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Biochemistry

En tiempo real, semi-automatizado de medición fluorescente de la superficie de las vías respiratorias pH líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias

Published: June 13, 2019 doi: 10.3791/59815
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2,4, 1,2, 2,3, 1
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children's Hospital, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

Presentamos un protocolo para realizar mediciones dinámicas del pH líquido de la superficie de las vías respiratorias en condiciones de película delgada utilizando un lector de placas.

Abstract

En los últimos años, la importancia del pH superficial de la mucosa en las vías respiratorias se ha destacado por su capacidad para regular la hidratación de la superficie de las vías respiratorias (ASL), la viscosidad del moco y la actividad de los péptidos antimicrobianos, parámetros clave involucrados en la defensa innata del Pulmones. Esto es de importancia primordial en el campo de las enfermedades respiratorias crónicas, como la fibrosis quística (CF), donde estos parámetros están disregulados. Mientras que los diferentes grupos han estudiado el pH de ASL tanto in vivo como in vitro, sus métodos informan una gama relativamente amplia de valores de pH de la ASL e incluso hallazgos contradictorios con respecto a cualquier diferencia de pH entre las células no CF y CF. Además, sus protocolos no siempre proporcionan suficientes detalles con el fin de garantizar la reproducibilidad, la mayoría son de bajo rendimiento y requieren equipo costoso o conocimientos especializados para implementar, haciéndolos difíciles de establecer en la mayoría de los laboratorios. Aquí describimos un ensayo de lector de placas fluorescentes semi-automatizado que permite la medición en tiempo real del pH de ASL en condiciones de película delgada que se asemejan más a la situación in vivo. Esta técnica permite mediciones estables durante muchas horas a partir de múltiples cultivos de vías respiratorias simultáneamente y, lo que es más importante, se pueden monitorizar los cambios dinámicos en el pH ASL en respuesta a los agonistas e inhibidores. Para lograr esto, la ASL de células epiteliales humanas primarias completamente diferenciadas (hAECs) se mancha durante la noche con un tinte sensible al pH con el fin de permitir la reabsorción del exceso de líquido para asegurar condiciones de película delgada. Después de monitorizar la fluorescencia en presencia o ausencia de agonistas, la calibración del pH se realiza in situ para corregir el volumen y la concentración del tinte. El método descrito proporciona los controles requeridos para hacer mediciones estables y reproducibles del pH de la ASL, que en última instancia podría ser utilizado como una plataforma de descubrimiento de fármacos para la medicina personalizada, así como adaptado a otros tejidos epiteliales y experimentales condiciones, como los modelos inflamatorios y/o del huésped-patógeno.

Introduction

El epitelio de las vías respiratorias está cubierto por una capa de fluido delgada (~ 10 μm) denominada líquido superficial de las vías respiratorias (ASL). La composición y la profundidad (hidratación) de esta ASL está estrechamente regulada y controla la eficiencia del aclaramiento de las vías respiratorias por la escalera mecánica mucociliaria1,2,3,4. En los últimos años, la importancia de la ASL H+/HCO3- contenido ha sido demostrado por diferentes grupos debido a su capacidad para regular la hidratación de ASL5, inflamación de las vías respiratorias6 y la infección7, 8 así como la viscosidad del moco8,9. Es importante destacar que, aunque existen algunas controversias, muchos estudios han reportado disregulación del pH de las vías respiratorias en enfermedades crónicas de las vías respiratorias como asma10,11,12, EPOC11, bronquiectasia11, rinosinusitis crónica13,14 y fibrosis quística (CF)5,9,15,16,17, que sugiere que las terapias que restauran el pH de la ASL podrían ser útiles para tratar múltiples tipos de enfermedades crónicas de las vías respiratorias. La FC es la enfermedad genética autosómica recesiva más común en las poblaciones caucásicas y se debe a mutaciones en el gen del regulador de conductancia transmembrana CF (CFTR). Este gen codifica un canal aniónico (HCO3- y cl-) que desempeña un papel crucial en el transporte de iones y fluidos y la la homeostasis a través de la epitelia18. Aunque el CF es una enfermedad multiorgánica, la patología pulmonar es la principal causa de morbilidad y mortalidad19,20 y considerar el defecto primario en CF es un transporte deteriorado de cl- y HCO3-, se puede hipotealizar que el pH del fluido extracelular en las personas con FC será disregulado en comparación con las personas que no tienen FC. por lo tanto, la medición del pH ASL ha sido un área de actualidad de la investigación de CF y diferentes grupos han desarrollado técnicas para medir el pH de la ASL en CF Airways.

In vivo, el pH de las vías respiratorias se ha medido utilizando diferentes técnicas, desde microsondas (sondas de fibra óptica, oro o mobidium)5,21,22,23,24 a mediciones de pH de material expectorado o condensado de aliento exhalado (EBC)10,11,12,25,26,27. En el campo de la investigación de la FC, el pH está siendo ampliamente estudiado debido a sus posibles implicaciones clínicas. Teóricamente, hacer las vías respiratorias más alcalinas podría aumentar la matanza bacteriana y mejorar el aclaramiento mucociliar y la la homeostasis de las vías respiratorias en su conjunto. Sin embargo, los estudios in vivo/ex vivo informan de una amplia gama de valores de pH, y hasta la fecha, los resultados no son concluyentes con respecto a la existencia de una diferencia de pH entre no CF y CF Airways. A principios de la década de 2000, diferentes grupos informaron el pH de la EBC. En grupos no enfermos, los valores de pH variaron de 4,6 a 8,5 pero curiosamente, el pH de EBC se encontró más ácido durante las exacerbaciones en personas con CF12,27. Más recientemente, las mediciones in vivo de la ASL en modelos humanos y animales de CF han reportado resultados contradictorios16,17,21,22,23, 24 y todavía no está claro si CF Airways son más ácidos que non-CF Airways.

