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Biochemistry

वास्तविक समय, अर्ध-स्वचालित वायुमार्ग की सतह तरल प्राथमिक मानव Airway उपकला कोशिकाओं के pH का मापन

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59815
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2,4, 1,2, 2,3, 1
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children's Hospital, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

हम पतली फिल्म एक थाली पाठक का उपयोग कर स्थितियों के तहत airway सतह तरल पीएच के गतिशील माप बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

हाल के वर्षों में, वायुमार्ग में श्लैष्मिक सतह पीएच के महत्व एयरवे सतह तरल (asl) जलयोजन, बलगम चिपचिपाहट और रोगाणुरोधी पेप्टाइड की गतिविधि को विनियमित करने की क्षमता द्वारा प्रकाश डाला गया है की जंमजात रक्षा में शामिल प्रमुख मापदंडों फेफड़ों. यह सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के रूप में पुरानी श्वसन रोगों के क्षेत्र में प्राथमिक प्रासंगिकता है, जहां इन मापदंडों को डिस्रेगुलेटेड कर रहे हैं । जबकि विभिंन समूहों का अध्ययन किया है ASL pH दोनों में vivo और इन विट्रो, उनके तरीकों की रिपोर्ट ASL पीएच मूल्यों की एक अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला और भी विरोधाभासी किसी भी गैर के बीच पीएच मतभेद के बारे में निष्कर्ष CF और CF कोशिकाओं । इसके अलावा, उनके प्रोटोकॉल हमेशा पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं करने के लिए reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, सबसे कम throughput रहे है और महंगे उपकरण या विशेष ज्ञान को लागू करने की आवश्यकता है, उंहें सबसे प्रयोगशालाओं में स्थापित करने के लिए मुश्किल बना । यहां हम एक अर्द्ध स्वचालित फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक परख कि पतली फिल्म की स्थिति के तहत ASL पीएच के वास्तविक समय मापन में सक्षम बनाता है कि और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में सदृश वर्णन । इस तकनीक की अनुमति देता है एकाधिक airway संस्कृतियों से कई घंटे के लिए स्थिर माप के लिए एक साथ और, महत्वपूर्ण बात, एगोनिस्ट और inhibitors के जवाब में asl पीएच में गतिशील परिवर्तन पर नजर रखी जा सकती है । इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं (haecs) के asl एक पीएच संवेदनशील डाई के साथ रात भर दाग रहे है ताकि पतली फिल्म की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तरल पदार्थ के पुनरवशोषण के लिए अनुमति देने के लिए । प्रतिदीप्ति उपस्थिति या agonists की अनुपस्थिति में नजर रखी है के बाद, पीएच अंशांकन मात्रा और डाई एकाग्रता के लिए सही करने के लिए स्वस्थानी में किया जाता है. विधि वर्णित करने के लिए आवश्यक नियंत्रण प्रदान करता है स्थिर और reproducible ASL पीएच माप है, जो अंततः निजीकृत दवा के लिए एक दवा खोज मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अंय उपकला ऊतकों और प्रयोगात्मक के लिए अनुकूलित भड़काऊ और/या मेजबान-रोगज़नक़ मॉडल के रूप में शर्तों, ।

Introduction

वायुमार्ग उपकला एक पतली (~ 10 μm) तरल पदार्थ परत द्वारा कवर किया जाता है एयरवे सतह तरल (ASL) करार दिया । इस asl की संरचना और गहराई (जलयोजन) कसकर विनियमित है और mucocilliescalator1,2,3,4द्वारा एयरवे क्लीयरेंस की दक्षता नियंत्रित करता है । हाल के वर्षों में, एएसएसएल एच+/एचसीओ3- सामग्री के महत्व को asl हाइड्रेशन5, एयरवे सूजन6 और संक्रमण7को विनियमित करने की क्षमता के कारण विभिन्न समूहों द्वारा प्रदर्शित किया गया है, 8 साथ ही बलगम चिपचिपापन8,9। महत्वपूर्ण बात है, हालांकि वहां कुछ विवादों, कई अध्ययनों से इस तरह अस्थमा10,11,12, copd11के रूप में पुरानी airway रोगों में एयरवे पीएच के dysregulation की सूचना दी है, ब्रोंकाइटिस11, जीर्ण rhinosinusitis13,14 और सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF)5,9,15,16,17, जो पता चलता है कि चिकित्सा कि ASL पीएच बहाल करने के लिए पुरानी airway रोगों के कई प्रकार के इलाज के लिए उपयोगी हो सकता है । सीएफ़, काकेशियन आबादी में सबसे आम ऑटोसोमल अप्रभावी आनुवंशिक रोग है और यह CF ट्रांजेम्बल चालकत्व नियामक (CFTR) जीन में उत्परिवर्तनों के कारण होता है. इस जीन एक आयनों कोड (hco3- और सीएल-) चैनल है कि आयन और द्रव परिवहन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और homeostasis उपकला18भर में । हालांकि cf एक बहु-अंग रोग है, फेफड़ों की विकृति रुग्णता और मृत्यु दर का मुख्य कारण है19,20 और cf में प्राथमिक दोष को ध्यान में रखते हुए सीएल का बिगड़ा परिवहन है- और hco3-, एक परिकल्पना कि cf के साथ लोगों में है कि extracellular द्रव पीएच जो लोग cf नहीं है की तुलना में dysविामिभित हो जाएगा कर सकते हैं । इस प्रकार, asl ph का मापन सीएफ़ अनुसंधान का एक सामयिक क्षेत्र रहा है और विभिंन समूहों ने cf में asl ph को मापने के लिए तकनीकों का विकास किया है एयरवेज.

Vivo में, एयरवे पीएच विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर मापा गया है, माइक्रो-probes से (फाइबर ऑप्टिक, सोना या मोबिडियम जांच)5,21,22,23,24 के पीएच माप expectorated सामग्री या exhaled सांस घनेदार (ebc)10,11,12,25,26,27। सीएफ़ के अनुसंधान क्षेत्र में, पीएच का व्यापक अध्ययन इसके संभावित नैदानिक निहितार्थों के कारण किया जा रहा है । सैद्धांतिक रूप से, वायुमार्ग को और अधिक क्षारीय बनाने से जीवाणु की हत्या में वृद्धि हो सकती है और एक पूरे के रूप में एयरवे होमस्टोसिस में सुधार हो सकता है । तथापि, वीवो/एक्स वीवो अध्ययन में पीएच मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला की रिपोर्ट, और तारीख तक, परिणाम गैर-CF और cf एयरवेज के बीच पीएच में अंतर के अस्तित्व के बारे में निर्णायक नहीं हैं । प्रारंभिक 2000s में, विभिन्न समूहों EBC के पीएच की सूचना दी. गैर-रोगग्रस्त समूहों में, ph मान ४.६ से ८.५ के बीच थे, लेकिन दिलचस्प बात यह है कि, ebc पीएच को12,27CF के साथ लोगों में तीव्रता के दौरान अधिक अम्लीय पाया गया । अधिक हाल ही में, asl के vivo में माप में मानव और जानवरों के मॉडल CF की रिपोर्ट परस्पर विरोधी परिणाम16,17,21,22,23, 24 और यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि सीएफ़ एयरवेज गैर-cf वायुमार्ग की तुलना में अधिक अम्लीय है ।

