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Methodenartikel

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

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DOI:

10.3791/59830

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17. Juli 2019

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1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University, 2The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, 3School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 4Department of Tissue and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease, Wuhan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

Zusammenfassung

Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in biologischen Prozessen wie Transkription, Rekombination und RNA-Stoffwechsel. Experimentelle Methoden zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen erfordern die Verwendung von Fluoreszenz-Tags, radioaktiven Isotopen oder anderen Etiketten, um bestimmte Zielmoleküle zu erkennen und zu analysieren. Biotin, ein nicht-radioaktives Nukleinsäurelabel, wird häufig in elektrophoretischen Mobilitätsschicht-Assays (EMSA) verwendet, wurde aber nicht regelmäßig zur Überwachung der Proteinaktivität während Nukleinsäureprozessen eingesetzt. Dieses Protokoll veranschaulicht den Nutzen der Biotinkennzeichnung während in vitro enzymatischer Reaktionen und zeigt, dass dieses Etikett gut mit einer Reihe von verschiedenen biochemischen Assays funktioniert. Insbesondere wird in Übereinstimmung mit früheren Befunden mit Radioisotop 32P-markierten Substraten über biotin-markiertes EMSA bestätigt, dass MEIOB (ein Protein, das speziell an der meiotischen Rekombination beteiligt ist) ein DNA-bindendes Protein ist, RNA-Helicase) löst biotinmarkierte RNA-Duplexstrukturen auf und dass MEIOB biotinmarkierte einsträngige DNA spaltet. Diese Studie zeigt, dass Biotin in der Lage ist, 32P in verschiedenen Nukleinsäure-bezogenen biochemischen Assays in vitro zu ersetzen.

Einleitung

Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen sind an vielen wesentlichen zellulären Prozessen wie DNA-Reparatur, Replikation, Transkription, RNA-Verarbeitung und Translation beteiligt. Protein-Wechselwirkungen mit spezifischen DNA-Sequenzen innerhalb des Chromatins sind für die genaue Kontrolle der Genexpression auf der Transkriptionsebene1erforderlich. Eine präzise posttranskriptionelle Regulation zahlreicher kodierender und nicht kodierender RNAs erfordert umfangreiche und komplizierte Wechselwirkungen zwischen jedem Protein und RNA2. Diese Schichten des Regulierungsmechanismus der Genexpression bestehen aus einer Kaskade dynamischer intermolekularer Ereignisse, die durch Wechselwirkungen von Transkriptions-/epigenetischen Faktoren oder RNA-bindenden Proteinen mit ihren Nukleinsäurezielen koordiniert werden, sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen. Um zu sezieren, ob Proteine in vivo direkt oder indirekt mit Nukleinsäuren in Verbindung gebracht werden und wie solche Assoziationen auftreten und kulminieren, werden in vitro biochemische Assays durchgeführt, um die Bindungsaffinität oder enzymatische Aktivität von Proteinen von Interesse auf substrate von DNA und/oder RNA.

Viele Techniken wurden entwickelt, um Nukleinsäure-Protein-Komplexe zu erkennen und zu charakterisieren, einschließlich des elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA), auch als Gel-Retardierungs-Assay oder Band-Shift-Assay3,4,5 bezeichnet . EMSA ist eine vielseitige und empfindliche biochemische Methode, die weit verbreitet ist, um die direkte Bindung von Proteinen mit Nukleinsäuren zu untersuchen. EMSA setzt auf Gel elektrophoretische Verschiebung in Bändern, die routinemäßig mit Chemilumineszenz visualisiert werden, um Biotin-Etikettenzuerkennen 6,7, die Fluoreszenz der Fluorophor-Etiketten8,9, oder durch Autoradiographie radioaktiver 32P-Etiketten10,11. Andere Zwecke biochemischer Studien sind die Identifizierung und Charakterisierung der Nukleinsäure-Verarbeitungsaktivität von Proteinen, wie nukleasingbasierte Reaktionen zur Bewertung der Spaltungsprodukte aus Nukleinsäuresubstraten12, 13 , 14 und DNA/RNA-Struktur-Abwicklungs-Assays zur Bewertung der Helicase-Aktivitäten15,16,17.

