für die Mutation, da die Häufigkeit der Rekombination zwischen zwei Loci eine messbare Entfernung bietet, die verwendet werden kann, um die ungefähre Position eines Gens abzubilden. Schließlich erzeugt das Überschreiten der mutierten Linien mit Linien mit ausgewogenen Mängeln auf dem meiotisch kartierten chromosomalen Bereich von Interesse einen Komplementierungstest, bei dem das Gen von Interesse überprüft werden kann, wenn sein bekannter Phänotyp5exprimiert wird. Polymorphe Nukleotidsequenzen im identifizierten Gen, die möglicherweise zu veränderten Aminosäuresequenzen führen, können durch Sequenzierung des Gens und Vergleich mit der Drosophila-Genomsequenz ausgewertet werden. Die anschließende Charakterisierung des gens von Interesse kann das Testen zusätzlicher mutierter Allele, Mutationsrettungsexperimente und die Untersuchung zusätzlicher Phänotypen umfassen.

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Protokoll

1. Vorbereitung und Alterung von Fliegen

  1. Erhalten oder generieren6 eine Sammlung von Drosophila Mutanten, die für den genetischen Bildschirm verwendet werden. Hier werden ENU-mutagenisierte Linien verwendet, die dem zweiten Chromosom zugeordnet und über CyO ausgeglichen sind.
  2. Verstärken Sie experimentelle Genotyplinien in einem Inkubator, der bei 25 °C, 12 h Hell-/Dunkel-Zyklus auf Maismehl-Melasse-Medium eingestellt ist.
  3. Sammeln Sie etwa 20 homozygote Nachkommen zwischen 0-2 Tagen der Erwachsenen-Eclosion von jedem experimentellen Genotyp. Beseitigen Sie geschlechtsspezifische Voreingenommenheit, indem Sie konsequent entweder männliche oder weibliche Fliegen sammeln.
  4. Altern Sie die Fliegen auf Maismehl-Melasse Medium wie gewünscht bei 29 °C, Kippen Sie die Fläschchen alle 2-3 Tage, um die Fliegen auf frische Nahrung zu halten, wie sie älter werden. Auf dem hier vorgestellten Bildschirm waren die Fliegen 10-12 Tage alt.
  5. Montieren Sie eine Kletter-Assay-Testkammer mit zwei Fläschchen und Klebeband, wie zuvor beschrieben10. Die Fläschchen sollten an beiden offenen Enden angeschlossen werden. Verwenden Sie ein Lineal, um eine 5 cm Linie an einem Ende der Kammer zu markieren.

2. Protokoll 1: Klettertest (angepasst von Ali et al.10)

  1. Bestätigen Sie den Klettertest. Testen Sie in dieser Studie den Klettertest auf der Grundlage der zuvor beschriebenen Methodik von Ali et al.10, mit ElavC155>UAS-TauR406W (mit niedrigeren Kletterpassraten) und ElavC155>UAS-GFP ( Steuerung) und ElavC155>UAS-mCherry (Steuerung) fliegt.
  2. Drehen Sie die Fliegen in eine Prüfkammer, eine Linie nach der anderen (verwenden Sie keine CO2-Anästhesie) und lassen Sie sie für 5 min erholen. Wenn tests an verschiedenen Tagen durchgeführt wird, führen Sie den Test zur gleichen Zeit des Tages durch. In dieser Studie wurden alle Klettertests am Nachmittag durchgeführt, um die zirkadianen Auswirkungen auf die Fortbewegung zu kontrollieren12.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Fliegen beim Testen direkter Sonneneinstrahlung auszusetzen; dies wird ihre Fähigkeit zu klettern stören.
  3. Tippen Sie die Kammer (markiert seitlich nach unten) zwangsweise auf ein Mauspad, das 3 mal auf einer festen Oberfläche platziert wird, sodass alle Fliegen den Test unten beginnen. Beobachten Sie die Flugfortbewegung über einen Zeitraum von 10 s.
  4. Zeichnen Sie die Anzahl der Fliegen auf, die die 5 cm Linie innerhalb dieser Zeit erreichen oder passieren, sowie die Gesamtzahl der getesteten Fliegen. Wiederholen Sie das Protokoll, warten Sie 1 min zwischen jeder Testversion, für mindestens 3 Testreplikationen pro Zeile.
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie enthielt jede Durchstechflasche zwischen 2 und 19 Fliegen für das Erstscreening (männliche Fliegen) und zwischen 6 und 21 Fliegen für die mutierte Mangelanalyse von gekreuzten weiblichen Linien (Abschnitt 5.3.).