के रूप में कम ASL पीएच के vivo माप में मुश्किल साबित कर दिया है तरल पदार्थ की बहुत छोटी राशि के कारण एयरवेज और रोग में बलगम प्लग की संभावित उपस्थिति, कई समूहों में बदल गया है ASL पीएच को मापने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में, मुख्य रूप से तीन अलग तरीके. पहले दृष्टिकोण का उपयोग करता है dextran युग्मित सेल-impermeant पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक जो एक सूखी पाउडर के रूप में जोड़ रहे हैं, या तो सीधे asl करने के लिए या एक अक्रिय द्रव का उपयोग कर perfluorocarbon (पीएफसी)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , ३२. हालांकि, इस तकनीक डाई कि संस्कृतियों में जोड़ा जाता है और डाई समुच्चय और नमूनों और/या प्रयोगों के बीच एकाग्रता में बड़ा अंतर और यहां तक कि एक ही नमूने के भीतर का एक जोखिम प्रस्तुत है की सटीक मात्रा पर थोड़ा नियंत्रण प्रदान करता है . यह भी आम तौर पर एक संनाभि माइक्रोस्कोप है, जो इसकी प्रयोज्यता और कई मामलों में सीमा के साथ प्रदर्शन किया गया है, कई नमूनों और रिकॉर्डिंग की स्थिति में परिवर्तन की विस्तृत निगरानी रोकता है । Asl पीएच को मापने के लिए नियोजित दूसरी विधि पीएच-सेंसिटिव माइक्रोइलेक्ट्रोड5,15का उपयोग है । ASL पीएच माप इसलिए फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता पर निर्भर नहीं कर रहे है और अधिक मजबूत और reproducible परिणाम देना चाहिए । हालांकि, इस विधि डायनेमिक, ASL pH के वास्तविक समय मापन के लिए अनुमति नहीं देता है, और न ही यह आसान विभिन्न शर्तों के तहत एकाधिक रीडिंग करने के लिए है । यह भी एक श्रम गहन, जटिल, प्रक्रिया है कि विशेषज्ञ उपकरणों की आवश्यकता है (microelectrode निर्माण/इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग उपकरणों) और बाद पीएच माप और अंशांकन के लिए नमूने के संग्रह के लिए प्रशिक्षण. इसके अलावा, इन दो तकनीकों को भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम का उत्पादन करने की क्षमता में कुछ विसंगतियों को दिखाया गया है: पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई विधि का प्रयोग, तांग एट अल. ७.३५ के मूल्यों की सूचना के लिए गैर के लिए-CF ASL और ७.० के लिए CF ASL8 जबकि एक अधिक में एक ही समूह से हाल के पेपर, ASL पीएच ६.९ और गैर के लिए ६.४-CF और CF, क्रमशः17था । इसी प्रकार, माइक्रोइलेक्ट्रोड मापन ने २००३ से अध्ययन में गैर-सीएफ एएसएल में ६.४ और सीएफ एएसएल में ६.१ का मान दिया जबकि इसी समूह ने ६.४५5से एक अध्ययन में गैर-सीएफ एएसएल और २०१३ के लिए ६.७ के मूल्यों की सूचना दी । अंत में, तीसरे दृष्टिकोण में, शोधकर्ताओं ने कमजोर buffered समाधान की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में जोड़ (mucosal) संस्कृतियों की सतह पर, इस प्रकार पतली फिल्म की स्थिति को नष्ट करने और ASL संरचना में फेरबदल, और संभवतः इसके नियमन. ph तो मापा जाता है या तो पीएच का उपयोग कर संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंग३३, एक पीएच द्वारा एक ussing चैंबर13,14, या पतला asl की आवश्यकता है संस्कृतियों और पीएच एक पीएच का उपयोग कर मापा से हटा दिया जाएगा में स्टेट टाइट्रेट करना पद्धति इलेक्ट्रोड, विश्लेषक या लिटमस३४स्ट्रिप्स । ASL पीएच की सही माप में एक और कठिनाई एक मानक वक्र है कि संभव के रूप में के रूप में सटीक है की स्थापना है । वास्तव में, रीडिंग एक इलेक्ट्रोड है कि एक राल के माध्यम से बिजली की क्षमता में अंतर को मापने या पीएच के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करेंगे के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, इन दोनों तरीकों नमूने जा रहा है की स्थानीय microenvironment से प्रभावित हो जाएगा मापा. अधिक विशेष रूप से, डिसोसिएशन स्थिरांक (केडी) रंगों के तापमान, ईओण ताकत, चिपचिपापन के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन और संभावित बलगम के रूप में सेलुलर घटकों के साथ डाई के संभावित बातचीत के आधार पर काफी भिन्न हो सकते हैं.

आदेश में प्रयास करें और इन तकनीकी मुद्दों के कई पर काबू पाने के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में विकसित करने के लिए एक और अधिक गतिशील, सरल और उच्च throughput विधि, हम एक इन विट्रो तकनीक है कि रिकॉर्ड प्राथमिक hAEC संस्कृतियों में ASL पीएच एक सेल का उपयोग कर-impermeant पीएच संवेदनशील की स्थापना की है एक मानक वाणिज्यिक प्लेट में फ्लोरोसेंट डाई-पाठक । विधि, पतली फिल्म की स्थिति के तहत पूरी तरह से विभेदित 3 डी सेल संस्कृतियों के ASL पीएच की प्रतिलिपि, गतिशील, अर्द्ध स्वचालित, वास्तविक समय मापन उत्पंन करता है । एक बहु के उपयोग के माध्यम से अच्छी तरह से थाली पाठक, इस अर्द्ध स्वचालित परख 12 घंटे से अधिक 24 शर्तों के लिए पीएच के एक साथ माप के पास कर सकते है और विभिंन एगोनिस्ट या inhibitors जोड़ने के प्रभाव की निगरानी कर सकते हैं । इस पत्र में हम विस्तार में पद्धति का वर्णन और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की स्थिति है कि तकनीक पुष्टि के तहत प्रतिनिधि परिणाम रिपोर्ट ।

Protocol

प्राथमिक गैर CF (n = 3 दानदाताओं, आयु ३४, 27 और 23 साल की उंर) और CF (n = 3 दाताओं, सभी F580del/F508del; आयु ४०, ४१, अज्ञात) hAECs डॉ स्कॉट एच Randell से एक तरह का उपहार थे (Marsico फेफड़े संस्थान, चैपल हिल, संयुक्त राज्य अमेरिका) में उत्तरी केरोलिना विश्वविद्यालय और obtai थे प्रोटोकॉल के तहत ned #03-१३९६ चैपल हिल जैव चिकित्सा संस्थागत समीक्षा बोर्ड में उत्तरी केरोलिना विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित । कोशिकाओं को पहले प्रकाशित विकास और भिंनता३५,३६द्वारा वर्णित मीडिया का उपयोग कर विधियों के अनुसार बड़े हो गए थे ।

