Method Article

Integrierte Zellmanipulationsplattform gekoppelt mit der Single-Sonde zur Massenspektrometrie-Analyse von Medikamenten und Metaboliten in einzelförmigen Suspensionszellen

DOI:

10.3791/59875

⸱

June 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für den Einsatz in Verbindung mit einem Einzelsonden-Massenspektrometrie-Setup wird eine integrierte Zellmanipulationsplattform für die Online-Analyse einzelner Suspensionszellen unter Umgebungsbedingungen entwickelt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) ermöglicht eine sensible Detektion und genaue Analyse großer Bereiche zellulärer Arten auf der Ebene der einzelnen Zellen. Die Single-Sonde, eine Mikroskalen-Probenahme- und Ionisationsvorrichtung, kann mit einem Massenspektrometer für die online-schnelle SCMS-Analyse von zellulären Bestandteilen unter Umgebungsbedingungen gekoppelt werden. Zuvor wurde die Single-Sonden-SCMS-Technik hauptsächlich verwendet, um Zellen zu messen, die auf einem Substrat immobilisiert wurden, wodurch die Zelltypen für Studien eingeschränkt wurden. In der aktuellen Studie wurde die Single-Sonden-SCMS-Technologie in ein Zellmanipulationssystem integriert, das typischerweise für die In-vitro-Fertilisation verwendet wird. Diese integrierte Zellmanipulations- und Analyseplattform nutzt eine Zellauswahlsonde, um identifizierte einzelne schwimmende Zellen zu erfassen und die Zellen zur Mikroskalenlyse an die Single-Sondenspitze zu übertragen, gefolgt von einer sofortigen Massenspektrometrieanalyse. Dieser Erfassungs- und Übertragungsprozess entfernt die Zellen vor der Analyse aus der umgebenden Lösung, wodurch die Einführung von Matrixmolekülen in die Massenspektrometrieanalyse minimiert wird. Dieses integrierte Setup ist in der Lage, gezielte patientenisolierte Zellen in Körperflüssigkeitsproben (z. B. Urin, Blut, Speichel usw.) zu analysieren und mögliche Anwendungen der SCMS-Analyse in der Humanmedizin und Krankheitsbiologie zu ermöglichen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Humanbiologie, insbesondere die Krankheitsbiologie, wird zunehmend als das Ergebnis von Aktivitäten auf der Ebene einzelner Zellen verstanden, aber die traditionellen Analysemethoden, wie die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LCMS), werden in der Regel zur Analyse von Proben, die aus Zellpopulationen hergestellt werden, während die erfassten molekularen Informationen die chemischen Prozesse auf der Ebene der einzelnen Zellen nicht genau darstellen können. Diese Standard-, traditionellen Methoden sind nicht in der Lage, die Auswirkungen der zellulären Heterogenität auf eine analytische Messung zu erkennen, und der Prozess der Zerstörung und Mischen der Zellen, um das Lysat vorzubereiten, führt potenziell zur Veränderung oder zum Verlust von zellulären Komponenten1,2. Diese Einschränkungen traditioneller Methoden sind besonders wichtig bei der Analyse von Patientenzellen, bei denen die erhaltenen Proben eine komplexe Mischung aus vielen verschiedenen Zelltypen enthalten können. Um diese Mängel zu beheben, werden einzellige molekulare Analysemethoden, einschließlich Einzelzell-Massenspektrometrie-Methoden (SCMS), zunehmend entwickelt und auf die Bioanalyse angewendet, insbesondere von zellulären Metaboliten und niedermolekularen Biomoleküle3,4.