3. Protokoll 2: Auswahl von Drosophila-Stämmen zur weiteren Analyse

  1. Geben Sie die Kletter-Assay-Daten in Microsoft Excel oder ähnliche Software ein und berechnen Sie die Kletterpassrate für jede Linie über alle Replikationen als Prozentsatz.
  2. Führen Sie statistische Analysen durch, um mutierte Linien zu erkennen, die erheblich vom durchschnittlichen Anstiegsprozentwert aller Linien abweichen, indem Sie das R-Softwarepaket13verwenden.
    1. Lesen Sie Datendateien ein, die für R kuratiert wurden (.csv- oder .txt-Dateien mit einer Spalte für jede Variable oder jeden Faktor und Zeilen, die die spezifischen Werte darstellen).
      HINWEIS: Hier wurden Daten für Männchen (Anfangstest) und Weibchen (Linie 867 gekreuzt zu Mangellinien) in separate .xlsx-Blätter als zwei Spalten eingegeben, eine, in der die Zeilen der Spalte die mutierte Linie identifizieren und wie oft der Assay repliziert wurde und das andere, in dem Zeilen stellen den durchschnittlichen Klettererfolg (in Prozent) für jede Replizionfläschchen von Fliegen dar.
    2. Lesen Sie die Daten mit dem folgenden Code in R:
      mali<-read.csv(".. /male_init.csv")
      femdef<-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
      HINWEIS: Die ".." in den Pfadverzeichnissen sind absolute Pfade aus dem Stammverzeichnis des Computers des Benutzers und müssten vom einzelnen Benutzer für die Verzeichnispfade seines Computers angegeben werden.
    3. Lineare Modellierung durchführen
      1. Führen Sie die Dummy-Variablenregression mit der lm-Funktion in R durch. Bewerten Sie für die erste Analyse mutierter Linien die Bedeutung von Faktorpegeleffekten (MutantLinien) auf prozentualen Anstiegserfolg gegenüber dem großen Mittelwert für eine durchschnittliche zentrierte Antwortvariable Null (Prozenterfolg).
        HINWEIS: Die "-1" am Ende des lm-Funktionsaufrufs in Abschnitt 3.2.3.2. entfernt das Intercept und ermöglicht es uns, alle Faktorstufen mit dem mittleren Mittelwert von Prozent des Kletterdurchgangs zu testen.
      2. Drucken Sie die Ergebnisse mit der R-Zusammenfassungsfunktion auf den Bildschirm:
        mali_anova<-lm(scale(mali-P_Success)-Mali-Mutant_line -1)
        Zusammenfassung(mali_anova)
      3. Verwenden Sie Steuerlinien (falls vorhanden) als Basis, um Faktorleveleffekte gegen die Verwendung des folgenden R-Codes zu testen: x<-relevel(femdef-Mutant_line, ref="a867_plus")
        femdef_anova<-lm(femdef-P_success-x)
        Zusammenfassung(femdef_anova)
        HINWEIS: Die erste Codezeile ordnet die Faktorebenen so neu an, dass die negative Steuerlinie zum Basislinienabfang wird, auf den alle anderen Faktorebenen (Mutantlinien) mit den integrierten t-Tests in der lm-Funktion getestet werden.
  3. Wählen Sie je nach Alter zum Zeitpunkt der Prüfung einen Schwellenwert für Kandidatenlinien aus. Um den Schwellenwert zu bestimmen, führen Sie einen Vorläufigen Test im gewünschten Alter mit bekannten Mutanten durch, die Neurodegeneration und niedrige Kletterpassraten im Vergleich zum Wildtyp aufweisen, Kontrollfliegen10.
    HINWEIS: Eine Durchgangsrate unter 50% kann für 10 Tage alte Fliegen geeignet sein, wie zuvor für Drosophila-Linien berichtet, die das menschliche Neurodegeneration-bezogene Gen Tau im Nervensystem überausdrücken10. Ältere Fliegen sollten eine höhere Passing-Rate-Schwelle haben, da sie voraussichtlich eine verminderte Fortbewegung aufweisen, also eine erhöhte Neurodegeneration.