Bei solchen enzymatischen Aktivitätstests werden die radioisotop-markierten oder fluorophor-markierten Nukleinsäuren aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit häufig als Substrate verwendet. Die Analyse von Röntgenaufnahmen enzymatischer Reaktionen mit 32P-markierten Radiotracernwurde als empfindlich und reproduzierbar 18 gefunden. Doch in einer wachsenden Anzahl von Laboratorien in der Welt ist die Verwendung von Radioisotopen aufgrund der gesundheitsrechtlichen Risiken, die mit einer möglichen Exposition verbunden sind, eingeschränkt oder sogar verboten. Neben den Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit sind weitere Nachteile die notwendige Ausrüstung für die Durchführung von Arbeiten mit Radioisotopen, die erforderliche Radioaktivitätslizenz, eine kurze Halbwertszeit von 32P (ca. 14 Tage) und eine allmähliche Verschlechterung der Sondenqualität aufgrund von Radiolyse. So wurden alternative nicht-isotopenfreie Methoden entwickelt (d.h. die Kennzeichnung der Sonde mit Fluorophoren ermöglicht die Detektion mittels fluoreszierender Bildgebung19). Bei der Verwendung fluoreszierender Sonden wird jedoch ein hochauflösendes Bildgebungssystem benötigt. Biotin, ein häufig verwendetes Label, bindet leicht an biologische Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren. Biotin-streptavidin System arbeitet effizient und verbessert die Erkennungsempfindlichkeit ohne Erhöhung des unspezifischen Hintergrunds20,21. Neben EMSA wird Biotin häufig zur Proteinreinigung und RNA-Pull-down eingesetzt, unter anderem22,23,24.

Dieses Protokoll verwendet erfolgreich biotinmarkierte Nukleinsäuren als Substrate für in vitro biochemische Assays, die EMSA enthalten, zusätzlich zu enzymatischen Reaktionen, bei denen Biotin nicht häufig verwendet wurde. Die MEIOB-OB-Domäne ist aufgebaut und zwei Mutanten (Abschneide und Punktmutation) werden als GST-Fusionsproteine25,26,27, sowie Maus MOV10 rekombinantes FLAG-Fusionsprotein16exprimiert. Dieser Bericht hebt die Wirksamkeit dieses kombinierten Protokolls für die Proteinreinigung und biotinmarkierte Assays für verschiedene experimentelle Zwecke hervor.