Die ersten sCMS-Techniken, die entwickelt wurden, verwendeten vakuumbasierte Techniken, um die Analysen unter nicht-Umgebungsbedingungen durchzuführen2,5,6,7,8,9, 10,11. Nicht-Umgebungs-SCMS-Techniken sind in der Lage, zelluläre Lipide und Metaboliten zu analysieren, erfordern jedoch eine Probenvorbehandlung unter künstlichen Bedingungen und sind daher nicht für die Echtzeitanalyse geeignet. Der Probenvorbereitungsprozess für die Nicht-Umgebungsanalyse umfasst die Zugabe von Matrixkomponenten, und diese Zubereitung kann zelluläre Komponenten aus ihrer natürlichen Umgebung verändern12. Daher werden MS-Techniken (Ambient Mass Spectrometry), die für die Samplingumgebung kein Vakuum erfordern, zur Analyse von Zellen in einer nahezu nativen Umgebung verwendet. Das Nicht-Vakuum-Umfeld ermöglicht die Vielseitigkeit im experimentellen Design; Kameras können hinzugefügt werden, um den zellulären Prozess zu überwachen und weichere Ionisationstechniken können mit Trenntechniken kombiniert werden, um bessere Informationen aus jedem Einzelzellexperimentzuerhalten 4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

Die Single-Probe-SCMS-Methode ist eine Umgebungstechnik, die lebende, Säugetierkrebszelllinien in einer nahezu nativen Umgebung analysiert21,43,44,45,46. Darüber hinaus wurde das Einsondengerät für andere Massenspektrometrieanwendungen eingesetzt, einschließlich der Analyse extrazellulärer Moleküle in mehrzelligen Sphäroiden und ms-Bildgebung von Geweben47,48,49 ,50,51,52. Da jedoch eine Zellimmobilisierung auf Substraten für diese Methode erforderlich ist, können Suspensionszellen mit dieser Technik nicht direkt analysiert werden3,53. Daher konnte das Single-Sonden-SCMS-System nicht direkt zur Probe von nicht haftenden Einzelzellen verwendet werden, wie z. B. nicht haftenden Zelllinien oder Suspensionszellen, die aus dem Blut eines Patienten oder anderen Körperflüssigkeiten isoliert sind54. In dieser Arbeit wird eine integrierte Zellmanipulationsplattform (ICMP) mit der Single-Probe-SCMS-Technik zur Online-Analyse von lebenden Suspensionszellen mit minimaler Probenvorbereitung gekoppelt (Abbildung 1)46. Das ICMP besteht aus einem invertierten Mikroskop zur Überwachung der Zellauswahl, einer Glaszellen-Selektionssonde, einem Mikroinjektor zur Erfassung einzelner schwimmender Zellen, einer beheizten Platte zur Aufrechterhaltung der Zelltemperatur, zwei Zellmanipulationssystemen zur Steuerung räumlicher Bewegungen sowohl der Glaszellen-Selektionssonde als auch der Einzelsonde sowie eines digitalen Mikroskops zur Beobachtung der Zellübertragung von der Zellauswahl-Sondenspitze zur Single-Sondenspitze. Die Herstellung der Single-Probe ist in früheren Veröffentlichungen detailliert und wird hier nicht behandelt21,48. Das ICMP/Single-Sonden-System ist an ein hochauflösendes Massenspektrometer gekoppelt. Dieses integrierte Setup ermöglicht die Probenahme identifizierter Einzelzellen aus komplexen biologischen Proben mit minimalen Effekten von Matrixmolekülen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Glaszellen-Auswahlsonde Herstellung

  1. Verwandeln Sie Einbohrglasschläuche in eine verjüngte Sonde mit scharfer Spitze.
    1. Legen Sie ein Einbohrglasrohr (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) in die Klemmen eines vertikalen Pipettenhalters, zentrieren Sie das Glas in Bezug auf die Heizspule und ziehen Sie es fest, um das Rohr an Ort und Stelle zu befestigen. Die Heizspule besteht aus einem 18-Spur-Nickel-Chrom-Widerstandsdraht (ca. 60 mm Länge), der 2,5-mal um einen Metallstab (Durchmesser = 3,90 mm) gewickelt ist.
    2. Stellen Sie die Glasschläuche mit Temperaturprogramm 19.5 (Herstellereinheit) ein. Dieser Parameter kann für ein bestimmtes Instrument geändert werden.
    3. Stellen Sie den Magnetkolben auf 4 (Herstellereinheit) ein. Dieser Parameter kann für ein bestimmtes Instrument geändert werden.
    4. Lösen Sie den Magneten aus, um den Glasschlauch zu ziehen. In diesem Schritt werden zwei Sonden erstellt, die an der Spitze verschmolzen sind.
    5. Verwenden Sie eine Pinzette, um 1 mm von der Spitze jeder Sonde zu schneiden, wodurch an der Sondenspitze eine Öffnung von 10 m Durchmesser entsteht.
  2. Biegen Sie die Glassonde für eine einfache Kopplung an das ICMP/Single-Sonden-SCMS-Setup.
    1. Stellen Sie eine gezogene Glassonde in die Mikroschmiede ein und positionieren Sie die Spitze 3 mm über dem Platin-Heizdraht.
    2. Drehen Sie die Wärme auf dem Platindraht auf 30% der maximalen Temperatur.
    3. Biegen Sie die Sonde um 45° von der ursprünglichen Position ab (Abbildung 2).