1. नमूना तैयारी

  1. ६.५ मिमी व्यास अर्ध पारभणीय का समर्थन करता है पर प्राथमिक haecs बढ़ने (सामग्री की मेज) पर हवा तरल अंतरफलक के लिए कम से 28 दिनों के रूप में पहले वर्णित३५,३६।
  2. एचसीओ3 युक्त krebs बफर समाधान (एचसीओ3- krb, सांद्रता में दिए गए हैं ५० मिलीलीटर के बाँझ समाधान के लिए तैयार करें3 (25) nacl (११५), kcl (5), cacl2 (1), mgcl2 (1), D-ग्लूकोज (5)) और फिल्टर-जीवाणुरहित एक ०.२ μm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर ।
  3. १.१३५,३६में वर्णित के रूप में नए विभेदन मध्यम करने के लिए basolateral माध्यम बदलें ।
    नोट: यह दिखाया गया है कि basolateral ग्लूकोज एकाग्रता ASL पीएच३३को प्रभावित करता है । इस स्तर पर, basolateral डिब्बे के ग्लूकोज की सामग्री ज्ञात ग्लूकोज सांद्रता के समाधान buffered द्वारा माध्यम की जगह द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है ।
  4. एचसीओ3- krb के १५० μl जोड़कर कोशिकाओं की ऊपरी सतह धोने और 20 मिनट के लिए सेक्यूबेट ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2।
  5. यह ध्यान से एक बाँझ गिलास पाश्र पिपेट और एक बाँझ P200 पिपेट टिप एक आकांक्षा पंप कि संग्रह की बोतल में एक निर्वात बनाता करने के लिए लिंक का उपयोग करके उपकला को बाधित किए बिना शीर्ष धोने निकालें । इस स्तर पर, वहां के रूप में छोटे तरल हवा तरल अंतरफलक को बहाल करने के लिए संभव के रूप में शीर्षस्थ सतह पर शेष होना चाहिए ।
  6. ३७ ° c, 5% CO2पर एक और 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते ।

2. पृष्ठभूमि मापन

  1. प्लेट रीडर और कंप्यूटर चालू करें ।
  2. डैशबोर्ड खोलें ।
  3. स्पार्क 10mपर क्लिक करें, तापमान नियंत्रण खोलने के लिए और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट. गैस नियंत्रण खोलें और सह सेट करने के लिए2 5% ।
  4. तापमान और सीओ2 तक इंतजार अपने लक्ष्य तक पहुंच चुके हैं ।
  5. थाली रीडर दराज खोलो, नमी dH2के 6 एमएल के साथ भरा कैसेट प्रत्येक पक्ष पर ओ डालें । सुनिश्चित करें कि ढक्कन और थाली के नीचे साफ कर रहे है-अगर नहीं, ऊतक के एक टुकड़े पर इथेनॉल के ७०% के साथ साफ-और नमी कैसेट में थाली जगह है ।
    नोट: प्रयोग के दौरान, ऊतक संस्कृति प्लेट ढक्कन थाली पर रखा जाता है और केवल जब दवाओं को जोड़ने या basolateral माध्यम है, जो एक ऊतक संस्कृति स्तरीय प्रवाह हुड में प्रदर्शन कर रहे है एक बाँझ वातावरण में संस्कृतियों को रखने के लिए बदलने को हटा दिया ।
  6. स्पार्क मेथड एडिटर खोलें, और सॉफ़्टवेयर पर पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें:
    1. उपयुक्त थाली टेंपलेट का चयन करें (६.५ mm व्यास अर्द्ध पारमनीय समर्थन करता है के लिए, 24 अच्छी तरह से थाली का चयन करें) और कुओं है कि इस प्रयोग के दौरान नजर रखी जाएगी ।
    2. एक तापमान और सह2 नियंत्रण कक्ष जोड़ें और उन्हें ३७ डिग्री सेल्सियस और 5%, क्रमशः करने के लिए सेट करें । तापमान/गैस बक्सों की प्रतीक्षा करें ।
    3. एक काइनेटिक पाश पैनल जोड़ें और पाश प्रकार के रूप में अवधि का चयन करें और यह सेट करने के लिए 5-10 मिनट. सतत पठन सक्षम करने के लिए अंतराल प्रकार के रूप में परिभाषित नहीं है चुनें ।
      नोट: निरंतर पढ़ने के समय कुओं की संख्या पर निर्भर करता है/ 5 मिनट 6-12 कुओं के लिए काफी लंबा है, जबकि एक पूर्ण 24 शर्तों युक्त थाली निरंतर मापन के 10 मिनट की आवश्यकता होगी ।
    4. गतिज लूप के भीतर, दो "प्रतिदीप्ति तीव्रता" पैनल जोड़ने, खींचें और ड्रॉप समारोह का उपयोग कर, कि पीएच के प्रति संवेदनशील और पीएच असंवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों के लिए क्रमशः स्थापित किया जाएगा । Ph-संवेदी डाई और ४९५ और ५२० एनएम के लिए क्रमश: ५६० और ५९० एनएम के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य सेट करें, क्रमशः, पीएच-असंवेदनशील रंजक के लिए ।
    5. चमक की संख्या सेट 30 और जेड स्थिति के लिए ३३२०० प्रत्येक fluorophore के लिए ।
      नोट: z-स्थिति और लाभ सेटिंग्स थाली रीडर की विशेषताओं पर निर्भर हैं । लाभ मैन्युअल रूप से एक एगोनिस्ट का पता लगाने की सीमा से बाहर मूल्यों उत्पन्न नहीं होगा इतना है कि नमूनों के बीच मतभेद उठाया जाएगा, लेकिन काफी कम है कि उच्च पर्याप्त गिनती दे देंगे कि एक मान के लिए सेट करें.
    6. सेट करें एकाधिक पढ़ने के लिए प्रति अच्छी तरह से उपयोगकर्ता के लिए एक वृत्त प्रकार के रूप में परिभाषित 3 × 3 आकार ४७५० μm की एक सीमा के साथ ।
  7. एक पृष्ठभूमि माप बनाने के लिए शुरू बटन पर क्लिक करें और नमी कैसेट के ढक्कन की पुष्टि करने के लिए ठीक जगह में है.
  8. माप के अंत में, थाली पाठक दराज खोलने के लिए, थाली बाहर ले और प्रतिदीप्त डाई मिश्रण समाधान की तैयारी करते हुए इनक्यूबेटर में cellsit वापस Pplace ।
  9. 1 मिलीग्राम/एमएल dextran-युग्मित पीएच-सेंसिटिव (phsens) फ्लोरिसेंट डाई के ०.२ μl को जोड़कर फ्लोरोसेंट डाई मिश्रण समाधान तैयार करें 10 मिलीग्राम/एमएल dextran-युग्मित पीएच-असंवेदनशील (phins) फ्लोरोसेंट डाई और ०.८ μl बाँझ hco3- krb के लिए एक अंतिम प्रति शर्त 3 μL की मात्रा ।
    नोट: डाई मिक्स समाधान की कुल मात्रा n कुओं के लिए तैयार किया जाना चाहिए + 1 अगर वहाँ रहे हैं के बीच 1 और 10 नमूने, या एन वेल्स + 2 अगर वहाँ 11 और 24 नमूनों के बीच हैं. Dextran युग्मित रंजक फ़िल्टर्ड-बाँझ hco3- krb समाधान में पुनर्गठित कर रहे हैं, aliquoted और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । इस अवस्था में किसी भी रसायन को 16-24 ह ऊष्मायन अवधि३७ के लिए जोड़ा जा सकता है । रसायन 0.1 x के रूप में तैयार किया जाना चाहिए, अंतिम मात्रा के रूप में, संस्कृति द्वारा अतिरिक्त तरल पदार्थ के अवशोषण के बाद, एक ६.५ mm व्यास अर्द्ध पारभासी समर्थन के लिए लगभग ०.३ μL होगा ।
  10. ध्यान से 3 μL डाई मिश्रण (२.८ देखें) कोशिकाओं की ऊपरी सतह के लिए और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर रात भर सेते जोड़ें ।