4. Protokoll 3: Histologieanalyse

  1. Tragen Sie Handschuhe, trennen Sie fliegende Köpfe mit einer chirurgischen Klinge nach dem Klettertest und verwenden Sie einen Pinsel, um sie sanft in 1 ml Carnoys Fixativ (6:3:1 von 100% EtOH: Chloroform: Eisessig) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr O/N bei 4 °C zu platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Köpfe in der fixativen Lösung versinken.
  2. Ersetzen Sie die Fixierlösung am nächsten Tag durch 1 ml 70% EtOH und halten Sie die Proben für die zukünftige Analyse noch bei 4 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann bei diesem Schritt angehalten werden.
  3. Platzieren Sie die Köpfe ab Schritt 4.2. maximal fünf pro Mikrobiopsiekassette. Legen Sie die Kassetten sofort in einen behälter gefüllt mit 70% EtOH. Lagern Sie den Behälter bei 4 °C vor dem Versand in eine Histologie-Einrichtung zur Verarbeitung und Paraffineinbettung der Köpfe. Wenn Geräte für die Gewebeverarbeitung und Einbettung verfügbar sind, folgen Sie Schritt 4.4.
  4. Einbetten der Köpfe in Paraffin für Mikrotome-Sektion:
    1. Befolgen Sie die Programmeinstellungen für eine automatisierte Gewebeverarbeitungsmaschine in der in Tabelle 1 dargestellten Reihenfolge, um die Köpfe zu dehydrieren, zu löschen und mit Paraffin zu infiltrieren.
    2. Übertragen Sie die Proben in Metall-Basisformen, die mit Paraffin, das bei 60 °C erhitzt wird, mit einer Paraffin-Einbettstation in die Kassette passen.
    3. Richten Sie die Köpfe (antero-posterior Ausrichtung nach oben) in der Basisform mit feinen Zangen, um eine korrekte Visualisierung des Gehirngewebes nach Abschnitten zu ermöglichen. Dies kann durch Aufwärmen des Paraffins bei 60 °C und ggf. Neupositionierung der Köpfe erfolgen.
      HINWEIS: Metallformen können durch Einweg-Basisformen ersetzt werden.
    4. Positionieren Sie die Kassette auf der Oberseite der entsprechenden Grundform und bewegen Sie diese vorsichtig auf die gekühlte Seite der Paraffineinbettstation (4 °C). Warten Sie, bis der Block aushärtet, bevor Sie ihn von der Station entfernen.
    5. Entfernen Sie den Block, indem Sie die Form sanft von der Kassette trennen.
  5. Schneiden Sie jeden Paraffinblock vor dem Schnitt, um die zu schneidende Oberfläche zu minimieren.
  6. Stellen Sie das Mikrotome so ein, dass 5 m Abschnitte jedes Blocks geschnitten werden.
  7. Schnitt-Paraffinband mit dem Gewebe in einem beheizten Wasserbad (35 °C) für maximal 5 min.
  8. Tauchen Sie einen polylysinbeschichteten Schlitten (hilft, das Gewebe zu halten) in das beheizte Wasserbad ein und platzieren Sie das geschnittene Band mit Holzapplikatoren auf der Rutsche. Lassen Sie die Dias lufttrocknen O/N bei Raumtemperatur.
