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Methodenartikel

Gepulste Laser-Diode-Based Desktop photoakustische Tomographie für die Überwachung von Wash-In und Wash-Out of Dye in Rat Cortical Vasculature

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DOI:

10.3791/59764

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30. Mai 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Für die Hochgeschwindigkeits-Dynamik in der vivo-Bildgebung der kleinen tierischen Kortikalvaskulatur wird ein kompaktes, pulsiertes, auf Diode-basiertem Desktop-Sotakus-Tomografiesystem (PLD-PAT) demonstriert.

Zusammenfassung

Die photoakustische (PA) Bildgebung (PAT) ist eine sich abzeichnende biomedizinische Bildgebung, die in verschiedenen präklinischen und klinischen Anwendungen nützlich ist. Maßgeschneiderte Rundringarögel-basierte Wandler und herkömmliche sperrige Nd: YAG/OPO-Laser hemmen die Übersetzung des PAT-Systems in Kliniken. Ultrakompakt gepulste Laserdioden (PLDs) werden derzeit als alternative Quelle für Infrarot-Anregung in der Nähe von PA-Ableitungen eingesetzt. Die Hochgeschwindigkeitsdynamik in der vivo-Bildgebung wurde mit einem kompakten SPS-basierten Desktop-PAT-System (PLD-PAT) demonstriert. Ein visualisiertes Versuchsprotokoll mit dem Desktop-SPD-PAT-System wird in dieser Arbeit für die dynamische In-vivo-Hirn-Bildgebung bereitgestellt. Das Protokoll beschreibt die Desktop-SPD-PAT-Systemkonfiguration, die Vorbereitung von Tieren für die Gehirn-Gefäß-Bildgebung und das Verfahren zur dynamischen Visualisierung von indocyanine grün (ICG) Farbstoffaufnahme und Räumprozess in Ratte kortikalen Vaskulatur.

Einleitung

Die photoakustische Computertomographie (PACT/PAT) ist eine vielversprechende, nicht-invasive biomedizinische Bildgebung, die einen reichen optischen Kontrast mit hoher Ultraschallauflösung1,2,3, 4 kombiniert. 5. Wenn ein nanosekundengepulster Laser Energie auf lichtabsorbierende Chromophore ablagert, die in jedem biologischen Gewebe vorhanden sind, steigt die lokale Temperatur an, was zu einer thermoelastischen Ausdehnung und Kontraktion des Gewebes führt, was zur Erzeugung von Druckwellen. Diese Druckwellen werden als Ultraschallwellen oder photoakustische (PA) Wellen bezeichnet, die durch Ultraschallwandler rund um die Probe erkannt werden können. Die erkannten PA-Signale werden mit verschiedenen Rekonstruktionsalgorithmen 6,7, 8,9rekonstruiert,um Querschnittsbilder der PA zu erzeugen. Die Beschallung liefert strukturelle und funktionelle Informationen von makroskopischen Organen bis hin zu mikroskopischen Organellen aufgrund der Wellenlängenabhängigkeit endogener Chromophores,die im Körper 10 vorkommen. Die PAT-Bildgebungwurdeerfolgreich zur Brustkrebsdetektion 1, Sentinel-Lymphknotenbildgebung11, Abbildung von Oxyhemoglobin (HbO2), Deoxy-Hämoglobin (HbR), Total-Hämoglobin-Konzentration (HbT), Sauerstoffsättigung (SO) eingesetzt. 2) 12 , 13, Tumorangiogenese14, Kleintier-Körper, die15, und andere Anwendungen.