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Protokoll

1. Proteinzubereitung

  1. MEIOB- und MOV10-Ausdruckskonstrukte
    1. Generieren cDNA-Expression konstruktiert Codierungsmaus MEIOB-A, C und E (Abbildung 1A) und MOV10.
      1. Richten Sie die Polymerase-Kettenreaktionsreaktionen (PCR) für jedes Fragment ein. Mischen Sie 1 l Maus-cDNA (aus C57BL/6-Maus-Testis), 1 l dNTP, 2 l von 10 -M Vorwärtsprimer, 2 l von 10 -M-Reverse-Primer, 1 L DNA-Polymerase, 25 l 2x PCR-Puffer und 18 l doppelt destilliertem H2 O(ddH2O) in einem End- Volumen von 50 l.
        HINWEIS: Die Primer für die Verstärkung von Meiob- und Mov10-Genfragmenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
      2. PCR-Reaktionen mit folgenden Programmen durchführen: 95 °C für 5 min, 35 Heizzyklen bei 95 °C für 15 s, Glühen bei 64 °C für 15 s, Verlängerung bei 72 °C für 20 s (2 min für verlängerung der gesamten Länge MOV10) und Endverlängerung bei 68 °C für 7 min.
        HINWEIS: Verwenden Sie das Primerpaar MEIOB-E (F1) und MEIOB-E-mut (R1) und MEIOB-E-mut (F2) und MEIOB-E (R2), um zwei Segmente zu verstärken, die die mutierte Sequenz innerhalb einer überlappenden Sequenz an den Enden 3' bzw. 5' enthalten, um eine mutierte PCR-Vorlage zu generieren.
    2. Analysieren Sie die verstärkte PCR-DNA durch Gelelektrophorese, schneiden Sie das Band der erforderlichen Größe schnell unter einer UV-Lampe aus dem Gel und legen Sie es in ein Zentrifugenrohr.
      HINWEIS: Die erwarteten Produktgrößen auf dem Agarose-Gel für MEIOB-A sind 536 bp, MEIOB-C ist 296 bp, MEIOB-E sind 312 bp und 229 bp, und MOV10 ist 3015 bp.
    3. Reinigen Sie die PCR-DNA mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Herstellerprotokoll.
      1. Fügen Sie dem Zentrifugenrohr ab Schritt 1.1.2 ein gleiches Volumen des Auflösenspuffers hinzu und schmelzen Sie Das gel in einem 50-55 °C Wasserbad für 5-10 min, damit die Gelstücke vollständig schmelzen. Zentrifuge kurz, um tröpft alle Tröpfchen von der Wand des Rohres zu sammeln.
        ANMERKUNG: Die Massen-/Volumenkonzentration des Gels und des Auflösungspuffers beträgt 1 mg/L.
      2. Legen Sie die Adsorptionsspalte in das Sammelrohr, übertragen Sie die Lösung, die das gelöste Gelfragment enthält, in die Adsorptionsspalte und Zentrifugen bei 12.000 x g für 2 min.
      3. Entsorgen Sie das Filtrat an der Unterseite der Sammelrohre. Fügen Sie der Säule 600 l des Waschpuffers, Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min, und entsorgen Sie das Filtrat.
      4. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.3 einmal.
      5. Legen Sie die Säule wieder in das Sammelrohr und Zentrifugen bei 12.000 x g für 2 min, um den verbleibenden Waschpuffer zu entfernen.
      6. Legen Sie die Adsorptionssäule in ein 1,5 ml sterilisiertes Zentrifugenrohr, fügen Sie 50 l ddH2O in die Mitte der Adsorptionssäule und Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min. Messen Sie die DNA-Konzentration des Eluats mit Spektralphotometer.
    4. Einschränkung der Verdauung von Plasmiden
      1. Digest pGEX-4T-1 Vektor mit BamHI und NotI. Mischen Sie dazu 4 g pGEX-4T-1-Vektor, 5 l 10x Digest-Puffer, 1 l BamHI und 1 l NotI und ddH2O auf ein Endreaktionsvolumen von 50 l. Bei 37 °C für 2 h inkubieren.