3. गतिज माप

  1. प्लेट रीडर तैयार करने के लिए २.४ करने के लिए २.१ चरणों को दोहराएं ।
  2. ओपन आइकन पर क्लिक करें और विधि पृष्ठभूमि माप के लिए इस्तेमाल किया फ़ाइल का चयन
  3. काइनेटिक लूप पैनल में, अवधि के रूप में पाश प्रकार रखने के लिए और यह 08 घंटे के लिए निर्धारित किया है । निर्धारित करने के लिए अंतराल प्रकार परिवर्तित करें और इसे 5 मिनट के लिए सेट करें । प्रतिदीप्ति तीव्रता पैनलों को पृष्ठभूमि मापन के लिए समान रखें
    नोट: पृष्ठभूमि मापन के लिए अंतराल प्रकार निरंतर पढ़ने की अनुमति देने के लिए "निर्धारित नहीं" करने के लिए सेट किया गया है । काइनेटिक के रूप में अच्छी तरह से और अंशांकन प्रयोगों के लिए, अंतराल प्रकार 5 मिनट के अंतराल के साथ "फिक्स्ड" के लिए सेट किया गया है । यह प्रयोग के डिजाइन और शर्तों की संख्या के अनुसार समायोजित किया जा सकता है ।
  4. थाली रीडर दराज खोलें; डालें आर्द्रता प्रत्येक पक्ष पर डीएच2ओ के 6 मिलीलीटर से भरा कैसेट । सुनिश्चित करें कि ढक्कन और थाली के नीचे साफ कर रहे है-अगर नहीं, ऊतक के एक टुकड़े पर ७०% इथेनॉल के साथ साफ-और नमी कैसेट में थाली जगह, अपने कवर के साथ ।
  5. शुरू पर क्लिक करके प्रतिदीप्ति रीडिंग शुरू. ठीक क्लिक करें आर्द्रता कैसेट के ढक्कन सुनिश्चित करने के बाद जगह में है ।
  6. N चक्रों के बाद, आमतौर पर 12 और 24 के बीच, जो 1 से 2 घंटे के बराबर होता है, प्रयोग को बाधित करने के लिए रोकें क्लिक करें । प्लेट को बाहर निकाल लें और विभिन्न नमूनों के आधार पर किसी भी औषध/एगोनिस्ट को अलग से लगाएं ।
    नोट: जब कोशिकाओं को थाली रीडर से बाहर ले जाया जाता है, CO2 बच और इस के रूप में पीएच-संवेदनशील डाई प्रतिदीप्ति में एक बूंद से दिखाया Asl पीएच में वृद्धि पैदा करेगा. इस CO2-प्रेरित पीएच परिवर्तन 10-15 मिनट के भीतर संस्कृतियों वापस थाली रीडर में रखने के बाद उलटता ।
  7. थाली वापस ट्रे पर नमी कैसेट में रखो, नमी कैसेट ढक्कन की स्थिति और क्लिक करें क्रम में आगे asl पीएच रिकॉर्ड और दवाओं के प्रभाव पर नजर रखने के लिए और asl पीएच पर agonists ।

4. सीटू पीएच अंशांकन में

  1. थाली रीडर से बाहर निकाल लें ।
  2. बायोपार्श् वीय माध् यम/विलयन का महाप्राण
  3. Basolateral कंपार्टमेंट और शीर्षस्थ सतह, क्रमशः करने के लिए उच्च buffered मानक वक्र समाधान के ७५० μL और 1 μL जोड़ें ।
    नोट: अत्यधिक buffered मानक वक्र समाधान (मिमी में) NaCl (८६), KCl (5), CaCl2 (१.२), mgcl2 (१.२), NAHEPES या एमईएस या Tris (१०० मिमी) होते हैं । 7 से कम pH, पीएच 7-7.5 के समाधान के लिए NaHEPES और पीएच 8 के साथ समाधान के लिए Tris के साथ बफर समाधान के लिए एमईएस का उपयोग करें । एचसीएल का उपयोग कर वांछित मूल्य के लिए पीएच दबाना ।
  4. प्लेट रीडर पर बंद2 सीओ स्विच या ०.१% करने के लिए सेट और थाली वापस नमी कैसेट में जगह है ।
  5. एक ही पैरामीटर के साथ प्लेट रीडर सेट के रूप में पहले वर्णित है, लेकिन कोई CO2 के साथ चरण ३.२ में के रूप में ।
  6. प्रतिदीप्ति रीडिंग, 1 के लिए हर 5 मिनट-1.5 h शुरू करते हैं ।