2. Integrierte Zellmanipulationsplattform-Baugruppe

  1. Legen Sie das invertierte Mikroskop, den Mikroinjektor und zwei Zellmanipulationssysteme auf einen motorisierten Tisch, um sie einfach mit dem Massenspektrometer zu koppeln.
    1. Ändern Sie eines der Zellmanipulationssysteme, um eine Einzelsonde aufzunehmen, indem Sie das Ende durch eine Armklemme ersetzen.
    2. Verwenden Sie eine Plastikspritze mit einer Nadel, um den Mikroinjektor mit Mineralöl zu füllen. Vermeiden Sie Blasen in den Schläuchen, da dies das Absaugen beeinträchtigt.
    3. Ersetzen Sie den Bühneneinsatz des invertierten Mikroskops durch die beheizte Platte. Stellen Sie die beheizte Platte vor der Analyse auf 37 °C ein.
  2. Richten Sie das Glaszellenauswahlgerät ein.
    1. Setzen Sie die Glaszellen-Auswahlsonde in den Metallhalter des Mikroinjektors ein, indem Sie die lange (nicht gebogene) Seite in den Kapillarhalter legen und die Schraube anziehen, um die Sonde an Ort und Stelle zu befestigen. Positionieren Sie den Winkel der Sondenspitze parallel zur beheizten Platte.
      VORSICHT: Die Glassonde ist sehr scharf und zerbrechlich und bricht leicht. Schützen Sie Ihre Augen und seien Sie besonders vorsichtig, während Sie die Sonde in den Mikroinjektor einsetzen.
    2. Sichern Sie den Metallhalter des Mikroinjektors in das Zellmanipulationssystem. Positionieren Sie die Sondenspitze in der Mitte des invertierten Mikroskoplichts.

3. Erstellen Sie ein verlängertes Ionentransferrohr für den Massenspektrometer-Einlass

  1. Verwenden Sie einen Metallschneider, um ein Stück Edelstahlrohre (OD: 0,0625 (1/16) in, ID: 0,021 in) mit einer Länge von 250 mm zu schneiden.
  2. Messen Sie 135 mm vom Ende und legen Sie ein Metall verwildert so 135 mm wird der Atmosphäre ausgesetzt werden und 115 mm innerhalb des Massenspektrometers sein. Sichern Sie das Wild mit zwei Schraubenschlüsseln, um es festzuziehen.

4. Koppeln Sie den ICMP mit einem Single-Sonden-Setup

  1. Befestigen Sie den Glasschlitten mit der Einzelsonde in der Armklemme des Zellmanipulationssystems.
    ANMERKUNG: Einzelsonden werden nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll48 mit zwei geringfügigen Änderungen in der aktuellen Studie hergestellt: Der Nano-ESI-Emitter wird für die einfache Kopplung an das Massenspektrometer länger hergestellt, und die Einzelsonden werden an das Glas geklebt Seite auf der rechten Seite, um die räumliche Bewegung der Glaszellenauswahlvorrichtung nicht zu stören (Abbildung 2).
  2. Verbinden Sie die lösungsmittelliefernde Kapillare mit einer leitfähigen Verbindung, indem Sie die Kapillare in die Hülse (1/16 x .005 in) der Kunststoffferrule legen und die Armatur mit dem Finger anziehen.
    1. Schließen Sie die andere Seite der leitfähigen Verbindung an eine Kapillare an (ID: 40 m, OD: 150 m), die mit einer Spritze verbunden ist, die das Probenahmelösungsmittel enthält, indem Sie die Kapillare in die Hülse (1/32 x 007 Zoll) legen und die Armatur anziehen. Verwenden Sie Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure als Probenahmelösungsmittel in diesen Experimenten.
      HINWEIS: Das Probenahmelösungsmittel ist flexibel, sollte aber in erster Linie Acetonitril (oder Acetonitril mit Ameisensäure für eine bessere Ionisation) für eine schnelle Mikrozelllyse enthalten.
    2. Befestigen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe auf dem Massenspektrometer.
    3. Legen Sie das Ionisationsspannungskabel auf einen Kupferdraht, der an der leitfähigen Vereinigung befestigt ist.
  3. Positionieren Sie den Nano-ESI-Emitter 1 mm an der Öffnung des verlängerten Ionenübertragungsrohrs.
    1. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die räumlichen Bewegungen der Single-Sonde zu steuern und den Nano-ESI-Emitter zentral vor den erweiterten Ionentransferschläuchen zu positionieren.