Nd: YAG/OPO Laser sind konventionelle Anregungsquellen für PAT-Systeme der ersten Generation, die in der photoakustischen Gemeinschaft für die Kleintierbildgebung und Tiefengewebe-Bildgebung16 weit verbreitetsind. Diese Laser liefern ~ 100 mJ-Energiepulse bei niedrigen Wiederholungsraten von ~ 10-100 Hz. Die PAT-Bildgebungssysteme, die diese teuren und sperrigen Laser verwenden, sind aufgrund der begrenzten Pulswiederholrate nicht für die Hochgeschwindigkeits-Bildgebung mit Einelement-Ultraschallwandlern (SUTs) geeignet. Dies verhindert die Echtzeitüberwachung physiologischer Veränderungen, die bei hohen Geschwindigkeiten im Tier auftreten. Mit array-basierten Wandlern wie linearen, halbkreisförmigen, kreisförmigen und volumetrischen Arrays mit Nd: YAG-Laseranregung ist eine Hochgeschwindigkeits-Bildgebung möglich. Allerdings sind diese Array-Wandler teuer und bieten geringere Empfindlichkeiten im Vergleich zu SUTs; Dennoch wird die Bildgeschwindigkeit durch die geringe Wiederholungsrate des Lasers begrenzt. Modernste Ein-Impuls-PACT-Systeme mit maßgeschneidertem Vollring-Array-Wandler erhalten die PA-Daten mit 50 Hz-Bildraten17. Diese Array-Wandler benötigen komplexe Backend-Empfangselektronik und Signalverstärker, was das Gesamtsystem teurer und für den klinischen Einsatz schwieriger macht.

Ihre kompakte Größe, der geringere Kostenaufwand und die höhere Pulswiederholrate (KHz) machen gepulste Laserdioden (PLDs) für die Echtzeit-Bildgebung vielversprechender. Aufgrund dieser Vorteile werden PLDs in PAT-Systemen der zweiten Generation aktiv als alternative Anregungsquelle eingesetzt. PLD-basierte PAT-Systeme wurden erfolgreich für die Bildgebungmithoher Bildfrequenz mit Array-Wandlern18,Tiefengewebe und Gehirnbildgebung 19, 20,21, Herz-Kreislauf-Erkrankungen diagnostiziert 22 , und Rheumatologie Diagnose23. Da SUTs im Vergleich zu Array-Wandlern hochempfindlich und kostengünstiger sind, werden sie immer noch ausgiebig für die PAT-Bildgebung verwendet. Das auf Fiber-basiertem PLD-System wurde für die Phantombildgebung24demonstriert. Ein tragbares PLD-PAT-System wurde zuvor durch die Montage der SPD im PAT-Scanner 25 demonstriert. Mit einem SUT-Kreisscanner wurde die Phantombildgebung während der 3 s der Scanzeit durchgeführt, und in vivo rat wurde die Gehirnbildgebungwährendeiner 5-sm-Periode mit diesem PLD-PAT-System 19 durchgeführt.

Darüber hinaus wurden Verbesserungen an diesem PLD-PAT-System vorgenommen, um es kompakter zu machen und ein Desktop-Modell mit acht akustischen Reflektor-basierten Einelement-Ultraschalltransformatoren (SUTRs) 26,27zuerstellen. Hier wurden SUTs mit Hilfe eines 90 °-akustischen Reflektors 28in vertikaler statt horizontalerRichtung platziert. Dieses System kann für Scanzeiten von bis zu 0,5 s und ~ 3 cm Tiefe in der Gewebebildgebung und in vivo Kleintierhirn-Bildgebung eingesetzt werden. In dieser Arbeit wird dieses Desktop-SPD-PAT-System verwendet, um die visuelle Demonstration von Experimenten für in vivo Gehirnbildgebung bei Kleintieren und für die dynamische Visualisierung der Aufnahme und Abfertigung von Food and Drug Administration (FDA)-zugelassenen Indocyanin-zugelassen Grüner (ICG) Farbstoff im Rattenhirn.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Nanyang Technological University, Singapur, genehmigt wurden (Tierprotokoll-Nummer ARF-SBS/NIE-A0331).