5. अंशांकन डेटा पर डाई एकाग्रता और निलंबन की मात्रा के प्रभाव का मूल्यांकन

  1. पर्याप्त पीएच संवेदनशील और असंवेदनशील डाई मिश्रण तैयार करने के लिए 3 अलग मात्रा में 4 अलग पीएच मूल्यों की एक ंयूनतम पर प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड ।
    नोट: यहाँ, मिक्स 1 पीएच-सेंसिटिव (1 मिलीग्राम/एमएल) और पीएच-संवेदी (10 मिलीग्राम/एमएल) के २.६ μL के साथ 26 μL के साथ तैयार किया गया था और पीएच संवेदनशील (1 मिलीग्राम/मिलीलीटर) और पीएच-असंवेदनशील (10 मिलीग्राम/एमएल) के १.३ μL के साथ 2 मिश्रण ।
  2. वितरित २.२ μL या १.१ μL मिक्स 1 या मिश्रण 2, क्रमशः, एक ९६ कूप प्लेट के 12 कुओं में और पर्याप्त अंशांकन समाधान जोड़ने के लिए ५०, १०० या २०० μL के अंतिम संस्करणों को प्राप्त करने और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    नोट: इस सेट अप में, फ्लोरेसेंस काउंट 5 μg/mL (२०० μL में), 10 μg/ml (१०० या २०० μL), 20 μg/ml (५० या १०० μL) या ४० μg/ml (५० μL) में रंगों की सांद्रता के लिए रिकॉर्ड किया जाएगा ।
  3. प्लेट रीडर को चालू करें, तापमान को ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और प्लेट रीडर में प्लेट डालें । CO2 नियंत्रक चालू न करें ।
    नोट: के रूप में यह एक छोटा प्रयोग है और केवल पर्याप्त समय के लिए तापमान equilibrate की आवश्यकता है, नमी कैसेट की आवश्यकता नहीं है ।
  4. Z-स्थिति और ९६ अच्छी तरह से थाली के लिए लाभ को समायोजित करें और अर्द्ध पारभासी का समर्थन करता है पर किया प्रयोग के लिए के रूप में एक ही मापदंडों का उपयोग करें ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. सभी डेटा को स्प्रेडशीट में सहेजें और एक नई फ़ाइल बनाएं ।
  2. पृष्ठभूमि फ़ाइल में, प्रत्येक नमूने के लिए सभी माध्य डेटा का चयन करें/दोनों तरंगदैर्ध्य के लिए शर्त, कॉपी और नई फ़ाइल को चिपकाएं । प्रत्येक कूप और प्रत्येक तरंगदैर्घ्य के लिए माध्य पृष् ठभूमि परिकलित कीजिए ।
  3. इस अंशांकन और गतिज डेटा के साथ दोहराएं और प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए प्रत्येक डेटा बिंदु से पृष्ठभूमि घटाना ।
  4. प्रत्येक बार बिंदु और प्रत्येक नमूने के लिए, pH-संवेदी और pH-असंवेदनशील प्रतिदीप्ति के बीच अनुपात की गणना करें
  5. यदि सभी नमूने एक व्यक्ति दाता से प्राप्त किए गए थे, तो अंशांकन वक्र के प्रत्येक समय बिन्दु पर अनुपात के माध्य की गणना करें ।
    नोट: यह दानदाताओं या basolateral समाधान के रूप में कई अंशांकन curves के रूप में उत्पंन करने के लिए महत्वपूर्ण है । दरअसल, इन मापदंडों पृष्ठभूमि रीडिंग या तरल पदार्थ है, जो बारी में डाई एकाग्रता को प्रभावित करेगा और इसलिए परिकलित पीएच के अवशोषण की दर को प्रभावित कर सकते हैं ।
  6. हर बार बिंदु के लिए, अनुपात से एक मानक वक्र उत्पन्न, एक्स अक्ष पर ज्ञात पीएच मान और y-अक्ष पर अनुपात की साजिश रचने.
  7. समय बिंदु पर जो अनुपात स्थिर हैं, एक रेखीय प्रतीपगमन रेखा फ़िट और इस पंक्ति के लिए समीकरण प्राप्त निर्धारित करें ।
  8. काइनेटिक डेटा से, प्रत्येक समय बिंदु के लिए पीएच की गणना और y-अक्ष पर पीएच और एक्स-अक्ष पर समय प्लॉट
    नोट: आराम/बेसल पीएच की गणना किसी भी एगोनिस्ट या किसी अन्य हस्तक्षेप के अलावा पीएच के स्थिर माप पर डेटा बिंदुओं का औसत करके किया जा सकता है । एक एगोनिस्ट के प्रभाव से पहले और बाद में पीएच में अंतर की गणना की जा सकती है (समय की एक निश्चित राशि) उपचार या सीधे हस्तक्षेप के बाद डेटा बिंदुओं के लिए एक गैर रेखीय वक्र फिटिंग द्वारा । यह t1/2 और अधिकतम मान के बारे में अतिरिक्त जानकारी देगा । अंत में, अम्लीकरण या क्षारकीकरण की दर भी हस्तक्षेप के बाद पहले बिंदुओं के लिए फिट एक सीधी रेखा की ढलान से प्राप्त किया जा सकता है ।

Representative Results

ऊपर वर्णित तकनीक ASL पीएच के गतिशील माप को 24 अलग प्राथमिक hAECs संस्कृतियों में सक्षम बनाता है । चित्रा 1 मुख्य कदम और उपकरणों की स्थापना की एक योजनाबद्ध दिखाता है. रातों-रात भरी हुई कोशिकाओं को एक CO2 और तापमान नियंत्रित प्लेट रीडर में रखा जाता है जिसमें डेक्ट्रान-युग्मित पीएच-सेंसिटिव और पीएच-असंवेदनशील रंगों से प्रतिदीप्ति हर 5 मिनट दर्ज की जाती है ।

Figure 1
चित्रा 1: ASL पीएच माप विधि की योजनाबद्ध । संस्कृतियों धोने और एक पृष्ठभूमि पढ़ने के प्रदर्शन के बाद, प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं (hAECs) ASL dextran युग्मित पीएच संवेदनशील और पीएच-असंवेदनशील डाई ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर रातोंरात मिश्रण के साथ भरी हुई हैं । अगले दिन, थाली एक तापमान और सह2नियंत्रित प्लेट रीडर और दोनों रंगों से प्रतिदीप्ति समय के साथ दर्ज करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है । प्रयोग के बाद, एक स्वस्थानी अंशांकन प्रदर्शन किया है और डेटा का विश्लेषण और समय के साथ ASL पीएच के रूप में प्रस्तुत किया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

सबसे पहले, हम प्रतिदीप्ति गिनती पर विभिन्न मात्रा और डाई सांद्रता के प्रभाव की जांच की और इसलिए 560/495 अनुपात पर. दरअसल, पीएच-संवेदी डाई के लिए पीएच-असंवेदनशील जोड़ने का उद्देश्य ASL लोडिंग में परिवर्तनशीलता के लिए सही है । हालांकि, यह इस धारणा का परीक्षण और मूल्यांकन अगर हम एक मानक अंशांकन सभी प्रयोगों और कोशिका प्रकार के लिए एक ९६ अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं के अभाव में प्रदर्शन वक्र का उपयोग कर सकते महत्वपूर्ण था । ५०, १०० या २०० μl अंशांकन समाधान (पीएच ५.५, ६.५, 7 या 8) में रंग की 5, 10, 20 या ४० μg/ परिणाम चित्र 2a-Cमें प्रस्तुत किए गए हैं, और दर्शाते हैं कि समान pH और रंगों की समान सांद्रता के लिए, रिपोर्ट किया गया phsens/phins उत्सर्जन अनुपात (y-अक्ष पर 560/495) मात्रा के आधार पर भिन्न होता है (चित्र 2a) । इसके अतिरिक्त, एक ही पीएच और एक ही मात्रा में, अलग डाई सांद्रता अलग अनुपात मूल्यों (चित्रा 2b) प्रदान करते हैं । इसलिए, मात्रा या डाई एकाग्रता में परिवर्तन उत्सर्जन अनुपात से गणना पीएच के निरपेक्ष मूल्य को प्रभावित करेगा । चित्र 2c में यह दर्शाया गया है कि तापमान के साम्य के लिए आवश्यक समय लगभग 15-20 मिनट है । डाई एकाग्रता और उत्सर्जन अनुपात पर मात्रा के प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, हम प्राथमिक गैर के ASL में भरी हुई रंगों से प्रतिदीप्ति दर्ज की गई और सीटू में CF hAECs । हम तो अंशांकन प्रदर्शन किया और द्वारा परिणामों का विश्लेषण (1) सभी नमूनों से एक वैश्विक मानक वक्र पैदा करने या (2) प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए दो स्वतंत्र मानक घटता पैदा (गैर CF और CF). दोनों प्रकार के सेल से ASL pH को फिर समय के विरुद्ध प्लॉट किया गया (चित्र3 क, ख) और औसत (चित्र 3c) । एक वैश्विक मानक वक्र से प्राप्त asl ph मानों में गैर-cf और cf संस्कृतियों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाई दिया (चित्र 3a, C) जबकि asl ph, cf और गैर-cf haecs के बीच काफ़ी अलग नहीं था जब ph की गणना स्वतंत्र मानक घटता (चित्रा 3b, सी) । इन परिणामों के प्रत्येक प्रयोग के लिए और प्रयोग के भीतर स्वतंत्र अंशांकन घटता पैदा करने के महत्व को दिखाने के लिए, प्रत्येक दाता के नमूने के लिए, जब से अंशांकन curves एक साथ औसत थे, उच्च pHsens/ , एक अधिक अंलीय पीएच का संकेत (चित्रा 3C) ।