5. Ausgesetzte Zellprobenvorbereitung

  1. Am Tag vor der Analyse (18-24 h) werden Zellen zum Testen in einem Zellkulturkolben (T25) ausgesät. K562 humane myeloische Leukämiezellen werden als Modelle in dieser Studie verwendet.
    1. 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS) und Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% synthetischem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C für 30 min.
    2. Samen 1 x 106 Zellen in einem Gesamtvolumen von 10 ml durch Kombination von Zellen mit warmem Medium. Verwenden Sie im Allgemeinen eine 10-ml-Pipette, um 8 ml RPMI-Medium in einen Zellkulturkolben zu legen. Verwenden Sie dann eine 2 ml Pipette, um 2 ml konfluente K562-Zellen das Medium für 1 x 106 Zellen zu setzen.
    3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 bis zur Analyse.
  2. Bereiten Sie Zellen für die Analyse vor.
    1. Pipettenzellen aus der Zellkultur in ein 15-ml-Zentrifugenrohr.
    2. Spin Zellen bei 400 x g und 37 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.
    3. Resuspend Zellen in 4 ml RPMI-Medium, das die Wirkstoffverbindung in der gewünschten Behandlungskonzentration enthält.
      ANMERKUNG: Zur Analyse von Kontrollzellen setzen Sie die Zellen in 4 ml RPMI-Medium wieder aus und fahren Sie mit Schritt 6fort.
    4. Inkubieren Sie die Zellen für die Dauer der Behandlungszeitbei 37 °C und 5% CO2 .
    5. Spin Zellen nach unten bei 400 x g und 37 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.
    6. Die Zellen werden in 10 ml PBS und Zentrifuge bei 400 x g und 37 °C für 5 min resuspendiert. Nach dem Spinnen, entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal, um den Nachweis von Medikamenten aus extrazellulären Bestandteilen zu minimieren.
    7. Resuspend Zellen in 4 ml PBS für die Analyse.