  9. Erhitzen Sie die Dias 15 min bei 63 °C mit einem Gleitwärmer.
  10. Legen Sie die Dias auf eine Rutsche Färbestange und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) unter einer Dunstabzugshaube unter Beachtung der folgenden Schritte.
    1. Legen Sie das Rack in Histochoice (ungiftiger Ersatz von Xylol, das hilft, das Paraffin aus der Probe zu entfernen) für 5 min.
    2. Übertragen Sie das Rack in einem mit Histochoice gefüllten Behälter für 5 min.
    3. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH 1 für 5 min.
    4. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH 2 für 5 min.
    5. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 95% EtOH für 3 min.
    6. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 70% EtOH für 3 min.
    7. Übertragen Sie das Rack in einem Mit destillierten H2O gefüllten Behälter für 5 min.
    8. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter mit Harris Hematoxylin für 2-5 min gefüllt.
    9. Nehmen Sie das Rack aus der Hematoxylin-Lösung und legen Sie es 10 min unter fließendes Leitungswasser.
    10. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter mit destilliertem Wasser gefüllt durch einen kurzen Dunk.
    11. Übertragen Sie das Rack in einem mit Eosin gefüllten Behälter für 1-2 min.
    12. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter mit 95% EtOH gefüllt, indem Sie einen kurzen Dunk.
    13. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 95% EtOH für 5 min.
    14. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH für 5 min.
    15. Übertragen Sie das Rack in einem Behälter gefüllt mit 100% EtOH für 5 min.
    16. Übertragen Sie das Rack in einem mit Histochoice (oder Xylol) gefüllten Behälter für 5-10 min, bis alle Dias montiert sind.
    17. Montieren Sie den Schlitten und den Deckel (24 mm x 60 mm Größe). Mit Zangen nehmen Sie die Rutsche aus der Histochoice- oder Xylol-Lösung und machen Sie einen dünnen Streifen Montagemedium darauf. Legen Sie den Deckelrutsch vorsichtig auf die Oberseite, versuchen, die Bildung von Blasen zu vermeiden.
    18. Lassen Sie das Montagemedium auf montierten Dias O/N unter der Dunstabzugshaube härten, bevor Sie analysieren.
    19. Befleckte Dias in einer Box bei Raumtemperatur aufbewahren.
  11. Quantifizieren Sie die Neurodegeneration, indem Sie alle seriellen Abschnitte auf dem Dia bei der 20-fachen Vergrößerung unter einem Lichtmikroskop betrachten. Untersuchen Sie das gesamte Gehirn, unter Berücksichtigung der qualitativen Notiz von Größe und Anzahl der Vakuolen, die in drei aufeinanderfolgenden Abschnitten erscheinen.
  12. Erhalten Sie Bilder von repräsentativen Gehirnabschnitten in etwa Mitte des Gehirns mit einem Lichtmikroskop, das mit Bildgebungssoftware ausgestattet ist.