1. Systembeschreibung

  1. Montieren Sie den PLD-Laser in den kreisförmigen Scanner und montieren Sie den optischen Diffusor (OD) vor dem PLD-Ausstiegsfenster, um den Ausgangsstrahl homogen zu machen, wie in Abbildung 1Agezeigt. Verbinden Sie die PLD mit dem Lasertreibergerät (LDU).
    NOTE: Die PLD erzeugt ~ 816 nm Wellenlängenpulse, Pulse von ~ 107 ns Dauer und bis zu einer 2 KHz-Wiederholungsrate mit einer maximalen Pulsenergie von ~ 3,4 mJ. Die LDU besteht aus Kühl-, 12-V-Netzteil, variabler Hochspannungsversorgung zur Steuerung der Laserleistung und Funktionsgenerator zur Änderung der Pulswiederholrate.
  2. Montieren Sie alle acht SUTRs auf jedem SUTR-Halter einzeln so, dass die Oberfläche jedes akustischen Reflektors in Richtung der Mitte des Scanbereichs blickt, wie in Abbildung 1B gezeigt. Verbinden Sie jedes SUTR-Kabel mit Hilfe von Verbindungskabeln an den geräuscharmen Signalverstärker.
    Hinweis: Die zentrale Frequenz des Ultraschallwandlers beträgt 5 MHz und hat einen Wirkbereich mit einem Durchmesser von 13 mm. Für jeden Kanal sind zwei Verstärker mit je 24 dB-Gewinnen in Serie miteinander verbunden.
  3. Schalten Sie die Stromversorgung des Kühlers ein, dann schalten Sie den Schalter des Kühlers ein, um die Temperatur zwischen 20 ° C und 25 ° C einzustellen.
  4. Schalten Sie die Stromversorgung ein und schalten Sie die Stromsteuerung langsam ein, um die Stromgrenze auf 0,3 A zu setzen. Setzen Sie die Spannung auf 12 V. Überprüfen Sie, ob der Strom 0,1 A nicht überschreitet.
  5. Die Hochspannungsversorgung einschalten Drücken Sie den "Preset"-Knopf und setzen Sie den Strom auf 1 A und die Spannung auf 0 V.
  6. Schalten Sie die Stromversorgung des Funktionsgenerators ein. Drücken Sie den "Recall"-Button und wählen Sie eine 2 KHz-Konfiguration, um die Laserpulse in dieser Wiederholungsrate zu erzeugen.
  7. Legen Sie den Acryltank in den Scanner , wie in Abbildung 1A dargestellt , und füllen Sie den Tank mit Wasser, so dass die detektierende Oberfläche der SUTRs vollständig in Wasser eingetaucht ist.
  8. Achten Sie darauf, dass sich alle SUTRs, die Oberflächen erkennen, innerhalb des Wassermediums befinden. Schalten Sie die Stromversorgung des Low-Noise-Signalverstärkers ein.

2. Tierpräparation für die Gehirnbildgebung der Ratte

Hinweis: Gesunde weibliche Ratten (siehe Materialtabelle) wurden verwendet, um das oben beschriebene Desktop-SPD-PAT-System zur Abbildung von kleinen tierischen Kortikalvaskulatur zu demonstrieren.