6. Führen Sie SCMS-Messungen mit dem ICMP/Single-Sonden-Setup durch

  1. Passen Sie die Parameter für das Massenspektrometer für das Experiment an.
    1. Wählen Sie unter der Überschrift Scanmodus der Instrumentensoftware scandefinieren aus. Verwenden Sie eine Auflösung von 60.000 m/m bei m/z 400, 1 Mikroscan, 100 ms maximale Einspritzzeit und automatische Verstärkungskontrolle (AGC) auf. Für die Experimente wurde ein Massenbereich (m/z) von 100-1000 genutzt. Parameter können basierend auf dem Instrumentenmodell geändert werden.
    2. Wählen Sie unter Spritzenpumpeeine Durchflussrate von 150 nL/min aus. Die Durchflussrate muss für jedes Experiment optimiert werden.
    3. Wählen Sie NSI-Quelle und wenden Sie eine Spannung von 4,5 kV an. Dieser Parameter muss auch für jedes Experiment optimiert werden.
  2. Schalten Sie das invertierte Mikroskop ein (mit 40-facher Vergrößerung, die sowohl für die obere Platte als auch für die untere Linse ausgewählt ist) und schließen Sie es an den USB-Anschluss eines Laptops an, um Live-Video-Feeds aufzunehmen. Schalten Sie die beheizte Platte ein und stellen Sie sie auf 37 °C ein.
  3. Wechseln Sie auf dem Computer zur Registerkarte Daten erfassen, und wählen Sie Kontinuierlich unter Zeit erfassen aus.
  4. Bereiten Sie das Beispiel für die Analyse vor.
    1. Pipette 2-3 ml Probe in den Deckel einer kleinen Petrischale (35 mm x 12 mm).
    2. 6.4.2 Positionieren Sie die Probe in der Mitte des Lichts vom invertierten Mikroskop auf der Oberseite der beheizten Platte.
  5. Bereiten Sie die Glaszellenauswahlsonde für die Analyse vor. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Sonde so zu bewegen, dass ihre Spitze unter dem invertierten Mikroskop in der gleichen Ebene wie die Zellen fokussiert ist.
  6. Wählen Sie eine einzelne Zelle für die Analyse aus.
    1. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zellesauswahl-Sondenspitze in eine Zielzelle zu verschieben. Dieser Prozess wird mit dem invertierten Mikroskop überwacht.
      HINWEIS: Wenn die Spitze der Zellauswahlsonde nicht in derselben Ebene wie die Zellen fokussiert werden kann, ist es möglich, dass der gebogene Teil der Sonde nicht entsprechend abgewinkelt ist. Passen Sie die Position der Zellselektionssonde an, bis beide Sondenspitzen zusammen mit Zellen unter dem Mikroskop fokussiert werden können.
    2. Drehen Sie den Griff des Mikroinjektors vorsichtig, um die Position des Mineralöls im Inneren des Schlauches anzupassen. Der Mikroinjektor sorgt für eine schonende Absaugung, um die Zielzelle an der Zellauswahls-Sondenspitze zu sichern.
      HINWEIS: Wenn die Zelle nicht von der Zellauswahlsonde durch die Saugkraft erfasst werden kann, überprüfen Sie die Zellauswahlsonde, um sicherzustellen, dass sie vollständig in den Kapillarhalter eingeführt wird. Prüfen Sie außerdem die Mineralölgehalte im Mikroinjektor und in den Schläuchen, und vertreiben Sie Luft, falls vorhanden.
    3. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zelle an der Zellauswahl-Sondenspitze zur Single-Sondenspitze zu bewegen, indem Sie ein digitales Mikroskop verwenden, das sich auf die Einsondenspitze konzentriert, um diesen Prozess zu überwachen. Beim Berühren induziert ein kleines Acetonitril-Tröpfchen an der Single-Sonden-Spitze eine schnelle Lyse der Zelle, und dann wird das Zelllysat sofort für die Online-MS-Analyse ionisiert.
      HINWEIS: Da die ausgewählte Zelle durch eine sanfte Absaugung an der Zellauswahl-Sondenspitze befestigt ist, kann sie während ihrer Übertragung an die Single-Sondenspitze möglicherweise abgetrennt werden. Wenn daher Ionensignale typischer zellulärer Lipide (siehe repräsentative Ergebnisse unten) nicht innerhalb von 5 s beobachtet werden, ist es möglich, dass die Zelle ungebunden wurde und die Auswahl einer anderen Zelle erforderlich ist.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zunächst werden unbehandelte K562-Zellen verwendet, um die experimentelle Methode zu etablieren. In einem typischen SCMS-Experiment können offensichtliche Veränderungen von Massenspektren beobachtet werden, wenn eine Zelle übertragen wird, während der Detektion von Zellinhalten und nach Abschluss der Messung (Abbildung S1). Drei häufige zelluläre Lipidspitzen (Phosphatidylcholin, PC), einschließlich PC(34:4) (m/z 754.536), PC(36:4) (m/z 782.567) und PC(38:5) (m/z 808.583), werden überwacht, um sicherzustellen, dass die Zelle erfolgreich übertragen und zellular Inhalt erkannt werden (Abbildung S2)21,43,46,55,56. Wenn Lipidspitzen nicht innerhalb von 5 s zu sehen sind, wird der Mineralölgehalt im Mikroinjektor verändert, um die Absaugung der Zelle an der Zellselektionssonde zu reduzieren; Es ist Vorsicht geboten, damit kein Mineralöl aus der Zellselektionssonde herausgeschoben wird. Die Identität vieler PCs im Massenbereich von m/z 750-850 wird mit MS/MS an unbehandelten Zelllysatproben bestätigt (Abbildung 3, Abbildung S2, Tabelle 1)46.