      2. Verdauen Sie den pRK5-Vektor mit BamHI und XhoI, indem Sie 4 g pRK5-Vektor, 5 l 10x Digest-Puffer, 1 l BamHI und 1 L XhoI und ddH2O auf ein endliches Reaktionsvolumen von 50 l mischen. Bei 37 °C für 2 h inkubieren.
    5. Analysieren Sie die Vektor-DNA durch Gelelektrophorese, schneiden Sie das gewünschte Größenband schnell mit einem Skalpell unter einer UV-Lampe aus dem Gel und legen Sie es in ein Zentrifugenrohr.
    6. Reinigen Sie die Vektor-DNA mit einem Gel-Extraktionskit als 1.1.3 nach Anweisung des Herstellers.
      ANMERKUNG: Die Länge der linearisierten Plasmide: pGEX-4T-1, 4.4 kb; pRK5, 4.7 kb.
    7. Richten Sie eine standardrekombinante Ligationsreaktion ein, indem Sie 0,03 pmol linearisierten Vektor, 0,06 pmol cDNA-Fragment, 2 l Ligase und 4 l 5x Ligasepuffer und ddH2O in einem Endreaktionsvolumen von 10 l kombinieren.
      HINWEIS: Klonen Sie MEIOB-A, C und E in einen pGEX-4T-1-Vektor und MOV10 in einen pRK5-Vektor.
    8. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min, und kühlen Sie dann die Reaktion sofort für 5 min auf Eis. Transformieren Sie MEIOB-rekombinante Plasmide in BL21-Bakterien und MOV10-rekombinante Plasmide in DH5-Bakterien.
      HINWEIS: Überprüfen Sie alle rekombinanten Konstrukte durch Sanger-Sequenzierung.
    9. Bereiten Sie Glyzerinbestände von Bakterienkulturen vor, die verifizierte rekombinante Plasmide enthalten, indem Sie flüssigen Kulturen ein gleiches Volumen von 50 % Glycerin hinzufügen und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Streichen Sie für jedes nachfolgende Experiment Bakterien aus Glyzerinbeständen auf eine frische Agarplatte und verwenden Sie eine einzige Kolonie für die Expansion, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  2. MEIOB Proteinextrakte aus Bakterien
    1. Wählen Sie eine Kolonie jedes BL21-Stamms, der mit dem leeren oder rekombinanten pGEX-4T-1-Plasmid transfiziert ist, das durch Sequenzierung verifiziert wird, und impfen Sie in 3 ml LB, der 100 g/ml Ampicillin enthält. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm wachsen.
    2. 300 ml ulkulieren, mit 100 g/ml Ampicillin ab 3 ml Nachtkultur (ab Schritt 1.2.1). Wachsen Sie die Kulturen mit Schütteln bei 37 °C für 2 h, bis OD600 0,5-1,0 erreicht.
    3. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl beta-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,2 mM. Inkubieren Sie die Kulturen für weitere 3 h mit Schütteln bei 180 Rpm und 18 °C.
    4. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 3.500 x g und 4 °C für 20 min.
    5. Setzen Sie das Pellet in 20 ml eiskalten Dulbecco-Phosphat-Gepufferten Saline-Puffer (DPBS) wieder aus. Sonicate die bakterielle Suspension auf Eis für 25 Zyklen in kurzen 10 s Bursts (Ausgangsleistung 20%) gefolgt von 2-3 s auf Eis ruhen.
    6. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 x g und 4 °C für 15 min. Übertragen Sie den gesamten Überstand auf ein frisches Rohr.
    7. Vorwaschen Perlen.
      1. Fügen Sie 300 L Glutathion-Sepharose-Perlen in ein frisches 15 ml-Rohr und waschen Sie die Perlen mit 10 ml eiskaltem PBS-Puffer.
      2. Zentrifugieren Sie bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet und die Waschlösung zu entsorgen.
    8. Das Lysat in die gewaschenen Perlen geben und bei 4 °C für 2 h brüten. Zentrifugieren bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet. Spülen Sie die Perlen in 10 ml eiskalte PBS 8x.