5. Protokoll 4: GenMapping des rezessiven Mmutanten-Phänotyps

  1. Überschreiten Sie die Kandidatenlinie zu einem wilden Typ CantonS (BL_ 9517) oder einem anderen wilden Typ oder isogenisierten Stamm (z. B. OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) oder yw (BL_ 6599), um festzustellen, ob der Phänotyp dominant ist oder Rezessive.
    HINWEIS:     Die Ergebnisse dieses Schritts leiten die nächsten Schritte der Zuordnung. Wenn der Phänotyp rezessiv ist, kann eine Mangelzuordnung durchgeführt werden.
    1. Mit einem Pinsel, machen Sie ein Kreuz, indem Sie in eine lebensmittelhaltige Durchstechflasche CO2-anesthetisierte Fliegen der mutierten Linie von Interesse (5 Männchen) und der CantonS Linie (10-15 Jungfrau Weibchen). Legen Sie die Durchstechflasche bei 25 °C.
    2. Sammeln Sie heterozygote F1 Nachkommen und wiederholen Klettern und Histologie-Experimente.
    3. Vergleichen Sie die erhaltenen Ergebnisse mit der Steuerlinie allein und mit den homozygoten Mutanten. Ein guter Hinweis auf rezessiven Phänotyp wird sein, wenn heterozygote Mutanten ähnliche Phänotypen wie Wildtypfliegen aufweisen.
  2. Führen Sie meiotische Secabisse durch, um die Position der Mutation auf dem zweiten Chromosom grob zu schätzen, indem Sie die wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL_3227) oder einen gleichwertigen Stamm mit assoziierten dominanten Markern an bekannten zytologische Position. In diesem Fall war bisher bekannt, dass sich die Mutation auf dem zweiten Chromosom befindet.
    1. Mit einem Pinsel, machen Sie ein Kreuz, indem Sie in eine lebensmittelhaltige Durchstechflasche CO2-anesthetisierte Fliegen der mutierten Linie von Interesse (5 Männchen) und die wgSp-1 J1 L 2 Pin1/CyO Linie (10 Weibchen). Legen Sie die Durchstechflasche bei 25 °C.
      HINWEIS: Das Ziel dieses Kreuzes ist es, heterozygote Weibchen zu erzeugen, die das Chromosom mit der neuen Mutation und dem Markerchromosom tragen, das sich während der Meiose6,14rekombinieren wird. Weibliche F1-Nachkommen werden anstelle von Männern gewählt, da eine Rekombination bei Männern nicht auftritt.
    2. Sammeln Sie mindestens 15 jungfräuliche weibliche Nachkommen, die das Chromosom mit der neuen Mutation und dem Markerchromosom tragen, und kreuzen Sie sie auf 5 Männchen aus einer ausgewogenen Linie, die einen anderen sichtbaren dominanten Marker trägt (z. B. CyO/snaSco (BL_2555) oder Äquivalent).
    3. Sammeln Sie heterozygote männliche Nachkommen, die entweder Sco oder CyO und das potenziell rekombinierte Chromosom aus dem Kreuz in Schritt 5.2.2 tragen. und paaren sie einzeln mit jungfräulichen Weibchen aus dem Bestand, der das mutierte Chromosom trägt.
    4. Sammeln Sie die Nachkommen aus dem letzten Kreuz in Schritt 5.2.3 beschrieben. und Alter der Fliegen bei 29 °C (in dieser Studie waren fliegen 10-14 Tage alt).
    5. Sammeln Sie Köpfe, führen Sie eine Histologieanalyse durch, wie in Protokoll 3 beschrieben, und betrachten Sie die Dias mit Hirnabschnitten, um den Grad der Neuropathologie zu bestimmen, wie in Schritt 4.11 beschrieben. Die Histologieanalyse wird anstelle von Fortbewegungsanalysen aufgrund von Phänotypen durchgeführt, die den Klettertest beeinflussen können, wie Zwiespalt (J), der Flüssigkeitsansammlung in den Flügelnverursacht 15.
  3. Führen Sie die Mangelzuordnung auf dem verengten Bereich des Chromosoms durch, um die Position der rezessiven Mutation mit dem Klettertest zu verfeinern. Jede Mangellinie hat eine Deletion verschiedener Regionen der Chromosomen, so dass sie für Komplementierungstests verwendet werden können.
    1. Beginnen Sie mit großen Mängeln, die sich über die in der meiotischen Kartierung identifizierte Region erstrecken, die dann durch die Verwendung kleinerer Mängel weiter eingegrenzt werden können. Wenn die Mangelanalyse zu mehr als einem Kandidatengen führt, wird die Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi)-Beständen empfohlen, um sie anzuvisieren.
    2. Kreuzlinien aus dem Drosophila-Mangelkit 16 für das zweite Chromosom (DK2L in dieser Studie) und suchen nach einer Nichtkomplementierung des Phänotyps des Interesses (in dieser Studie: Kletterpassrate von 8,5%, die der Passrate von homozygote Fliegen von Linie 867 als Positivkontrolle verwendet).
    3. Bestätigen Sie den Neurodegeneration-Phänotyp mit Hilfe der histologischen Verifikation, wie in Abschnitt 4 (Protokoll 3) beschrieben.

6. Protokoll 5: DNA-Sequenzierung und -Analyse

HINWEIS: Denken Sie daran, dass enU mutagenese Punktmutationen11einführt.