K562-Zellen werden auch mit verschiedenen Wirkstoffverbindungen behandelt, um die Vielseitigkeit der Methode zu erweitern. K562-Zellen werden mit Gemcitabin (1 m) und Taxol (1 m) für 1 h und OSW-1 (100 nM, 1 m) für 4 h bzw. 2 h inkubiert. Die Zellen werden dann mit PBS gewaschen, um den Nachweis von Wirkstoffverbindungen aus extrazellulärem Gehalt zu minimieren. Der Beitrag von Matrix (z.B. Ionen aus Zellkulturmedium, PBS und Lösungsmittel) zu Massenspektren zellulärer Inhalte kann durch Datensubtraktion aufgrund ihrer deutlich unterschiedlichen Ionensignale eliminiert werden (Abbildung S3). Alle drei Wirkstoffverbindungen werden mit dem ICMP/Single-Probe MS-Setup nachgewiesen (Abbildung S4)46. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode verwendet werden kann, um intrazelluläre Lipide, Medikamente, und Metaboliten auf der Einzelzellebene von Zellen in Lösung in einer nah-nativen Umgebung zu studieren.

figure-results-1
Abbildung 1. Experimentelles Setup für MS-Experimente mit einzelsuspensionszelle. (A) Die integrierte Zellmanipulationsplattform (ICMP) gekoppelt mit einem Massenspektrometer. (B) Schematisch für die Analyse von suspendierten Zellen. (C) Experimentelle Ansicht der K562-Zellen, die mit dem Zellauswahlpunkt ausgewählt werden sollen. Nachdruck mit Genehmigung von Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2. Fotos einer modifizierten Einzelsonde und einer Zellselektionssonde, die für MS-Experimente mit einzelsuspensionszellen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3. Vergrößertes Massenspektrum aus einer einzelnen Zelle, die die repräsentative Art zeigt (m/z 750-850). Chemische Strukturen werden mittels MS/MS-Analyse bestätigt (Abbildung S1). Nachdruck mit Genehmigung von Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Medikament Molekül*m/zMassenfehler (ppm)
[Gemcitabin + H] + 264.07611.32 Uhr
[Taxol + Na] + 876.3182,74
[OSW-1 + Na] + 895.4450,89
Zelluläre Lipide
[PC(34:4) + H] + 754.5353,71
[PC(34:3) + H] + 756.5513,44
[PC(34:2) + H] + 758.5690,66
[PC(36:5) + H] + 780,5513,07
[PC(36:4) + H] + 782.5682.17
[PC(36:3) + H] + 784.5850,64
[PC(38:7) + H] + 804.5514.1
[PC(38:6) + H] + 806.5672,48
[PC(38:5) + H] + 808.5832,72
[PC(38:4) + H] + 810.6010
[PC(40:7) + H] + 832.5833.12

Tabelle 1. Identifizierte zelluläre Komponenten mit dem ICMP/Single-Probe-Setup. Der Nachweis aller Wirkstoffverbindungen wurde durch den Vergleich der MS/MS-Ergebnisse mit standard-Verbindung bestätigt.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die integrierte Zellmanipulations- und Analyseplattform wurde entwickelt, um die Vielseitigkeit der Single-Probe-MS-Methode zu erweitern und eine onlineschnelle Analyse nicht-anhaftender Zellen in einer nahezu nativen Umgebung zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Technik ist, dass eine minimale Probenvorbereitung erforderlich ist, so dass die Zellen unter Bedingungen analysiert werden, die ihren Standardzustand imitieren. Insbesondere können einzelne von Interesse belangliche Zellen visuell identifiziert und ausgewählt werden, wodurch der Einfluss des Matrixeffekts auf die Effizienz der MS-Ionisation minimiert wird, während die Zellen in ihrer natürlichen Umgebung erhalten bleiben, so dass die Ergebnisse repräsentativer eativ sind. Status (Abbildung S3). Diese Technik kann potenziell verwendet werden, um Patientenzellen zu untersuchen, die in Biofluiden in zukünftigen Studien suspendiert sind. Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist die flexible Auswahl des Probenahmelösungsmittels. Es ist wichtig, Acetonitril als Hauptprobelösel einzubeziehen, damit eine mikroskalige Lyse schnell auftreten kann. Potenziell können interne Standards (z. B. isotopisch markierte Wirkstoffverbindungen) in das Probenahmelösungsmittel zur Quantifizierung von Molekülen von Interesse (z. B. Wirkstoffmoleküle) aus einzelnen Zellen aufgenommen werden, einschließlich dieser, die eine Schlüsselrolle bei der Revolutionierung spielen können. Personalisierung von Arzneimittelbehandlungen in der Zukunft54.