Como la medición in vivo del pH inferior de la ASL ha demostrado ser difícil debido a la muy pequeña cantidad de fluido que recubre las vías respiratorias y la presencia potencial de tapones de moco en la enfermedad, muchos grupos han convertido en experimentos in vitro para medir el pH de la ASL, utilizando principalmente tres diferentes Metodologías. El primer enfoque utiliza colorantes fluorescentes sensibles al pH de la célula acoplada a dextran que se añaden como polvo seco, ya sea directamente a la ASL o mediante el uso de un fluido inerte llamado perfluorocarbono (PFC)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. sin embargo, esta técnica proporciona poco control sobre la cantidad exacta de tinte que se añade a las culturas y presenta un riesgo de agregados de tinte y grandes diferencias en la concentración entre muestras y/o experimentos e incluso dentro de la misma muestra . También se ha realizado generalmente con un microscopio confocal, que limita su aplicabilidad y en muchos casos, previene la monitorización detallada de múltiples muestras y cambios en las condiciones de grabación. El segundo método empleado para medir el pH de la ASL es el uso de microelectrodos sensibles al pH5,15. Por lo tanto, las mediciones de pH ASL no dependen de la concentración de colorante fluorescente y deben dar resultados más robustos y reproducibles. Sin embargo, este método no permite mediciones dinámicas en tiempo real del pH de ASL, ni es fácil realizar múltiples lecturas en diferentes condiciones. También es un proceso laborioso, complejo, que requiere equipo especializado (dispositivos de grabación de microelectrodo/electrofisiológico) y formación para la recolección de las muestras para la posterior medición y calibración del pH. Además, estas dos técnicas también han mostrado algunas inconsistencias en la capacidad de producir resultados reproducibles: utilizando el método de tinte fluorescente sensible al pH, Tang et al. valores reportados de 7,35 para non-CF ASL y 7,0 para CF ASL8 mientras que en un más documento reciente del mismo grupo, el pH de la ASL fue de 6,9 y 6,4 para los no CF y CF, respectivamente17. De manera similar, las mediciones de microelectrodos dieron valores de 6,4 en non-CF ASL y 6,1 en CF ASL en un estudio de 200315 mientras que el mismo grupo reportó valores de 6,7 para non-CF ASL y 6,45 para CF ASL en un estudio de 20135. Finalmente, en el tercer enfoque, los investigadores añaden un volumen relativamente grande de solución débilmente amortiguada en la superficie apical (mucosa) de las culturas, destruyendo así las condiciones de la película delgada y alterando la composición de la ASL, y potencialmente su regulación. a continuación, se mide el pH utilizando tintes fluorescentes sensibles al pH33, mediante un método de titulación pH-STAT en una cámara Ussing13,14, o se requiere que la ASL diluida se elimine de los cultivos y se mida el pH mediante un pH electrodo, analizador o tiras de tornasol34. Otra dificultad en la medición precisa del pH ASL es el establecimiento de una curva estándar que sea lo más precisa posible. De hecho, si las lecturas se realizan con un electrodo que medirá la diferencia en el potencial eléctrico a través de una resina o utilizando tintes fluorescentes sensibles al pH, ambos enfoques se verán afectados por el microentorno local de las muestras que se Medido. Más concretamente, la constante de disociación (KD) de los tintes puede variar considerablemente dependiendo de la temperatura, la fuerza iónica, la viscosidad, así como las posibles interacciones del tinte con componentes celulares tales como proteínas y potencialmente moco.

Con el fin de tratar de superar muchos de estos problemas técnicos, así como para desarrollar un método más dinámico, más simple y de mayor rendimiento, hemos establecido una técnica in vitro que registra el pH ASL en las principales culturas hAEC utilizando una célula-sensible al pH tinte fluorescente en un lector de placas comercial estándar. El método genera mediciones reproducibles, dinámicas, semi-automatizadas y en tiempo real del pH ASL de cultivos celulares 3D completamente diferenciados en condiciones de película delgada. Mediante el uso de un lector de placas de varios pozo, este ensayo semi-automatizado puede realizar mediciones casi simultáneas de pH para hasta 24 condiciones durante 12 h y puede monitorear el efecto de agregar varios agonistas o inhibidores. En este documento describimos la metodología en detalle y reportamos resultados representativos bajo condiciones de control positivas y negativas que validan la técnica.