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो में पीएच अंशांकन का अनुकूलन. ज्ञात पीएच के समाधान के विभिंन संस्करणों और विभिंन डाई सांद्रता युक्त एक ९६ अच्छी तरह से थाली पर लोड किया गया और प्रतिदीप्ति 1 h. volume (क) और रंग एकाग्रता (ख) प्रतिदीप्ति अनुपात पर दर्ज किया गया था । समय-बिंदु 24 मिनट के लिए pH के विरुद्ध अनुपात प्लॉट किए गए थे । (ग) प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की प्रवणता की गणना प्रत्येक विलयन के लिए की गई थी और इसे समय के फलन (न्यूनतम में) के रूप में प्लॉट किया गया था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्थान पर प्राथमिक hAECs पर पीएच अंशांकन के विश्लेषण का अनुकूलन . (क) किसी एकल मानक वक्र से प्राप्त एएसएल पीएच का प्रतिनिधिक अंश----------------------। (B) गैर-cf या संस्कृतियों पर किए गए स्वतंत्र मानक वक्र से प्राप्त Asl pH के प्रतिनिधि अंश । प्रत्येक डेटा सेट की गणना अपने अंशांकन वक्र से की गई थी । (C) अंशांकन कैसे किया गया था के एक समारोह के रूप में गैर-CF और cf संस्कृतियों के बीच Asl pH में अंतर का मूल्यांकन । डेटा n = 3 प्रयोगों, 2 तरह ANOVA, सिद्क की एकाधिक तुलना परीक्षण से मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

आदेश में आगे हमारे तकनीक को मांय करने के लिए, हम तो एक सकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता को प्रदर्शित करने के लिए कि तकनीक ASL पीएच में एक ' उंमीद ' परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम था । CF कोशिकाओं में एक अधिक अंलीय asl की उपस्थिति के रूप में अभी भी विवादास्पद है, हम शिविर एगोनिस्ट forskolin इस्तेमाल किया, एक सकारात्मक नियंत्रण की स्थिति के रूप में, hco3- cftr के माध्यम से स्राव को उत्तेजित । अपेक्षित परिणाम गैर CF कोशिकाओं है कि मोटे तौर पर कम हो जाएगा या CF कोशिकाओं में उत्परिवर्तनों की गंभीरता के आधार पर समाप्त हो जाएगा में ASL के एक forskolin प्रेरित क्षानकरण दिखाएगा । चित्रा 4a Asl पीएच के प्रतिनिधि निशान से पता चलता है गैर-CF और cf कोशिकाओं के समय और चित्रा 4b से पहले और दोनों सेल प्रकार में forskolin साथ उपचार के बाद asl ph का मतलब डेटा से पता चलता है । हम इन परिणामों से अलग जानकारी प्राप्त कर सकते हैं । पहले, के रूप में पहले से ही चित्र 3b, सीमें दिखाया, आराम Asl पीएच गैर के बीच अलग नहीं था CF और cf उपकला. दूसरा, पहले 3-4 समय-अंक forskolin साथ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए प्रयोग रुके के बाद, पीएच में एक बड़ी वृद्धि है कि ~ 15 मिनट के भीतर बरामद दिखाया । यह प्लेट रीडर (5%) के बीच सह2 एकाग्रता में गिरावट के कारण था और ऊतक संस्कृति सुरक्षा कैबिनेट (~ 0%) । Henderson हैसेलबाल्च समीकरण, एक 5% CO2 वातावरण में 7 के पीएच hco3 की एकाग्रता को equates के अनुसार ~ ९.३ मिमी । जब कोशिकाओं थाली रीडर से हटा रहे हैं, 0% करने के लिए सह2 एकाग्रता में एक बूंद सैद्धांतिक रूप से > 8 के पीएच में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व करेंगे । चित्रा 4a से पता चलता है कि Asl पीएच ~ ७.८ के लिए वृद्धि हुई है जो समय की चूक द्वारा समझाया जा सकता है थाली रीडर में थाली (यानी, एक 5% CO2 वातावरण में). अंत में, के रूप में भविष्यवाणी की, basolateral के अलावा 10 μM forskolin (Fsk) काफी गैर में ASL पीएच में वृद्धि-CF संस्कृतियों केवल । के रूप में यह विभिंन समूहों द्वारा दिखाया गया है कि वहां स्थिर में एक अंतर राज्य ASL पीएच CF और गैर CF के बीच उपकला मौजूद है, हम आगे हमारे प्रयोगों और CFTR की भूमिका में पीएच अंतर की स्पष्ट अनुपस्थिति की जांच करना चाहता था । ऐसा करने के लिए हम पूर्व-विशिष्ट CFTR अवरोध करनेवाला, CFTRinh172 (१७२) के साथ गैर-CF संस्कृतियों इनक्यूबेटेड । के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग २.८ में कहा गया है, डाई मिश्रण ऊपर कहा गया के रूप में तैयार किया गया था और अवरोध करनेवाला 0.1 X = 2 μM की एकाग्रता में जोड़ा गया था । साहित्य के अनुसार, गैर-CF कोशिकाओं की एएसएल ऊँचाई लगभग 10 μm है । ६.५ मिमी व्यास के एक अर्द्ध पारभासी समर्थन में, ASL की सैद्धांतिक मात्रा इसलिए π × ३.२५2 = ०.३ μl है । डाई के 3 μL + १७२ 2 μM पर जोड़कर, अवरोध करनेवाला की एकाग्रता, अतिरिक्त तरल पदार्थ के अवशोषण के बाद, सैद्धांतिक रूप से होगा 20 μM (1x, वांछित एकाग्रता) । चित्रा 4C में प्रतिनिधि निशान और चित्रा 4d शो में मतलब है कि १७२ आराम asl पीएच को कम नहीं किया लेकिन asl पीएच में forskolin प्रेरित वृद्धि को रोकने के लिए किया था, इस प्रकार हमारे गैर से प्राप्त परिणाम की पुष्टि cf बनाम cf संस्कृतियों और आगे हमारी तकनीक मान्य ।