  1. Entwerfen Sie Vorwärts- und Reverse-Primer-Sequenzen, die den Exon-Kodierungsbereich des Bratgens zur Amplifikation durch Polymerase Chain Reaction (PCR) des Interessenbereichs flankieren (bei Zeile 867 wird ein DNA-Fragment der Größe 3.247 bp für Sequenzierung17).
  2. Extrahieren Sie DNA aus einer einzigen Fliege18 :
    1. Die Fliege vorsichtig in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 50 l Squishing-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl und 200 g/ml Proteinase K; das Enzym muss vor jeder Verwendung frisch aus einem gefrorenen Vorrat verdünnt werden) mit einem P100- oder P200-Rohrkipper.
    2. Inkubieren für 30 min bei 37 °C
    3. Deaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie das Rohr für 2 min bei 95 °C platzieren.
      HINWEIS: Die extrahierte DNA kann bei 4 °C für mehrere Monate gespeichert werden.
  3. Führen Sie die PCR-Reaktion mit einer Hochtreue-DNA-Taq-Polymerase (Reagenzien und thermische Kreislaufbedingungen, die in dieser Studie verwendet werden, sind in Tabelle 2 bzw. Tabelle3) unter Beachtung der Anweisungen des Herstellers dargestellt und führen Sie das PCR-Produkt auf einer 1 % Agarose-Gel enthält Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, eine ungiftige Alternative von Ethidiumbromid.
  4. Verwenden Sie das Band der richtigen Größe aus dem Gel mit einem Skalpell und reinigen Sie das PCR-Produkt mit dem Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System (Promega) oder einem gleichwertigen Kit, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
  5. Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, die für die DNA-Sequenzierung verwendet werden, um möglichst den gesamten Interessenbereich abzudecken. Sequenzieren Sie die gelgereinigte DNA aus dem vorherigen Schritt, um Punktmutationen zu identifizieren. Eine hohe Genauigkeit in der automatisierten Fluoreszenz-Sanger-Sequenzierung konnte für bis zu 700 bp erreicht werden.
    HINWEIS: Die Ex Taq Polymerase (TaKaRa) kann verwendet werden, um PCR-Produkte aus genomischen DNA-Vorlagen bis zu 20 kb Größe zu verstärken.
  6. Analysieren Sie erhaltene DNA-Sequenzen mit dem A-Plasmid-Editor (ApE, von M. Wayne Davis) oder einer ähnlichen Software, indem Sie sie ausrichten und mit den Sequenzen vergleichen, die nach der Sequenzierung derselben genomischen Region eines Referenzstammes (z. B. ursprünglich mutagenisiert) erhalten wurden. Linie).
    1. Öffnen Sie Sequenzierungsdateien mit ApE. Als Referenz verwenden Sie eine ApE-Datei, die die genomische Konsenssequenz des von Flybase heruntergeladenen Bratgens enthält, oder eine Datei, die Ergebnisse für die Sequenz der genetischen Hintergrundkontrolle enthält (z. B. ursprünglich mutagenisierte Drosophila Linie).
    2. Wechseln Sie zu Werkzeuge, und richten Siedann Sequenzen aus. Wählen Sie mit der Maus des Computers alle zu vergleichenden Sequenzen aus. Denken Sie daran, die Referenzsequenz anzugeben, die für diese Ausrichtung im Drop-Menü verwendet wird.
    3. Überprüfen Sie den sequenzierten Bereich auf Nukleotidänderungen im Vergleich zur Referenzsequenz. Wenn gewünscht, speichern Sie die Ausrichtung auf dem Computer im .rtf-Format, indem Sie auf Textklicken und dann speichern.
      HINWEIS: Wenn keine Mutationen identifiziert würden, würde das DNA-Sequenzierungs- und Analyseprotokoll mit Primern wiederholt, die nicht-kodierende Regionen des Gens umfassen sollen.