Protocol

Primarias no-CF (n = 3 donantes, edad 34, 27 y 23 años) y CF (n = 3 donantes, todos F580del/F508del; edad 40, 41, desconocidos) los hAECs fueron un regalo amable del Dr. Scott H. Randell (Instituto marsico Lung, la Universidad de Carolina del norte en Chapel Hill, Estados Unidos) y fueron obtai Ned bajo protocolo #03-1396 aprobado por la Universidad de Carolina del norte en la Junta de revisión institucional Biomédica de Chapel Hill. Las células se cultivaron según métodos previamente publicados utilizando los medios de crecimiento y diferenciación descritos por Fulcher y Randell35,36.

1. preparación de la muestra

  1. Aumente las haecs primarias en soportes semipermeables de 6,5 mmde diámetro (tabla de materiales) en la interfaz aire-líquido durante al menos 28 días, como se describió anteriormente como35,36.
  2. Preparar 50 ml de solución estéril de HCO3- conteniendo Krebs solución tampón (HCO3- KRB, las concentraciones se dan en mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), MgCl2 (1), D-glucosa (5)) y esterilizar con filtro mediante un filtro de jeringa de 0,2 μm.
  3. Cambiar el medio basolateral a la diferenciación fresca como se describe en 1,135,36.
    Nota: se ha demostrado que la concentración de glucosa basolateral afecta a la ASL pH33. En esta etapa, el contenido de glucosa del compartimento basolateral puede controlarse sustituyendo el medio por soluciones amortiguadas de concentraciones de glucosa conocidas.
  4. Lavar la superficie apical de las células añadiendo 150 μL de HCO3- KRB e incubar durante 20 min a 37 ° c, 5% Co2.
  5. Quitar el lavado apical sin interrumpir el epitelio aspirando con cuidado con un Pipet Pasteur de vidrio estéril y una punta de Pipet P200 estéril ligada a una bomba de aspiración que crea un vacío en la botella de recogida. En esta etapa, debe haber tan poco líquido restante en la superficie apical como sea posible para restaurar la interfaz aire-líquido.
  6. Incubar las células por 30 min más a 37 ° c, 5% CO2.

2. medición de fondo

  1. Encienda el lector de placas y el ordenador.
  2. Abra el panel.
  3. Haga clic en Spark 10m, abra el control de temperatura y ajuste a 37 ° c. Abra el control de gas y fije el CO2 al 5%.
  4. Espere hasta que la temperatura y el CO2 alcancen sus objetivos.
  5. Abra el cajón del lector de placas, inserte el cassette de humedad lleno con 6 mL de dH2O en cada lado. Asegúrese de que la tapa y la parte inferior de la placa estén limpias – si no, limpie con un 70% de etanol en una pieza de tejido-y coloque la placa en el cassette de humedad.
    Nota: a lo largo del experimento, la tapa de la placa de cultivo de tejido se mantiene en la placa y sólo se retira al agregar fármacos o cambiar el medio basolateral, que se realizan en una campana de flujo laminar de cultivo de tejido para mantener las culturas en un ambiente estéril.
  6. Abra el editor de métodos de Spark y configure los parámetros en el software de la siguiente manera:
    1. Seleccione la plantilla de placa apropiada (para soportes semi-permeables de 6,5 mm de diámetro, seleccione la placa de 24 pocillos) y los pozos que se supervisarán durante este experimento.
    2. Añadir una temperatura y el panel de control CO2 y ponerlos a 37 ° c y 5%, respectivamente. Marque las cajas de temperatura/gas de la espera.
    3. Agregue un panel de bucle cinético y seleccione la duración como el tipo de bucle y establecerla en 5-10 min. Elija no definido como el tipo de intervalo para habilitar la lectura continua.
      Nota: el tiempo de lectura continua depende del número de pozos/condiciones. 5 min es lo suficientemente largo para 6-12 pozos, mientras que una placa completa que contiene 24 condiciones requerirá 10 min de mediciones continuas.
    4. Dentro del lazo cinético, añadir dos paneles de "intensidad de fluorescencia", utilizando la función de arrastrar y soltar, que se establecerá para el pH sensible y los colorantes fluorescentes de pH insensible respectivamente. Establecer longitudes de onda de excitación y emisión a 560 y 590 nm, respectivamente, para el tinte sensible al pH y 495 y 520 nm, respectivamente, para el tinte insensible al pH.
    5. Fije el número de flashes a 30 y la posición z a 33200 para cada fluoróforo.
      Nota: los ajustes de posición z y ganancia dependen de las características del lector de planchas. Establezca la ganancia manualmente en un valor que dará recuentos lo suficientemente altos para que las diferencias entre las muestras se recojan pero lo suficientemente bajas como para que la adición de un agonista no genere valores fuera del rango de detección.
    6. Establezca el múltiplo de lectura por pozo definido por el usuario como un tipo de círculo de 3 × 3 de tamaño con un borde de 4750 μm.
  7. Haga clic en el botón de inicio para realizar una medición de fondo y aceptar para confirmar que la tapa del cassette de humedad está en su lugar.
  8. Al final de la medición, abra el cajón del lector de placas, tome la placa y pplace la celda de nuevo en la incubadora mientras prepara la solución de mezcla de tinte fluorescente.
  9. Prepare la solución de mezcla de colorante fluorescente añadiendo 2 μl de 1 mg/ml de tinte fluorescente de pH (phsens) acoplado a dextrano a 0,2 μl de colorante fluorescente de 10 mg/ml de dextrano con pH (phins) y 0,8 μl de HCO3- KRB estéril para una última volumen de 3 μL por condición.
    Nota: el volumen total de la solución de mezcla de tinte debe prepararse para n pozos + 1 si hay entre 1 y 10 muestras, o n pozos + 2 si hay entre 11 y 24 muestras. Los colorantes acoplados con Dextran se reconstituyen en una solución HCO3- KRB filtrada y estéril, y se almacenan a-20 ° c. Cualquier producto químico se puede añadir en esta etapa para un período de incubación de 16-24 h37 en la superficie apical. Los productos químicos deben prepararse como 0,1 x, ya que el volumen final, después de la absorción del exceso de líquido por la cultura, será de alrededor de 0,3 μL para un soporte semi-permeable de 6,5 mm de diámetro.
  10. Añadir con cuidado 3 μL de mezcla de tinte (ver 2,8) a la superficie apical de las células e incubar durante la noche a 37 ° c, 5% CO2.