Figure 4
चित्रा 4: forskolin द्वारा CFTR सक्रियण के जवाब में गतिशील ASL पीएच मापन । (क) गैर-सीएफ और सीएफ में समय के साथ-साथ एएसएल पीएच के कैनेटीक्स पर forskolin (fsk, 10 μm) के प्रभाव के प्रतिनिधि निशान । डेटा n = 3 प्रयोगों से मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) गैर-सीएफ तथा सीएफ संस्कृतियों में एएसएल पीएच पर एफएसके के प्रभाव का सारांश । डेटा n से मतलब ± एसडी = 69 गैर CF संस्कृतियों और ३५ CF संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं (2-way ANOVA, सिदक की एकाधिक तुलना परीक्षण) । (ग) गैर-सीएफ में एएसएल पीएच में एफएसके-पे्ररित वृद्धि पर सीएफटीआरinh172 (१७२, 20 μm) के प्रभाव का प्रतिनिधिक अंश । डेटा n = 5 प्रयोगों से मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । (घ) नॉन-सीएफ संस्कृतियों में एएसएल के एफएसके-पे्ररित क्षाननीकरण पर १७२ के प्रभाव का सारांश । डेटा n = 5 प्रयोगों (2 रास्ता ANOVA, सिद्क की एकाधिक तुलना परीक्षण) से मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अंत में, के रूप में प्रोटोकॉल खंड ६.८ में कहा गया है, अम्लीकरण की दर/क्षारकरण के हस्तक्षेप के बाद प्रारंभिक समय-अंक के लिए एक रैखिक प्रतिगमन फिटिंग द्वारा गणना की जा सकती है । चित्र 5a से पता चलता है कि बासलेटरल hco3- समाधान (hco3- krb) को हटाने और यह एक hepes buffered समाधान के साथ की जगह,2CO की अनुपस्थिति में, asl के एक चिह्नित अंलीकरण प्रेरित । यह hco की कमी के साथ संगत है3- ट्रांसेपिपीलियल hco3- स्राव, जो इन airway कोशिकाओं द्वारा संरचक प्रोऑन स्राव की अनुमति देता है लगातार asl पीएच15, 17को कम करने में बाधा. दिलचस्प है, गैर के अंलीकरण की प्रारंभिक दर cf कोशिकाओं काफी धीमी थी cf संस्कृतियों से (चित्रा 5b) ।

Figure 5
चित्रा 5: एचसीओ3के जवाब में asl पीएच में गतिशील परिवर्तन- हटाने । (A) प्रतिनिधि अंश hco 3 के प्रभाव दिखा- asl पीएच के कैनेटीक्स पर हटाने के समय के साथ गैर में-cf और cf haecs. एसीडिफिकेशन की प्रारंभिक दरें hco3- हटाने के बाद 7 बार अंक के लिए फिट एक सीधी रेखा की ढलान के माध्यम से प्राप्त किया गया. डेटा क्रमशः n = 6 से ± SEM और गैर-CF और CF संस्कृतियों पर 7 प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) एचसीओ3 को हटाने के बाद एसिडिफिकेशन की प्रारंभिक दरों का सारांश । डेटा का अर्थ है ± SEM से n = 6 और गैर CF और CF संस्कृतियों पर 7 प्रयोगों क्रमशः (मान-Whitney परीक्षण) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां हम प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं में ASL पीएच के गतिशील माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं के ऊपरी सतह से बलगम धोने शामिल, मापने और प्रयोग में के रूप में एक ही मापदंडों का उपयोग पृष्ठभूमि घटाकर, z-स्थिति और लाभ का अनुकूलन और एक सीटू पीएच अंशांकन में प्रदर्शन.

कोशिकाओं को धोने का पहला कदम बलगम की एक मोटी परत के रूप में महत्वपूर्ण है (मैं) pericilliarlayer (PCL) तक पहुँचने से रंगों को रोकने और (ii) देरी या agonists/अवरोधकों के जवाब में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का पता लगाने को रोकने । हमारी विधि का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था कि कैसे प्राथमिक हासेक hco3 की गतिविधि संग्राहक और एच+ ट्रांसपोर्टर agonists के जवाब में. हालांकि यह कैसे PCL पीएच में परिवर्तन बलगम पीएच में परिवर्तन करने के लिए संबंधित की जांच करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा, इस प्रोटोकॉल के आगे विकास, अलग आणविक वजन के उपयोग सहित की जरूरत है-dextrans को विभेदीक रूप से लक्ष्य 2 परतों और जेड के माध्यम से स्कैन पूरे ASL.

पृष्ठभूमि मापन इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है । पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक airway उपकला के शीर्षस्थ सतह शायद ही कभी पूरी तरह से फ्लैट है जो प्रकाश पथ और इसलिए पृष्ठभूमि को प्रभावित करेगा । यह सुनिश्चित करना कि पृष्ठभूमि रीडिंग कुओं की एक ही स्थानीय अंक में प्रदर्शन के दौरान के रूप में किया जाता है reproducibility और रिकॉर्डिंग की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है ।

Z-स्थिति और लाभ का अनुकूलन आवश्यक कदम है कि फ्लोरिसेंट डाई कि इस्तेमाल किया जाएगा के प्रत्येक अलग एकाग्रता के लिए स्थापित करने की आवश्यकता है । इससे हाई इंटर-एक्सपेरीमेंट वैरिएबिलिटी पर रोक लगेगी । एक बार स्थापित, हमारे परख स्थिर और reproducible परिणाम प्रदान करता है । इस के लिए कारणों में से एक यह है कि रंग तरल पदार्थ है कि आसानी से उपकला द्वारा reabsorbed है की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं पर ऊपरी सतह पर जोड़ रहे हैं, एक समरूप ASL लेबल छोड़ । ASL दाग करने के लिए एक और तरीका है, कि समान रूप से सफल हो सकता है, सूखी पाउडर या पीएफसी में एक "निलंबन" का इस्तेमाल किया । हालांकि यह समय की बचत हो सकता है (के रूप में प्रयोग आम तौर पर 2 एच के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं), यह संभावना नहीं है कि शुष्क डाई पूरी तरह से ASL में घुलनशील और इस प्रकार हो सकता है फार्म clumps । इस प्रकार पीएच-संवेदी डाई के अलग सांद्रता उपकला कोशिकाओं की सतह पर पाया जाएगा ।

में सीटू पीएच अंशांकन एक महत्वपूर्ण कदम के लिए सटीक, reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए है । के रूप में दिखाया गया है और परिणाम अनुभाग में समझाया, asl संस्करणों में अंतर प्रतिदीप्ति गिनती को प्रभावित करेगा और इसलिए अंतर्वेशित पीएच मान (चित्रा 2 और चित्रा 3). Whilst विभिंन समूहों पहले asl पीएच माप प्रकाशित किया है, मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला भी विभिंन एक ही समूह8,17द्वारा प्रकाशित अध्ययनों के बीच प्राप्त किया गया है । हमें विश्वास है कि स्वस्थानी कैलिब्रेशन में प्रदर्शन करके, परिणाम अधिक reproducible हो जाएगा । अंय पीएच अंशांकन तकनीक है, जो उच्च K का उपयोग करें+/नाइजीरीसिन (या एकाधिक ionophores) विधि मानक वक्र28,29,30उत्पंन करने के लिए की तुलना में, परख यहां प्रस्तुत लाभ है कि , जब तक हर कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है, ASL पीएच के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं धोया, रखा जा सकता है और अंय प्रयोगों के लिए reused किया है कि उपचार प्रदर्शन अचल उपकला कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करते ।