  1. Halten Sie das Tier auf dem Rücken, indem Sie den Kopf und die Körperbewegung festhalten. Das Tier durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus 2 ml Ketamin (100 mg/mL), 2 ml Xylazine (20 mg/mL) und 1 mL Salz (Dosierung von 0,2 mL/100 g) betäuben.
    Hinweis: Nach der Injektion wird die Zehe des Tieres gekneigt, um auf positive Reflexe wie Bein-oder Körperbewegungen, Vokalisierung oder deutliche Zunahme der Atemwege zu testen. Das Fehlen solcher Reflexmaßnahmen bestätigt eine erfolgreiche Betäubung des Tieres.
  2. Um Trockenheit durch Anästhesie und Laserbeleuchtung zu verhindern, wird die künstliche Tränensalbe sehr sorgfältig auf die Rattenaugen aufgetragen. Legen Sie das Tier in anfällige Position auf die Arbeitsbank und entfernen Sie das Fell auf der Kopfhaut des Tieres mit einem Haarschneider und legen Sie sanft Haarentfernungscreme auf den rasierten Bereich und entfernen Sie das Fell vollständig.
    1. Nach 4 – 5 min die aufgetragene Creme mit einem Wattestäbchen entfernen.
  3. Montieren Sie den mit einer Atemmaske ausgestatteten Tierhalter (siehe Materialtafel) auf einem Label-Buchse.
  4. Legen Sie das Tier in anfälliger Position auf den Halter, so dass der Kopf auf der horizontalen Plattform des Halters ruht. Verwenden Sie chirurgisches Klebeband, um das Tier auf den Halter zu sichern.
  5. Achten Sie darauf, dass die Atemmaske die Nase und den Mund der Ratte bedeckt, um eine Anästhesie-Mischung zu liefern. Die Atemmaske ist an das Bildfenster angepasst. 10% des handelsüblichen Nasenkegels wird geschnitten und dann mit einem Stück Handschuh verbunden.
  6. Schließen Sie die Atemmaske mit der Anästhesie-Maschine an, bevor Sie sie einschalten.
  7. Schalten Sie die Anästhesie-Maschine ein und stellen Sie sie so ein, dass sie eine Narkosmischung mit 1,0 L/min Sauerstoff mit 0,75% Isofluran an die Tieratmennase liefert.
    1. Klemmen Sie den Pulsoximeter an einem der Hinterbeine des Tieres, um seinen physiologischen Zustand zu überwachen.
  8. Mit einem Baumwoll-getippten Applikator eine Schicht farbloser Ultraschallgel auf die Kopfhaut der Ratte auftragen. Stellen Sie die Labor-Jack-Position an die Mitte des Scanners und stellen Sie die Höhe des Lab-Wagenheber manuell so ein, dass die Bildfläche in der Mitte des akustischen Reflektors steht.

3. Dynamik in vivo Abbildung der Aufnahme und Räumung von ICG im Rattenhirn

  1. Stellen Sie die Parameter in der Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle) für einen 360 °-Erfassungsscan ein.
  2. Schalten Sie die PLD-Laseremission ein, indem Sie die Leistung des Funktionsgenerators ermöglichen (Laseremission startet). Dann erhöhen Sie langsam die Spannung der variablen Hochspannungsversorgung auf 120 V für maximale Promilte.
  3. Führen Sie das Programm zur Datenerfassung (siehe Materialtabelle) aus, um alle acht SUTRs in 360 ° über eine 4-scanner-Zeit zu drehen.
    Hinweis: Wenn zum Beispiel die SUTRs für 4s gedreht werden, liefert die PLD 8.000 (= 4 x 2.000) Pulse und jeder SUTR sammelt 8000 A-Linien. Diese 8.000 A-Leitungen werden auf 400 reduziert, indem sie durchschnittlich über 20 Signale (nach einer Mittelung von A-Zeilen = 8000/20 = 400) haben. Ein Rekonstruktionsprogramm, das auf dem Delay-und-Sum-Rückprojektionsalgorithmus basiert, wird verwendet, um den Scanradius der einzelnen SUTR zu ermitteln.
  4. Deaktivieren Sie die Ausgabe des Funktionsgenerators, um die Laseremission auszuschalten.
  5. Mithilfe des Rekonstruktionsalgorithmus in der Datenverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle) finden Sie anhand des Rückprojektionsalgorithmus den Scanradius aller acht SUTRs per Trial-and-Fehler.
  6. Stellen Sie die Parameter in der Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle) für 45 °-Erfassung über eine Scanzeit von 0,5 s ein.
    Hinweis: Wenn zum Beispiel die SUTRs für 0,5 s gedreht werden, liefert die PLD 1.000 (= 0,5 x 2.000) Pulse und jeder SUTR sammelt 1000 A-Linien. Diese 1.000 A-Leitungen werden auf 400 reduziert, indem sie durchschnittlich über 20 Signale (nach durchschnittlich A-Linien = 1000/20 = 50).
  7. Aktivieren Sie die Ausgabe des Funktionsgenerators, um die Laseremission einzuschalten.
  8. Führen Sie das Programm zur Datenerfassung (siehe Materialtabelle) aus, um alle acht SUTRs in 45 ° zu drehen, um erste Kontrolldaten zu erhalten, bevor Sie ICG verwalten.
  9. Deaktivieren Sie die Ausgabe des Funktionsgenerators, um die Laseremission auszuschalten.
  10. Identifizieren Sie die Schwanzvene des Tieres und spritzen Sie 0,3 mL ICG (siehe Materialtabelle) (323 μM) in die Schwanzvene der Ratte.