3. medición cinética

  1. Repita los pasos 2,1 a 2,4 para preparar el lector de planchas.
  2. Haga clic en el icono abrir y seleccione el archivo de método utilizado para las mediciones de fondo
  3. En el panel de bucle cinético, mantenga el tipo de bucle como Duration y establezca 08 horas. Cambie el tipo de intervalo a fijo y establezca 5 minutos. Mantenga los paneles de intensidad de fluorescencia igual que para las mediciones de fondo
    Nota: el tipo de intervalo para las mediciones de fondo se establece en "no definido" con el fin de permitir la lectura continua. Para los experimentos cinéticos y de calibración, el tipo de intervalo se establece en "Fixed" con un intervalo de 5 min. Esto se puede ajustar de acuerdo con el diseño del experimento y el número de condiciones.
  4. Abra el cajón del lector de planchas; Inserte el cassette de humedad lleno con 6 mL de dH2O en cada lado. Asegúrese de que la tapa y la parte inferior de la placa estén limpias – si no, limpie con un 70% de etanol en un trozo de tejido-y coloque la placa en el cassette de humedad, con su cubierta.
  5. Inicie las lecturas de fluorescencia haciendo clic en Inicio. Haga clic en Aceptar después de asegurarse de que la tapa del cassette de humedad está en su lugar.
  6. Después de n ciclos, normalmente entre 12 y 24, que equivale a 1 a 2 horas, haga clic en pausa para interrumpir el experimento. Sacar la placa y aplicar cualquier fármaco/agonistas basolaterally a las diferentes muestras.
    Nota: cuando las células son sacados del lector de placas, el CO2 escapa y esto inducirá un aumento en el pH ASL como se muestra por una caída en la fluorescencia del colorante sensible al pH. Este cambio de pH inducido por CO2invierte en 10-15 min después de volver a colocar los cultivos en el lector de placas.
  7. Coloque la placa de nuevo en el cassette de humedad de la bandeja, vuelva a colocar la tapa del cassette de humedad y haga clic en continuar para registrar aún más el pH de ASL y monitorear el efecto de los fármacos/agonistas en el pH de la ASL.

4. calibración in situ del pH

  1. Saca la placa del lector de placas.
  2. Aspiran el medio/solución basolateral.
  3. Añadir 750 μL y 1 μL de soluciones de curva estándar altamente amortiguada al compartimento basolateral y a la superficie apical, respectivamente.
    Nota: las soluciones de curva estándar altamente amortiguada contienen (en mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), MgCl2 (1,2), NAHEPES o MES o Tris (100 mm). Utilice la ETM para amortiguar soluciones con un pH inferior a 7, NaHEPES para soluciones de pH 7-7.5 y Tris para solución con pH 8. Sujete el pH al valor deseado utilizando HCl.
  4. Apague el CO2 en el lector de placas o colóquelo en el 0,1% y vuelva a colocar la placa en el cassette de humedad.
  5. Configure el lector de placas con los mismos parámetros descritos anteriormente, pero sin CO2 como en el paso 3,2.
  6. Iniciar lecturas de fluorescencia, cada 5 minutos para 1-1.5 h.

5. evaluación del efecto de la concentración del tinte y el volumen de la suspensión en los datos de calibración

  1. Prepare suficiente mezcla de tinte sensible al pH e insensible para registrar la fluorescencia en un mínimo de 4 valores de pH diferentes en 3 volúmenes diferentes.
    Nota: aquí, se preparó la mezcla 1 con 26 μL de sensibilidad al pH (1 mg/mL) y 2,6 μL de sensibilidad al pH (10 mg/mL) y se mezcló 2 con 13 μL de sensibilidad al pH (1 mg/mL) y 1,3 μL de sensibilidad al pH (10 mg/mL).
  2. Distribuir 2,2 μL o 1,1 μL de Mix 1 o mezclar 2, respectivamente, en 12 pozos de una placa de pozo de 96 y añadir suficientes soluciones de calibración para obtener volúmenes finales de 50, 100 o 200 μL y mezclar bien.
    Nota: en este conjunto, se registrarán recuentos de fluorescencia para concentraciones de colorantes de 5 μg/mL (en 200 μL), 10 μg/mL (en 100 o 200 μL), 20 μg/mL (en 50 o 100 μL) o 40 μg/mL (en 50 μL).
  3. Encienda el lector de placas, ajuste la temperatura a 37 ° c e inserte la placa en el lector de placas. No encienda el controlador CO2 .
    Nota: como este es un experimento corto y sólo requiere suficiente tiempo para equilibrar la temperatura, el cassette de humedad no es necesario.
  4. Ajuste la posición z y la ganancia para la placa de pozo 96 y utilice los mismos parámetros que para el experimento realizado en soportes semi-permeables.