7. Protokoll 6: Weitere Analyse der Kandidaten-Genfunktion

  1. Führen Sie Rettungsexperimente in Neuroblasten durch, um festzustellen, ob der Gen-Brat für den Phännotyp der Neurodegeneration verantwortlich ist.
    1. Doppelwaage ein UAS-brat19 und ein neuroblast-spezifisches worniu-Gal4 (wor-G4) Aktien tragen die Konstrukte auf dem dritten Chromosom, sowie die 867 Linie, die mutiert für das Gen brat befindet auf der zweiten chromosom.
      1. Machen Sie drei separate Kreuze, indem Sie in drei verschiedene lebensmittelhaltige Fläschchen 5 Männchen aus UAS-Brat, wor-G4 und 867 Linien und fügen Sie zu jedem Satz von Männchen 10-15 Jungfrau Weibchen aus einer Linie tragen Marker und Balancer für die zweite und dritte Chromosomen (Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL_59967).
      2. Sammeln Sie 10-15 jungfrauen Weibchen aus der F1 jedes Kreuzes mit den folgenden Genotypen: +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, +/CyO; wor-G4/Tm3,sb und 867/CyO;+/Tm3,sb und 5 Männchen der folgenden Genotypen: +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb, +/Sp; wor-G4/Tm3,sb und 867/CyO; +/Dr.
      3. Kreuz collelcted +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb Jungfrauen weibchen zu +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb Männchen; in einer separaten Durchstechflasche machen ein zweites Kreuz mit +/CyO; wor-G4 /Tm3,sb jungfrauen Weibchen zu +/Sp; wor-G4/Tm3,sb Männchen und dann in einem dritten Durchstechflasche kreuz 867/CyO;+/Tm3,sb Jungfrauweibchen und 867/CyO; +/Dr Männchen.
      4. Sammeln Sie aus der F1 jedes dieser Kreuze sowohl Männchen als auch Weibchen der folgenden Genotypen: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb vom ersten Kreuz, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb vom zweiten Kreuz und 867/CyO; Dr/Tm3,sb vom zweiten Kreuz.
      5. Führen Sie eine letzte Kreuzung zwischen Brüdern und Schwestern aus jeder F1 Nachkommenschaft gesammelt, um dauerhafte Doppel ausgewogene Bestände für alle drei Linien zu etablieren.
    2. Kombinieren Sie UAS-brat und wor-G4 mit der 867-Mutation.
      1. Sammeln Sie eine ausreichende Anzahl (20-30 Fliegen) von jungfräulichen Weibchen aus dem 867/CyO; Dr/Tm3, sb doppelt ausgeglichenstock, um zwei Kreuze durchzuführen.
      2. Platz 10-15 Jungfrauweibchen mit 5 Männchen aus dem Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (Kreuz #1) und in einer zweiten Durchstechflasche 10-15 jungfrauen Weibchen mit 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb Männchen.
      3. Sammeln Sie Brüder und Schwestern aus der F1 jedes Kreuzes mit den folgenden Genotypen: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb von Kreuz #1 und 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb von Kreuz #2. Verwenden Sie gesammelte F1-Nachkommen aus jedem Kreuz, um dauerhafte Bestände zu schaffen, indem Sie Brüder und Schwestern zwischen ihnen kreuzen.
        HINWEIS: Nach diesem letzten Schritt werden Aktien für 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb und 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb sollte generiert werden.
    3. Führen Sie das Rettungsexperiment durch.
      1. Sammeln Sie 15-20 Jungfrauen Weibchen aus dem 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb Vorrat und überqueren Sie sie zu 5-10 Männchen aus dem Bestand 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Als Kontrolle kreuzen Sie 15-20 jungfräuliche Weibchen aus dem 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb und 15-20 Jungfrauenweibchen aus dem 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb-Linie allein zur 867/CyO-Linie.
        HINWEIS: 867 Fliegen tragen ein temperaturempfindliches Bratallel und das Rettungskreuz sollte bei 29 °C durchgeführt werden.
      2. Sammeln Sie die folgende F1-Nachkommen schaft von jedem Kreuz, indem Sie sorgfältig markierten Balancer auswählen: 867/867; wor-G4/UAS-brat (Rettung), 867/867; wor-G4/+ (Kontrolle) und 867/867; UAS-brat/+ (Steuerung).
      3. Altern Sie die Fliegen wie gewünscht bei 29 °C und führen Sie histologische Analysen an Gehirnen durch, um nach Neurodegeneration zu suchen, indem Sie das protokollinieren, das in Abschnitt 4 (Protokoll 3) beschrieben ist.
  2. Führen Sie eine altersabhängige Analyse der Neurodegeneration bei 867 Mutanten durch.
    1. Sammeln Sie 867;pcna-GFP und yw Kontrollfliegen, die ein Reportergen (pcna-GFP) tragen und bei 25°C lebensfähig sind und sowohl eine höhere Penetranz als auch eine höhere Expressivität des Neurodegeneration-Phänotyps als 867 allein aufweisen. Temperatur17.
    2. Altern Sie die Fliegen bis zu 5, 15 und 25, wie in Abschnitt 1.4 beschrieben, und führen Sie eine anschließende Histologieanalyse durch, indem Sie dem Protokoll in Abschnitt 4 (Protokoll 3) folgen.

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Ergebnisse

In diesem Aerticle stellen wir die Schritte vor, die verwendet werden, um den Genhirntumor (brat) als eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Integrität (z. B. Neuroprotektion) bei erwachsenen Fliegen17zu identifizieren; eine Methode, die verwendet werden kann, um Gene zu identifizieren, die am Neuroprotektionsschutz beteiligt sind. Wir verwendeten einen vorwärtsgenetischen Ansatz (die Strategie ist in Abbildung 1A...

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Diskussion

Forward genetische Screens in Drosophila waren ein effektiver Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich altersabhängiger Neuroprotektion5,23,24, 25. Mit dieser Strategie gelang es uns, Brat als neuartiges neuroprotektives Gen zu identifizieren17.