4. Platz

Hinweis: 1,25 mg ICG-Pulver wurden mit einer Mikro-Wiegemaschine gewogen und mit 5 ml destilliertem Wasser vermischt, um eine Konzentration von 323 μM für die ICG-Lösung zu erhalten.

  1. Aktivieren Sie die Ausgabe des Funktionsgenerators, um die Laseremission einzuschalten.
  2. Führen Sie das Programm zur Datenerfassung (siehe Materialtabelle) aus, um A-Linien über eine Scanzeit von 0,5 s in 45 ° Rotation zu erfassen.

5. Platz

Hinweis: A-Zeilen, die während einer Scanzeit von 0,5 s aufgenommen wurden, werden verwendet, um ein Querschnittsbild zu erzeugen. Zwischen jedem Scan besteht eine Zeitspanneit von ~ 0.4 – 0,6 s.

  1. Nachdem die Datenerfassung beendet ist, rekonstruieren Sie mit dem Rückprojektionsalgorithmus in der Datenverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle) das Querschnittsbild des Gehirns aus den gespeicherten A-Linien.
  2. Schalten Sie den Laser aus und schalten Sie dann die Anästhesie-Maschine aus, senken Sie den Laborheber und entfernen Sie das Tier von der Bühne. Bringe das Tier in den Käfig zurück und kontrolliere, bis es das Bewusstsein wiedererlangt.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Schematische Schematik des Desktop-SPD-PAT-Systems. (A) Schematic of the desktop PLD-PAT set. PLD: Gepulste Laserdiode, OD: Optischer Diffusor, SUTR: Akustischer Reflektor-basierter Einelement-Ultraschall-Wandler, AM: Anästhesie-Maschine, CSP: Rundscanner-Platte, SM: Schrittmotor, LDU: Laserantrieb, AMP: Verstärker, DAQ: Datenerfassungskarte. (B) Rundanordnung von acht SUTRs rund um das Scanzentrum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Ergebnisse

Die Potenzialität des beschriebenen Desktop-SPD-PAT-Systems für die Dynamik in der vivo-Hirn-Bildgebung wurde in diesem Protokoll mit entsprechenden Ergebnissen dargestellt. Die Hochgeschwindigkeits-Bildgebung des Desktop-SPD-PAT-Systems wurde durch die Durchführung von in vivo-HGehirnbildgebung von gesunden weiblichen Ratten demonstriert. Die Beschallungssignale wurden mit acht SUTRs gesammelt, die sich in 360 ° und 45 ° um das Rattenhirn mit Scangeschwindigkeiten von 4 s bzw. 0,5 s dreh...