6. Análisis de datos

  1. Guarde todos los datos en hojas de cálculo y cree un archivo nuevo.
  2. En el archivo de fondo, seleccione todos los datos de la media para cada muestra/condición para ambas longitudes de onda, copie y pegue en el nuevo archivo. Calcule el fondo medio para cada pozo y cada longitud de onda.
  3. Repita esto con los datos de calibración y cinética y reste el fondo de cada punto de datos para cada longitud de onda.
  4. Para cada punto de tiempo y cada muestra, calcule la relación entre la fluorescencia sensible al pH y el pH insensible
  5. Si todas las muestras se obtuvieron de un donante individual, calcule la media de las proporciones en cada punto de tiempo de la curva de calibración
    Nota: es importante generar tantas curvas de calibración como donantes o soluciones basolateral. De hecho, estos parámetros pueden afectar las lecturas de fondo o la tasa de absorción del fluido, que a su vez afectará la concentración de colorante y por lo tanto el pH calculado.
  6. Para cada punto de tiempo, genere una curva estándar a partir de las proporciones, trazando los valores de pH conocidos en el eje x y las proporciones en el eje y.
  7. Determine el punto de tiempo en el que las proporciones son estables, ajuste una línea de regresión lineal y obtenga la ecuación para esta línea.
  8. A partir de los datos cinéticos, calcule el pH para cada punto de tiempo y trace el pH en el eje y y el tiempo en el eje x
    Nota: el pH basal/de reposo se puede calcular promediando los puntos de datos sobre la medición estable del pH antes de la adición de cualquier agonista o cualquier otra intervención. El efecto de un agonista puede caracterizarse calculando la diferencia de pH antes y después (una cierta cantidad de tiempo) del tratamiento o mediante la adaptación de una curva no lineal a los puntos de datos directamente después de la intervención. Esto dará información adicional sobre el t1/2 y el valor máximo. Por último, las tasas de acidificación o alcalinización también se pueden obtener de la pendiente de una línea recta ajustada a los primeros puntos después de la intervención.

Representative Results

La técnica descrita anteriormente permite la medición dinámica de pH de ASL en hasta 24 cultivos de hAECs primarios separados. La figura 1 muestra un esquema de los pasos principales y el equipo configurado. Las células cargadas durante la noche se colocan en un lector de placas CO2 y con control de temperatura en el que se registran fluorescencia de colorantes sensibles al pH y de pH con acoplamiento dextrano cada 5 minutos.

Figure 1
Figura 1: esquema del método de medición del pH de la ASL. Después de lavar las culturas y realizar una lectura de fondo, las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias (hAECs) ASL se cargan con dextrano acoplado pH sensible al pH y la mezcla de tinte insensible a la noche a 37 ° c, 5% CO2. Al día siguiente, la placa se transfiere a una temperatura y un lector de placas controlado por CO2y la fluorescencia de ambos tintes se registra con el tiempo. Después del experimento, se realiza una calibración in situ y se analizan los datos y se presentan como ASL pH a lo largo del tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En primer lugar, investigamos el efecto de diferentes volúmenes y concentraciones de tinte en los recuentos de fluorescencia y por lo tanto en la relación 560/495. De hecho, el propósito de agregar el pH insensible al tinte sensible al pH es corregir la variabilidad en la carga de ASL. Sin embargo, era importante probar esta suposición y evaluar si podíamos usar una curva de calibración estándar realizada en ausencia de células en una placa de pozo de 96 para todos los experimentos y tipos de células. Supervisamos recuentos de fluorescencia de más de 1 h en 50, 100 o 200 μL de soluciones de calibración (a pH 5,5, 6,5, 7 u 8) que contengan 5, 10, 20 o 40 μg/mL de colorantes. Los resultados se presentan en la figura 2A-C, y muestran que para el mismo pH y la misma concentración de colorantes, la relación de emisión de phsens/phins notificada (560/495 en el eje y) difería dependiendo del volumen (figura 2A). Adicionalmente, con el mismo pH y el mismo volumen, diferentes concentraciones de tinte proporcionan diferentes valores de relación (figura 2B). Por lo tanto, los cambios en el volumen o la concentración de tinte afectarán el valor absoluto de pH calculado a partir de la relación de emisión. La figura 2C muestra que el tiempo necesario para el equilibrado de temperatura es de aproximadamente 15-20 min. Para confirmar el efecto de la concentración de tinte y el volumen en las proporciones de emisiones, se registró la fluorescencia de los colorantes cargados en la ASL de la primaria no CF y CF. Luego realizamos la calibración y analizamos los resultados mediante (1) generando una curva estándar global a partir de todas las muestras o (2) generando dos curvas estándar independientes para cada tipo de célula (no CF y CF). El pH ASL de ambos tipos de células se trazó con el tiempo (figura 3a, B) y promedió (Figura 3C). Los valores de pH de la asl obtenidos a partir de una única curva estándar global mostraron una diferencia significativa entre las culturas no CF y CF (figura 3a, C) mientras que el pH de la ASL no era significativamente diferente entre CF y haecs no-CF cuando el pH se calculó a partir de curvas estándar independientes (figura 3B, C). Estos resultados muestran la importancia de generar curvas de calibración independientes para cada experimento y dentro del experimento, para cada muestra de donante, ya que cuando las curvas de calibración se promediaron juntas, se encontraron valores de relación de pHsens/pHins más altos en los cultivos de CF , indicando un pH más ácido (Figura 3C).