विकास और इस परख के अनुकूलन reproducible परिणाम प्रदान की है और हम इस विधि उनके ASL पीएच माप के साथ अंय समूहों में मदद मिलेगी विश्वास करते हैं । हालांकि, इस तकनीक में भी सेट अप और उपयोग किए जा रहे कक्षों के प्रकार के कारण कुछ सीमाएं हैं । निगरानी ASL पीएच कि यहां प्रस्तुत की तुलना में एक लंबे समय अवधि में (> 8-10 ज) मुश्किल साबित हो सकता है के रूप में एक लंबी अवधि के उच्च आर्द्रता पर्यावरण उपकरण और तथ्य यह है कि सबसे थाली पाठकों केवल एक से अधिक काइनेटिक रीडिंग रिकॉर्ड करने के लिए विकल्प की पेशकश को नुकसान हो सकता है समय की निश्चित मात्रा (आमतौर पर 24 ज) । पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक haecs का उपयोग करने के तरीके में महत्वपूर्ण है कि भिंनता के विभिंन चरणों hco3- और एच+ ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करेगा । तथापि, तनु फिल्म स्थितियों के अंतर्गत उगाई गई कोशिकाओं में एएसएल की मात्रा को ठीक से नियंत्रित करने की वस्तुत कोई संभावना नहीं है । के रूप में प्रोटोकॉल और परिणाम वर्गों में कहा गया है, मात्रा में परिवर्तन प्रतिदीप्ति अनुपात को प्रभावित करेगा और यह दुर्भाग्य से लगता है कि कोशिकाओं में एक एकल व्यक्ति से हो, अलग अर्द्ध पारभासी का समर्थन करता है पर एक ही दिन वरीयता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, ASL संस्करणों एक ही होगा । इस सीमा से उत्पंन, किसी भी एगोनिस्ट या अवरोध करनेवाला है कि तरल पदार्थ स्राव या अवशोषण को प्रभावित करेगा asl मात्रा और संभवतः प्रतिदीप्ति अनुपात को प्रभावित करेगा । हालांकि, हमारे परख में, अंशांकन वक्र प्रयोग के अंत में किया जाता है, तो हम मान सकते है कि मात्रा में इन परिवर्तनों को एक ही रास्ते में अंशांकन अनुपात को प्रभावित करेगा के रूप में काइनेटिक प्रयोग के दौरान । इस कारण से हम समूहों है कि इस परख के विकास में रुचि होगी सलाह के लिए, कम से 2-3 इस शर्त के रूप में परीक्षण के रूप में प्रत्येक शर्त के लिए एक मानक वक्र की स्थापना के लिए अनुमति देगा के अनुसार प्रतिकृति का उपयोग करें ।

यहां हम एक सरल, अर्द्ध स्वचालित, परख कि पतली फिल्म शर्तों के तहत श्लैष्मिक सतह पीएच के वास्तविक समय मापन की अनुमति देता है वर्तमान । यह एक पास में कई संस्कृतियों में गतिशील पीएच प्रतिक्रियाओं की जांच की क्षमता है कि अंतर और अंत दाता तुलना की अनुमति देता है । एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट polarized प्रणाली का उपयोग कर प्रारूप करने के लिए इस विधि upscaling (HTS ९६ अच्छी तरह से प्लेटें)३८ एक दवा की खोज परख के रूप में भी उच्च throughput प्रदान करेगा । इसके अलावा, हम कैसे इस तकनीक asl पीएच पर एगोनिस्ट की तीव्र प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और हम पहले से ही प्रकाशित किया है कि इस विधि CF haecs asl३९पर एक शीर्ष प्रोन पंप अवरोध करनेवाला के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा कर सकते हैं दिखाया है । पीएच संक्रमण, सूजन, बलगम चिपचिपापन और आयन परिवहन को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में, आणविक लक्ष्य है कि पीएच में वृद्धि कर सकते हैं जीर्ण फेफड़ों के रोगों के अनुसंधान क्षेत्रों में मूल्यवान हो जाएगा की पहचान करने और इस तकनीक को संभवतः सुविधा होगी व् यक्तिगत चिकित् सा पद्धतियों में दवा जांच का विकास । अंत में, के बाद से एसिड आधार homeostasis में dysregulation अंय रोगों में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, इस प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है, अनुकूलन कदम के साथ, विभिंन उपकरणों के लिए (थाली पाठकों) और अंय उपकला कोशिकाओं के रूप में सेल प्रकार, । Extracellular अम्लता कैंसर की एक विशेषता है४०,४१,४२ और इस परख कैसे ठोस ट्यूमर कम पीएचई का उत्पादन या एक कम throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का निर्धारण में मदद कर सकता है पीएच homeostasis की बहाली । इसी तरह, पुरानी airway रोगों के लिए के रूप में, यह भी एक व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण के विकास के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है ।

Disclosures

एमबी: इस काम से संबंधित नहीं: अन्वेषक-फाइजर और Roche निदान से अनुसंधान अनुदान का नेतृत्व किया; वक्ता शुल्क नोवार्टिस, Roche निदान और TEVA से ंयूकैसल विश्वविद्यालय को भुगतान किया । Boehringer Ingelheim और वर्टेक्स फार्मास्यूटिकल्स से शैक्षिक बैठकों के लिए यात्रा खर्च.

Acknowledgments

इस कार्य को दो सीएफ ट्रस्ट रणनीतिक अनुसंधान केंद्र अनुदान (SRC003 और SRC013) और एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MRC) अवधारणा अनुदान (MC_PC_15030) में विश्वास द्वारा समर्थित किया गया था । JG चिकित्सा अनुसंधान फाउंडेशन (MRF-091-0001-आरजी-GARNE) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एमबी एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद के नैदानिक वैज्ञानिक फैलोशिप (MR/M008797/1) द्वारा समर्थित किया गया था । IH एक Wellcome ट्रस्ट नैदानिक प्रशिक्षण फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (203520/ इस शोध को न्यूकैसल हॉस्पिटल्स एनएचएस फाउंडेशन ट्रस्ट और न्यूकैसल यूनिवर्सिटी पर आधारित नैशनल इंस्टिट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च न्यूकैसल बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर ने सपोर्ट किया । व्यक्त किए गए विचार लेखक (ओं) के हैं और यह आवश्यक रूप से एनएचएस, एनआईएचआर या स्वास्थ्य विभाग के नहीं हैं । डॉ Randell से प्राथमिक कोशिकाओं सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन अनुदान (BOUCHE15R0) और NIH अनुदान (P30DK065988) द्वारा समर्थित थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385

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References

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जैव रसायन मुद्दा १४८ वायुमार्ग सतह तरल एसिड आधार संतुलन पीएच प्लेट रीडर हवा तरल इंटरफेस एयरवे उपकला सिस्टिक फाइब्रोसिस
वास्तविक समय, अर्ध-स्वचालित वायुमार्ग की सतह तरल प्राथमिक मानव Airway उपकला कोशिकाओं के pH का मापन
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Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).

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