    9. Die Perlen mit 1 ml des Elutionspuffers (10 mM Glutathion in 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0) 6x, inkubieren bei 4 °C für 10 min vor jedem Elutionsschritt. Zentrifuge bei 750 x g und 4 °C für 1 min, um die Perlen zu pellet. Sammeln und poolen Sie die 6 Fraktionen.
    10. Übertragen Sie die eluierten Proteine in einen Zentrifugalfilter und konzentrieren Sie sich durch Zentrifugation bei 7.500 x g, um ein Endvolumen von 100-200 l zu erhalten.
  3. MOV10 Proteinextrakte aus HEK293T Zellen
    1. Die MOV10-Proteine in kultivierten HEK293T-Zellen exprimieren.
      1. Bereiten Sie MOV10-pRK5 Plasmid in einer Konzentration von >500 ng/L vor.
      2. Samen HEK293T Zellen in 15 cm Geschirr. Wenn die Zelldichte 70%-90% erreicht, ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch das frische Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.
      3. Für eine Transfektion 60 g MOV10-pRK5-Plasmid-DNA in 3 ml des reduzierten Serummediums verdünnen, dann 120 l des Transfection Enhancer Reagenz hinzufügen und gut mischen.
      4. In einem separaten Rohr 90 l des Transfektionsreagenzes mit 3 ml reduziertem Serummedium (ohne Penicillin-Streptomycin) verdünnen und gut vermischen.
      5. Fügen Sie die verdünnte DNA zu jeder Tube des verdünnten Transfektionsreagenzhinzuers hinzu. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
      6. Fügen Sie die Transfektionsmischung der Zellkultur hinzu, und fügen Sie Kulturzellen für 36-48 h hinzu.
    2. Nach 36-48 h, sammeln Zellen von jeder Platte in einem 50 ml Rohr. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Waschen Sie jedes Pellet mit 10 ml eiskaltem PBS und sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
    3. Setzen Sie das Pellet in 3 ml Zelllysepuffer mit vollständigem Ehylenidemintetraessigsäure (EDTA)-freiem Protease-Inhibitor-Cocktail aus. 30 min auf Eis bebrüten. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 x g und 4 °C für 20 min.
    4. Fügen Sie 100 l Anti-FLAG-Magnetperlen pro Schale der Zellen in einem 1,5 ml-Rohr hinzu.
    5. Waschen Sie die Magnetperlen 2x mit K150 Puffer (50 mM HEPES bei pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Die Magnetperlen in 1 ml eiskaltem K150-Puffer wieder aufhängen.
      2. Inkubieren Sie die Magnetperlen für 2 min bei 4 °C mit sanfter Rotation und pellet die Magnetperlen mit Hilfe eines Magneten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
    6. Fügen Sie die magnetischen Perlen zum Zelllysatüberstand ab Schritt 1.3.3 hinzu und brüten Sie bei 4 °C für 2 h.
    7. Waschen Sie die proteingebundenen Magnetperlen 3x mit K150 Puffer, dann 2x mit K150 mit 250 mM NaCl, dann 3x mit K150 Puffer als 1.3.5.
    8. Die Perlen in 300 l FLAG-Elutionspuffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 % Glycerin) wieder aufhängen, FLAG-Peptid zu einer Endkonzentration von 0,5 g/l hinzufügen und mit Perlen auf einem Rotator bei 4 °C für 1 h brüten , dann Pellet die magnetischen Perlen mit Hilfe eines Magneten.
    9. Sammeln Sie den Überstand, der die eluierten MOV10-Proteine enthält, bestimmen Sie die Konzentration und lagern Sie bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.