Figure 2
Figura 2: optimización de la calibración del pH in vitro. Se cargaron diferentes volúmenes de soluciones de pH conocido y que contenían diferentes concentraciones de colorante en una placa de pozo de 96 y se registró una fluorescencia de más de 1 h. efecto del volumen (a) y la concentración de colorante (B) en las proporciones de fluorescencia. Las proporciones se trazaron contra el pH para el tiempo-punto 24 min. (C) la pendiente de cambio en la fluorescencia se calculó para cada solución y se trazó como una función del tiempo (en min). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: optimización del análisis de la calibración del pH en las hAECs primarias in situ. (A) trazas representativas del pH de la ASL obtenidas a partir de una curva estándar única que promedie los datos de las culturas no CF y CF. (B) trazas representativas de pH ASL obtenidas de una curva estándar independiente realizada en cultivos no CF o CF. Cada conjunto de datos se calculó a partir de su propia curva de calibración. (C) evaluación de las diferencias en el pH ASL entre las culturas no CF y CF en función de cómo se realizó la calibración. Los datos representan la media ± SEM de experimentos n = 3, ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Con el fin de validar aún más nuestra técnica, entonces se requería un control positivo para demostrar que la técnica era capaz de detectar un cambio "esperado" en el pH de la ASL. Como la presencia de una ASL más ácida en las células CF es todavía controversial, usamos la forskoline agonista del campo, como una condición de control positivo, para estimular la secreción de HCO3a travésde CFTR. Los resultados esperados mostrarían una alcalinización inducida por forskoline de la ASL en células no-CF que serían en gran parte disminuidas o abolidas en células CF dependiendo de la severidad de las mutaciones. La figura 4a muestra trazas representativas del pH ASL de las células no CF y CF a lo largo del tiempo y la Figura 4B muestra los datos de la media de la ASL pH antes y después del tratamiento con forskoline en ambos tipos de células. Podemos obtener información diferente de estos resultados. En primer lugar, como ya se muestra en la figura 3B, C, el pH en reposo de la ASL no fue diferente entre la epithelia no CF y la CF. En segundo lugar, los primeros 3-4 puntos de tiempo después de pausar el experimento para tratar las células con forskoline, mostraron un gran aumento en el pH que se recuperó dentro de ~ 15 min. Esto se debió a la disminución de la concentración de CO2 entre el lector de placas (5%) y el gabinete de seguridad del cultivo de tejidos (~ 0%). Según la ecuación de Henderson Hasselbalch, un pH de 7 en un entorno de 5% Co2 equivale a una concentración de HCO3- de ~ 9,3 mm. Cuando las células son removidos del lector de placas, una caída en la concentración de CO2 a 0% teóricamente conducirá a un aumento en el pH de > 8. La figura 4a muestra que el pH ASL aumentó a ~ 7,8 lo que puede explicarse por el lapso de tiempo reposicionando la placa en el lector de placas (es decir, en un entorno de 5% Co2 ). Finalmente, como se predijo, la adición de forskoline basolateral de 10 μM (FSK) aumentó significativamente el pH de ASL en cultivos que no son de CF. Como se ha demostrado por diferentes grupos que existe una diferencia en el pH de estado estacionario entre los epithelia CF y no-CF, queríamos investigar más a fondo la aparente ausencia de una diferencia de pH en nuestros experimentos y el papel de CFTR. Para ello hemos pre-incubado cultivos no-CF con el inhibidor específico de CFTR, CFTRinh172 (172). Como se indica en la sección de protocolo 2,8, la mezcla de tinte se preparó como se indicó anteriormente y el inhibidor se añadió a una concentración de 0,1 X = 2 μM. Según la bibliografía, la altura de la ASL de las células no CF es de aproximadamente 10 μm. En un soporte semi-permeable de 6,5 mm de diámetro, el volumen teórico de la ASL es por lo tanto π × 3,252 = 0,3 μl. Añadiendo 3 μL de tinte + 172 a 2 μM, la concentración del inhibidor, después de la absorción del exceso de fluido, teóricamente será de 20 μM (1x, concentración deseada). Las trazas representativas en la figura 4C y el Resumen medio en la figura 4d muestran que 172 no reduce el reposo de la ASL pH, pero sí previene el aumento inducido por forskoline en el pH ASL, confirmando así nuestros resultados obtenidos de non-CF versus CF culturas y validando aún más nuestra técnica.