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Diskussion

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um ein Desktop-SPD-PAT-System für die Durchführung von Experimenten an Kleintieren wie Ratten für in vivo Gehirn-Bildgebung und dynamischen Schnellaufnahme und Räumungsprozess von Kontrastmitteln wie ICG zu verwenden. Sperrige, teure OPO-PAT-Systeme brauchen mehrere Minuten (2-5 min), um einen einzigen Querschnitt in vivo Bild zu erhalten. Ein kompaktes, kostengünstiges, tragbares PLD-PAT-System der ersten Generation bietet eine Einzelquerschnittsgelähmte in vivo-Bildern in 5 s. Im ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Interessen oder mögliche Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Forschung wird vom Nationalen Medizinischen Forschungsrat des Singapore Ministry of Health unterstützt (NMRC/OFIRG/0005/2016: M4062012). Die Autoren danken Herrn Chow Wai Hoong Bobby für die Unterstützung der Maschinenwerkstatt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12 V StromversorgungVoltcraftPPS-11810Zur Versorgung mit Betriebsspannung für PLD
Akustischer ReflektorOlympusF10245-Grad-Reflektor, der zum Ultraschallwandler erweitert
Acryl-WassertankNTU WerkstattSonderanfertigungEs wird verwendet, um Wasser zu halten, das als akustisches Kopplungsmedium zwischen Tiergehirn und Detektor fungiert
AnästhesiemaschineMedical plus pte ltdNicht-rebreathing Anästhesiegerät mit Sauerstoffkonzentrator.Versorgt Tiere mit Sauerstoff und Isofluran
TierhändlerIn Vivos Pte Ltd, SingapurTierhändler, der Kleintiere für Forschungszwecke liefert
TierhalterNTU-WerkstattSonderanfertigungWird zum Halten eines Tieres auf dem Bauch verwendet
AtemmaskeNTU-WerkstattSonderanfertigungWird zusammen mit dem Tierhalter verwendet, um dem Tier eine Anästhesiemischung zuzuführen
Zirkulärer ScannerNTU-WerkstattDer kundenspezifischeScanner besteht aus einer
Aluminium-DatenerfassungskarteSpectrumM2i.4932-exp16 Bit, 30 Ms/s, 8 Kanäle, 1 Gs, PCIe
DatenerfassungssoftwareNational Instruments Corporation,Austin,TX,USA)NI LabVIEW 2015 SP1 (32 Bit)LabVIEW-basiertes Programm, das in unserem Labor zur Steuerung des Schrittmotors und zur Erfassung der PA-Signale vom Detektor entwickelt
Datenverarbeitung SoftwareMatlab (Mathworks, Natick, MA, USA)Matlab R2015bMatlab-Code, der in unserem Labor zur Rekonstruktion von PA-Schnittbildern entwickelt
FunktionsgeneratorRIGOLDG1022Zur Änderung der Wiederholrate des PLD. Es liefert ein TTL-Signal, um das Datenerfassungssystem mit der Laseranregung zu synchronisieren.
Rauscharmer SignalverstärkerGenetronSonderanfertigung mit Mini-Schaltungen, ZFL-500LN-BNCZum Empfangen und Verstärken des PA-Signals von SUTR. Die Verstärkung beträgt 24 dB.
Optischer DiffusorThorlabsDG-120Wird verwendet, um den Laserstrahl homogen zu machen
Gepulste LaserdiodeQuantel, FrankreichQD-Q1924-ILO-WATEREs ist die Anregungslaserquelle mit Spezifikationen von 816 nm Wellenlänge, 3,4 mJ pro Pulsenergie, 107 ns Pulsbreite, 2 KHz maximale Impulswiedergaberate, Abmessungen: 13,0 x 7,6 x 5,0 cm
RattenIn Vivos Pte Ltd, SingapurNTac:SD, Sprague Dawley / SDHündin, Gewicht 100± 10g, Stamm von Ratten: Sprague Dawley, Alter: 4-5 Wochen
Schrittmotor mit GetriebeLIN Engineering (Servo Dynamics)Motor: CO-5718L-01P-RO, Getriebe: DPL64/1; Netzteil PW-100-24Zum Bewegen des Melderhalters in einer kreisförmigen Geometrie. Drehmoment: 2,08 Nm, Rotor-Trägheit: 2,6 kg-cm2
UltraschallgelProgress/parker acquasonic gelPA-GEL-CLEA-5000Klares Ultraschallgel
UltraschallwandlerOlympusV309-SU/ U8423013Ultraschallsensoren zur photoakustischen Detektion. Zentrale Frequenz 5 MHz, 0,5 Zoll
Variables HochspannungsnetzteilElektro-AutomatikEA-PS 8160-04 TZum Ändern der Laserausgangsleistung
wurde wurde wurde

Referenzen

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Schlagwörter

Indocyaningr n Farbstoffdynamische In vivo BildgebungDesktop PAT SystemUltraschallwandlerDatenerfassungssoftwareR ckprojektionsalgorithmusSchwanzveneninjektion
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