2. Nukleinsäurezubereitung

  1. Kaufen Sie DNA- und RNA-Oligonukleotide (Oligos) mit oder ohne Biotin-Etiketten aus einer geeigneten Quelle. Verdünnen Sie jeden Oligo in RNase-freiem ddH2O bis 20 m und halten Sie ihn bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Oligosequenzen von DNA/RNA-Substraten sind in Tabelle 2aufgeführt.
  2. Folgende Mischung für die doppelsträngige RNA (dsRNA) Glühreaktion für DEN MOV10 Helicase-Aktivitätstest vorbereiten: Mischen Sie 60 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-Ethan-Sulfonsäure (HEPES) bei pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 und RNase-frei ddH2 O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l.
  3. Anneale RNA-Oligos zu RNA-Duplex, indem sie eine Mischung aus dem biotin-markierten OberenStrang (2 M, Endkonzentration) und einem 1,5-fachen seines unbeschrifteten komplementären Bodenstrangs im Glühpuffer (Schritt 2.2) bei 95 °C für 5 min erhitzen und dann langsam in den Raum abkühlen Temperatur (RT).

3. In vitro biochemische Assays

  1. EMSA und enzymatische Reaktionen
    1. Für den MEIOB EMSA-Test 50 mM Tris HCl bei pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mM (oder andere relevante Konzentrationen wie in Abbildung 2 und Abbildung3) MEIOB-Protein und 10 nM biotin-markierte Oligonukleotide und ddH2 O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l. Inkubieren Sie bei RT für 30 min, und fügen Sie 5x Stop-Puffer (125 mM EDTA, 50% Glycerin) hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
    2. Richten Sie MEIOB-Nukleaseaktivitätsreaktionen wie in Schritt 3.1.1 beschrieben ein, jedoch ohne Zugabe von 10 mM EDTA.
    3. Für den MOV10 Helicase-Aktivitätstest 50 mM Tris-HCl bei pH 7,5 mischen, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/L RNase-Inhibitor, 10 nM biotin-markiertes RNA-Substrat, 2 mM Adenosintriphosphat (ATP), 100 nM RNA-Falle und 20 ng MOV10-Protein und ddH-C6 >2O in einem Endreaktionsvolumen von 20 l. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 10 min, 30 min und 60 min. Fügen Sie den 5x Stop-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
      HINWEIS: RNA-Falle, ein biotinunbeschriftetes Oligo mit Sequenz, Komplementarität zum markierten Oligo, die verhindert, dass die ungewickelte dsRNA wieder glüht.
  2. Polyacrylamid-Gel
    1. Waschen Sie die Gelplatten (16 cm x 16 cm) und 1,5 mm Kämme. Montieren Sie die Gelelektrophoreseeinheiten.
    2. Zur Herstellung eines 10% nativen Polyacrylamidgels 14 ml ddH2O, 1,25 ml 10x Tris-Borsäure-EDTA (TBE), 8,3 ml 30% Acrylamid, 1,25 ml 50% Glycerin, 187,5 l 10% frisch zubereitetes Ammoniumpersulfat (APS) und 12,5 ml Tetramethylethylendiamin (TEMED).
    3. Zur Herstellung eines 20% nativen Polyacrylamidgels 5,5 ml ddH2O, 1,25 ml 10x TBE, 1,25 ml 50% Glycerin, 16,7 ml 30% Acrylamid, 187,5 l mit 10 % APS und 12,5 l TEMED mischen.
    4. Die Acrylamidlösung sofort in das Gel geben und den Kamm einlegen. Lassen Sie die Mischung ca. 30 min polymerisieren.
  3. Gellauf
    1. Entfernen Sie den Kamm, füllen Sie die Tanks mit dem Elektrophorese-Laufpuffer (0,5x TBE).
    2. Spülen Sie die Probenbrunnen mit 0,5x TBE-Puffer, dann führen Sie das Gel bei 100 V auf Eis für 30 min vor. Ersetzen Sie den Laufpuffer durch frischen 0,5x TBE.
    3. Laden Sie 20-25 L Proben in jeden Bohrwert.
    4. Verwenden Sie ein 10% natives Acrylamid-Gel für den EMSA-Assay und ein 20% natives Acrylamid-Gel für die enzymatischen Assays. Elektrophorese bei 100 V im Eisbad laufen lassen, bis der Bromphenolblaumarker in das untere Viertel des Gels migriert ist.