Figure 4
Figura 4: medición dinámica de pH ASL en respuesta a la activación de CFTR por forskoline. (A) trazas representativas del efecto de la forskoline (FSK, 10 μm) en la cinética del pH de la ASL con el tiempo en no CF y CF haecs. Los datos representan la media ± SEM de los experimentos n = 3. (B) Resumen del efecto de FSK sobre el pH de la ASL en las culturas no CF y CF. Los datos representan la media ± SD de n = 69 cultivos no CF y 35 cultivos CF (ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). (C) trazas representativas del efecto de la CFTRinh172 (172, 20 μm) en el aumento inducido por el FSK en el pH de la ASL en los no-CF haecs. Los datos representan la media ± SEM de los experimentos n = 5. (D) Resumen del efecto de 172 sobre la alcalinización inducida por FSK de la ASL en cultivos no-CF. Los datos representan la media ± SEM de los experimentos n = 5 (ANOVA de 2 vías, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por último, como se indica en la sección de protocolo 6,8, las tasas de acidificación/alcalinización se pueden calcular mediante la adaptación de una regresión lineal a los puntos de tiempo iniciales después de la intervención. La figura 5A muestra que la eliminación de la solución que contiene HCO3basolateral (HCO3- KRB) y sustituirla por una solución HEPES tamponada, en ausencia de co- 2, indució una acidificación marcada de la ASL. Esto es consistente con la falta de HCO3- inhibición transepitelial HCO3- secreción, que permite la secreción de protones constitutiva por estas células de las vías respiratorias para reducir constantemente ASL pH15, 17. Curiosamente, la tasa inicial de acidificación de las células no CF fue significativamente más lenta que las culturas CF (figura 5b).

Figure 5
Figura 5: cambios dinámicos en la ASL pH en respuesta a la eliminaciónde HCO3. (A) trazas representativas que muestren el efecto de la eliminación de HCO3 en la cinética del pH del ASL con el tiempo en las haecs no CF y CF. Las tasas iniciales de acidificación se obtuvieron a través de la pendiente de una línea recta ajustada a 7 puntos de tiempo después de la eliminaciónde HCO3. Los datos representan los medios ± SEM de n = 6 y 7 experimentos en cultivos no CF y CF, respectivamente. (B) Resumen de las tasas iniciales de acidificación tras la eliminación de HCO3 . Los datos representan los medios ± SEM de n = 6 y 7 experimentos en cultivos no CF y CF respectivamente (prueba de Mann-Whitney). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la medición dinámica del pH de ASL en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias. Los pasos críticos incluyen lavar la mucosidad de la superficie apical de las células, midiendo y restando el fondo utilizando los mismos parámetros que en el experimento, optimizando la posición z y ganando y realizando una calibración in situ del pH.

El primer paso para lavar las células es crucial ya que una gruesa capa de moco podría (i) evitar que los tintes lleguen a la capa periciliaria (PCL) y (II) retrasar o prevenir la detección de cambios en la fluorescencia en respuesta a los agonistas/inhibidores. Nuestro método fue desarrollado para estudiar cómo las haecs primarias modulada la actividad de los transportadores HCO3- y H+ en respuesta a los agonistas. Si bien será interesante investigar cómo los cambios en el pH de PCL se relacionan con los cambios en el pH del moco, se necesita un mayor desarrollo de este protocolo, incluyendo el uso de diferentes pesos moleculares-dextrans para apuntar de forma diferencial las 2 capas y z-escaneos a través de la todo el ASL.

La medición de fondo es otro paso importante de este protocolo. La superficie apical de epitelios de las vías respiratorias primarias completamente diferenciadas rara vez es completamente plana, lo que afectará el camino de la luz y por lo tanto el fondo. Garantizar que las lecturas de fondo se realicen en los mismos puntos locales de los pozos que durante el experimento es fundamental para la reproducibilidad y la estabilidad de las grabaciones.

La optimización de la posición z y la ganancia son pasos necesarios que se deben configurar para cada concentración diferente de tinte fluorescente que se utilizará. Esto evitará una alta variabilidad inter-experimento. Una vez configurado, nuestro ensayo proporciona resultados estables y reproducibles. Una de las razones de esto es que los tintes se añaden en la superficie apical en las células en un pequeño volumen de fluido que es fácilmente reabsorbido por el epitelio, dejando una etiqueta homogénea ASL. Otro método para manchar el ASL, que puede ser igualmente exitoso, polvo seco usado o una "suspensión" en PFC. aunque esto puede ser ahorro de tiempo (como los experimentos se realizan generalmente dentro de 2 h), es poco probable que los tintes secos solubilizan completamente en la ASL y por lo tanto pueden forman grumos. Por lo tanto, diferentes concentraciones de tinte sensible al pH se encuentran sobre la superficie de las células epiteliales.

La calibración de pH in situ es un paso importante para obtener resultados precisos y reproducibles. Como se muestra y se explica en la sección de resultados, las diferencias en los volúmenes de ASL afectarán a los recuentos de fluorescencia y, por lo tanto, a los valores de pH interpolados (figura 2 y figura 3). Mientras que los diferentes grupos han publicado previamente mediciones de pH ASL, una amplia gama de valores se han obtenido incluso entre diferentes estudios publicados por el mismo grupo8,17. Creemos que al realizar calibraciones in situ, los resultados se volverán más reproducibles. En comparación con otras técnicas de calibración del pH, que utilizan el método alto de K+/nigericin (o varios ionóforos) para generar la curva estándar28,29,30, el ensayo presentado aquí tiene la ventaja de que , siempre y cuando cada paso se realiza en un gabinete de seguridad, las células utilizadas para el pH ASL se pueden lavar, conservar y reutilizar para otros experimentos si los tratamientos realizados no afectan irreversiblemente a las células epiteliales.