Ein kritisch...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Besonders dankbar sind wir Dr. Barry Ganetzky, in dessen Labor der genetische Bildschirm durchgeführt wurde, der die Identifizierung und Charakterisierung von Brat als neuroprotektives Gen ermöglicht. Wir danken Dr. Steven Robinow für die freundlicherweise Bereitstellung der Sammlung von ENU-mutagenisierten Fliegen, die in dem in diesem Artikel vorgestellten genetischen Bildschirm verwendet werden. Wir danken den Mitgliedern des Ganetzky-Labors, Drs. Grace Boekhoff-Falk und David Wassarman für die hilfreichen Diskussionen während der gesamten Dauer dieses Projekts, Ling Ling Ho und Bob Kreber für technische Hilfe, Dr. Aki Ikeda für die Nutzung seiner Mikrotome-Anlage an der University of Wisconsin und Dr. Kim Lackey and the Optical Analysis Facility at the University of Alabama.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Großgeräte
Abzug für Histologie
LichtmikroskopNikonEclipe E100Bevorzugtes Objektiv für die Bildgebung ist 20x
BildgebungssoftwareNikon
Mikroskop KameraNikon
Thermal CyclerEppendorf
Fly Push and Climbing Assay
reg; Drosophila-Fläschchen, schmalVWR75813-160
VWR® Allzweck-Labor-BeschriftungsbandVWR89097-912
Standard-Mauspad
StereoskopMoticModell SMZ-168
CO2 Anästhesiestation (Blaspistole, Fußventil, Ultimate Flypad)Genesee Scientific54-104, 59-121, 59-172 Zu den
CO2-Tank-Bürsten mit feiner Spitzegehören SOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila InkubatorVWR89510-750
Gene mapping
CantonSBloomington Drosophila Stock Center9517
w1118Bloomington Drosophila Stock Center5905
yw Bloomington Drosophila Stock Center6599
Drosophila Linie, die für die Rekombinationskartierung verwendetwird Bloomington Drosophila Stock Center3227Genotyp: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco] Bloomington Drosophila Stock Center2555Drosophila Balancer-Linie für die Rekombinationskartierung Deficiency
Kit für Chromosom2L Bloomington Drosophila Stock CenterDK2LCook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%)Thermo Fischer ScientificA4094
ChloroformThermo Fischer ScientificC298-500
EisessigThermo Fischer ScientificA38-500
Fisherbrand™   Premium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mLThermo Fischer Scientific05-408-129
Histochoice Clearingmittel 1xVWR Life Sciences97060-934
Harris HämatoxylinVWR95057-858
EosinVWR95057-848
Thermo Scientific & Handel;   Richard-Allan Wissenschaft & Handel; EindeckmediumThermo Scientific™ 411222-110-610CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysin Objektträger, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select PlusAzer Scientific
Fisherbrand™   Deckgläser: RechteckeFisherbrand12-545MAbmessungen: 24 mm x 60 mm
Rückverfolgbarer TimerVWR
Slide WarmerBarnstead InternationalModell-Nr. 26025
Slide Tablett und RacksDWK Life SciencesRack für 20 Slides
Fisherbrand™   Allzweck-Pinzette mit extra langerLänge Fisherbrand10-316A
Kimwipes™Kimberly-Clark&Handel; Professionell 
6-Zoll-Puritan-ApplikatorenLaubholzprodukte Company, Guilford, Maine807-12
VWR® RasierklingenVWR55411-050
Tupperware oder Glasbehälter für Histologieflüssigkeiten16 + 1 für fließendes Wasser
Profile Beschichtete MikrotomklingenVWR95057-834
Corning™   Runder Eiskübel mit Deckel, 4 LCorning™
Becheroder anderer Behälter für Eiswasser und Kassetten
Tissue BathPrecision Scientific Company66630
MikrotomLeica Biosystems
Molekulare Analyse
Wizard® SV Gel und PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
Ex Taq DNA-PolymeraseTaKaRa5 U/μ l
Invitrogen&Handel;   SYBR&Handel; Sicher & Handel; DNA-Gel-Färbung  Invitrogen&Handel;
UltraPure&Handel; Agarose  Invitrogen&Handel;
1 Kb Plus DNA-Leiter  Invitrogen&Handel;
ApE-A Plasmid Editor SoftwareZum kostenlosen Download verfügbar
Statistische Analyse
R Softwarepaket
Weitere Analyse
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]Bloomington Drosophila Lager Center59967
VWR& High

Referenzen

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