  4. Zerlegen Sie die Gelplatten, trimmen Sie das Gel, indem Sie Ladebrunnen und ungenutzte Bahnen entfernen. Legen Sie das Gel in 0,5x TBE-Puffer.
  5. Schneiden Sie das Filterpapier und die Nylonmembran auf die Größe des Gels. Das saubere Filterpapier und die Nylonmembran vorbefeuchten.
  6. Montieren Sie den Stapel für die Übertragung.
    1. Legen Sie die vornasse Membran auf das vornasse Filterpapier.
    2. Legen Sie das Gel auf die Membran.
    3. Bedecken Sie das Gel mit einer weiteren Schicht vornassen Filterpapiers.
    4. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie eine saubere Pipette von der Mitte bis zum Rand rollen.
  7. Übertragen Sie die Proben vom Gel in einem halbtrockenen elektrophoretischen Gerät bei 90 mA für 20 min auf die Membran.
  8. Stoppen Sie den Transfer, und trocknen Sie dann die Membran auf einem neuen Filterpapier für 1 min.
  9. Vernetzen Sie die Proben, indem Sie die Membran bei 120 mJ/cm2 für 45-60 s in einem UV-Licht-Vernetzenmiten mit 254 nm Glühbirnen (Auto-Crosslink-Funktion) bestrahlen. Die Membran bei RT 30 min an der Luft trocknen.
  10. Chemilumineszenz-Erkennung
    1. Protokoll 1: Verwenden Sie ein Standardvolumen des kommerziellen Chemilumineszenz-Nukleinsäuredetektionskits.
      1. Fügen Sie 20 ml Sperrpuffer in die Membran und inkubieren für 15-30 min mit sanftem Schütteln auf einem Rotator bei 20-25 Rpm.
      2. Bereiten Sie konjugierende/blockierende Pufferlösung vor, indem Sie 66,7 l stabilisiertes Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat zu 20 ml Blockierpuffer hinzufügen.
      3. Entfernen Sie den Sperrpuffer vorsichtig und ersetzen Sie ihn durch einen Konjugat-/Blockierungspuffer. 15 min auf einem Rotator bei 20-25 Rpm inkubieren.
      4. Waschen Sie die Membran 4x mit Schütteln bei 40-45 Rpm für jeweils 5 min.
      5. Fügen Sie der Membran 30 ml Substratausgleichspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Membran für 5 min mit Schütteln bei 20-25 Rpm.
      6. Bereiten Sie substratverarbeitende Lösung durch Zugabe von 6 ml L L L L L L L L L L L L L stabiler Peroxidlösung vor. Vermeiden Sie Licht.
      7. Bedecken Sie die gesamte Oberfläche der Membran mit Substratarbeitslösung und brüten Sie für 5 min.
      8. Scannen Sie die Membran in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem für 1-3 s.
    2. Protokoll 2: Verwenden Sie 2x verdünnte kommerzielle Chemilumineszenz Nukleinsäure-Detektionkit und folgen Sie den Schritten 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. Protokoll 3: Verwenden Sie selbsthergestellte Reagenzien6.
      1. Vorbereiten des Sperrpuffers: Mischen Sie 0,1 M Tris-HCl bei pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2und 3% Rinderserumalbumin Fraction V. AP 7.5 Puffer: Mix 0.1 M Tris-HCl bei pH 7,5, 0,1 M NaCl und 2 mM MgCl2. AP 9.5 Puffer: Mix 0.1 M Tris-HCl bei pH 9,5, 0,1 M NaCl und 50 mM MgCl2. TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0, 1 mM EDTA bei pH 8,0 mischen.
      2. Die Membran im Sperrpuffer bei 30 °C für 1 h einweichen.
      3. Fügen Sie 8,5 l Streptavidin alkalische Phosphatase zu 10 ml AP 7.5 Puffer hinzu. Schütteln Sie die Membran in dieser Lösung bei RT 10 min. Dann waschen Sie die Membran 2x in 15 ml AP 7.5 Puffer für 10 min.
      4. Waschen Sie die Membran noch einmal in 20 ml AP 9.5 Puffer für 10 min. Fügen Sie 20 ml TE Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
      5. Fügen Sie 7,5 ml Entwicklungslösung auf die Membran, und scannen Sie die Membran in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem für 1-3 s.