El desarrollo y la optimización de este ensayo ha proporcionado resultados reproducibles y creemos que este método ayudará a otros grupos con su medición de pH ASL. Sin embargo, esta técnica también tiene algunas limitaciones debido a la configurada y el tipo de celdas que se están utilizando. Monitorear el pH de ASL durante un período de tiempo más largo que el que se presenta aquí (> 8-10 h) podría resultar difícil ya que un ambiente de alta humedad a largo plazo podría dañar el equipo y el hecho de que la mayoría de los lectores de placas sólo ofrecen la opción de grabar lecturas cinéticas en un cierta cantidad de tiempo (típicamente 24 h). El uso de haecs primarios completamente diferenciados es crucial en la forma en que diferentes etapas de diferenciación afectarán la expresión de los transportadores HCO3- y H+ . Sin embargo, prácticamente no existe la posibilidad de controlar con precisión el volumen de la ASL en las células cultivadas bajo condiciones de película delgada. Como se indica en las secciones de protocolo y resultados, los cambios en el volumen afectarán a la proporción de fluorescencia y, lamentablemente, es necesario suponer que en las células cultivadas de un solo individuo, sembradas en el mismo día en diferentes soportes semi-permeables, volúmenes de ASL será el mismo. Derivado de esta limitación, cualquier agonista o inhibidor que afecte a la secreción o absorción de líquidos afectará al volumen de la ASL y presumiblemente a las proporciones de fluorescencia. Sin embargo, en nuestro ensayo, la curva de calibración se realiza al final del experimento, por lo que podemos suponer que estos cambios en el volumen afectarán a las proporciones de calibración de la misma manera que durante el experimento cinético. Por esta razón aconsejamos a los grupos que estarían interesados en desarrollar este ensayo, a utilizar al menos 2-3 réplicas por condición probada ya que esto permitirá el establecimiento de una curva estándar para cada condición.

Aquí presentamos un ensayo simple, semi-automatizado, que permite la medición en tiempo real del pH de la superficie de la mucosa en condiciones de película delgada. Tiene la capacidad de investigar respuestas dinámicas de pH en muchas culturas de una manera casi simultánea que permite comparaciones entre y entre donantes. El escalado de este método a un formato de placa de pozo 96 con sistema polarizado (placas de pozo HTS 96)38 proporcionaría un rendimiento aún mayor como un ensayo de descubrimiento de fármacos. Por otra parte, hemos demostrado cómo esta técnica se puede utilizar para estudiar el efecto agudo de los agonistas en el pH ASL y ya hemos publicado que este método se puede utilizar para estudiar el efecto a largo plazo de un inhibidor de la bomba de protones apical en CF hAECs ASL39. Como se ha demostrado que el pH regula la infección, la inflamación, la viscosidad del moco y el transporte de iones, identificar los objetivos moleculares que pueden aumentar el pH será valioso en los campos de investigación de las enfermedades pulmonares crónicas y esta técnica facilitará potencialmente la desarrollo de la detección de fármacos en enfoques de medicina personalizada. Finalmente, dado que la disregulación en la la homeostasis ácido-base desempeña un papel importante en otras enfermedades, este protocolo se puede adaptar, con pasos de optimización, a diferentes equipos (lectores de placas) y tipos de células, tales como otras células epiteliales. La acidez extracelular es una característica del cáncer40,41,42 y este ensayo podría ayudar a determinar cómo los tumores sólidos producen pH bajoe o podrían utilizarse como un ensayo de detección de fármacos de bajo rendimiento para restablecimiento de la homeostasis del pH. Del mismo modo, en cuanto a las enfermedades crónicas de las vías respiratorias, también podría proporcionar una plataforma para el desarrollo de un enfoque de medicina personalizada.

Disclosures

MB: no relacionado con este trabajo: becas de investigación dirigidas por investigadores de Pfizer y Roche Diagnostics; los honorarios de los oradores pagados a la Universidad de Newcastle de Novartis, Roche Diagnostics y TEVA. Gastos de viaje a reuniones educativas de Boehringer Ingelheim y Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por dos becas del centro de investigación estratégica de la CF Trust (SRC003 y SRC013) y una subvención de confianza en concepto del Consejo de investigación médica (MRC) (MC_PC_15030). JG fue apoyado por una subvención de la Fundación de investigación médica (MRF-091-0001-RG-GARNE). EL MB fue apoyado por un Consejo de investigación médica (MR/M008797/1). IH fue apoyado por una beca de formación clínica Wellcome Trust (203520/Z/16/Z). La investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de investigación sanitaria de Newcastle centro de investigación biomédica con sede en Newcastle hospitales NHS Foundation Trust y la Universidad de Newcastle. Las opiniones expresadas son las del autor (es) y no necesariamente las del NHS, la NIHR o el Departamento de salud. Las células primarias del Dr. Randell fueron apoyadas por la subvención de la Fundación de fibrosis quística (BOUCHE15R0) y la subvención NIH (P30DK065988).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385

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References

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