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Ergebnisse

Die Proteinstruktur von MEIOB und die in dieser Studie verwendeten Expressionskonstrukte sind in Abbildung 1Adargestellt. OB-Falten in MEIOB sind kompakte fassartige Strukturen, die einsträngige Nukleinsäuren erkennen und mit ihnen interagieren können. Eine der OB-Domänen (aa 136-307, Konstrukt A) bindet einsträngige DNA (ssDNA), das abgeschnittene Protein (aa 136-178 Schnitte, Konstrukt C) und die punktmutierte Form (R235A Mutation, Konstrukt E) von MEIOB haben keine DNA-bi...

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Diskussion

Die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen ist entscheidend für unser Verständnis molekularer Mechanismen, die verschiedenen biologischen Prozessen zugrunde liegen. Zum Beispiel ist MEIOB ein Testis-spezifisches Protein, das für Meiose und Fruchtbarkeit bei Säugetieren25,26,27unerlässlich ist. MEIOB enthält eine OB-Domäne, die an einsträngige DNA bindet und eine 3' bis 5' Exonukleaseaktivität26<...

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Offenlegungen

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Danksagungen

Wir danken P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) für hilfreiche Bearbeitungen und Diskussionen. Wir danken auch Sigrid Eckardt für die Sprachbearbeitung. K. Z. wurde von national Key R&D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) und national Natural Science Foundation of China (31771653) unterstützt. L. Y. wurde von der National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) und dem Innovative and Entrepreneurial Program der Provinz Jiangsu unterstützt. J. N. wurde vom Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499) unterstützt. M. L. wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31771588) und des 1000 Youth Talent Plan unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equipment
CentrifugeEppendorf, Deutschland5242R
Chemilumineszierendes BildgebungssystemTanon, China5200
Digital SoniferBranson, USABBV12081048A450 Watt; 50/60 HZ
Halbtrockenes elektrophoretisches LöschblattHoefer, USATE77XP
Rohr-Revolver Crystal, USA3406051
UV-Licht-VernetzerUVP, USACL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Milipore, USAUFC8010964 ml/10 K
NylonmembranThermo Scientific, USATG263940A
TC-behandelte KulturschaleCorning, USA430167100 mm 
TC-behandelte KulturschaleCorning, USA430597150 mm 
MikroröhrchenAXYGEN, USAMCT-150-C1,5 mL 
RöhrchenCorning, USA43079115 mL
Reagenzien 
AmpicillinSunShine Bio, China8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetische KügelchenSigma, USAM8823
ATPThermo Scientific, USA591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development KitBeyotime, ChinaC3206
CelLyticTM M Zelllyse Reagenz Sigma, USA107M4071V
ClonExpress II Ein-Schritt-Klonierungskit Vazyme, ChinaC112
Chemilumineszenz-Nukleinsäure-NachweiskitThermo Scientific, USAT1269950
dNTPSigma-Aldrich, USADNTP100-1KT
DMEMGibco, USA10569044
DPBS PufferGibco, USA14190-136
EDTAInvitrogen, USAAM9260G0,5 M
EDTA-freier Proteasehemmer-CocktailRoche, USA04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit Vazyme, China 
DC202
FastPure Gel DNA Extraktion Mini KitVazyme, ChinaDC301-01
FBSGibco, USA10437028
FLAG Peptid Sigma, USAF4799
GlycerolSigma, USASHBK3676
GST Bulk KitGE Healthcare, USA27-4570-01
HEPES PufferSigma, USASLBZ28371 M 
IPTGThermo Scientific, USA34060
KoAcSangon Biotech, China127-08-02
Lipofectamin 3000 TransfektionsreagenzThermo Scientific, USAL3000001
MgCl2Invitrogen, USAAM9530G1 M
NaClInvitrogen, USAAM9759
 		5 Mio. M 
NP-40Amresco, USAM158-500ML
Opti-MEM MediumGibco, USA31985062
PBSGibco, USA10010023PH 7.4
RNase InhibitorPromega, USAN251B
Streptavidin alkalische PhosphatasePromega, USAV5591
TBE Invitrogen, USA15581044
Tris-HCI Puffer Invitrogen, USA155670271 M, PH 7,4
Tris-HCI Puffer Invitrogen, USA155680251 M, PH 8,0
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560

Referenzen

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