Obwohl dieses integrierte System bequem verwendet werden kann, um große Zellbereiche zu analysieren, ist eine Einschränkung der Methode, dass weder die Einzelsonde noch die Zellauswahlsonde kommerziell verfügbar ist; die Notwendigkeit der Optimierung vieler Parameter (z. B. Durchfluss, Spannung, Länge zwischen Nano-ESI-Emitter und Ionenübertragungsschläuchen usw.) vor jedem Experiment. Darüber hinaus kann die Umgebungsstörung (z. B. Luftstrom) aufgrund der Geringen der Einsonden- und Zellselektionssonde zu Schwierigkeiten bei der Herstellung einer Verbindung zwischen den beiden Sonden führen. Eine kurzfristige Lösung ist die Biegung der Zellauswahlsonde in der Nähe des Endes, um die Länge der Verjüngung zu minimieren. Zukünftige Arbeiten umfassen die Entwicklung eines Gehäuses, um die kritischen Teile des Setups einzuschließen, um Umweltauswirkungen zu minimieren. Aufgrund der begrenzten Menge an Zellinhalten und der kurzen Erfassungszeit (ca. 2-3 s) aus einer Zelle kann die MS/MS-Analyse nur für relativ reichlich eitel Arten durchgeführt werden. Andere Faktoren, die die Erkennungsempfindlichkeit beeinflussen, sind die unterdrückte Ionisationseffizienz durch die Einführung der Matrix zusammen mit der Zelle und potenziellen Ionenverlust durch die verlängerten Ionentransferschläuche.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Naga Rama Kothapalli für ihre Arbeit bei der Entwicklung von Probenvorbereitungen sowohl für Suspensionszellen als auch für Zelllysatexperimente. Darüber hinaus danken die Autoren dem NIH (R01GM116116 und R21CA204706) für die Finanzierung.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetontrilMillipore Co.AX0145-1Lösungsmittel für die Probenahme
CellTram VarioEppendorf6221ICMP
Kupferdrahtstores.ebay.com/jewelerheavenTotweich, rund, 20 Gauge, 25 ftLeitfähiges Verbindungssetup
Digitales StereomikroskopShenzhen D& F Co.Supereyes T004Analyse
Einweg-Mikropipette, 1-5 & Mikro; LRochester Scientific5065Herstellung von Quarzschläuchen
doppelter Bohrung, 1.120"x0.005"x12"Friedrich & Ltd. Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QEinzelsondenfertigung
EpoxidharzDevconTeile-Nr. 20945Einzelsondenfertigung
Eppendorf ZellmanipulationssystemEppendorfTransferman NK517800397-U.R.icmp
Externe MutterVALCO*CHEMINERTEN1Herstellung von Ionentransferröhrchen
AmeisensäureSigma-Aldrich399388-500MLProbenahmelösungsmittel
Kapillare aus Quarzglas, ID: 40 µ m, AD: 100 µ mPolymicro TechnologiesTSP040105Herstellung mit einer Sonde, Aufbau leitfähiger Verbindungen
Kapillare aus Quarzglas, ID: 50 & Mikro; m, OD: 150 µ mPolymicro Technologies1068150015Konduktiver Verbindungsaufbau
HyClone Synthetisches fötales Kälberserum (FBS)Fischer SciSH3006603
IDEX Gesundheit & Gesundheit Science LLCM-520Einrichtung einer leitfähigen Verbindung
LaserabzieherSutter Instrument Co.Modell P-2000LED-UV-Lampe für die Herstellung mit einer Sonde
Foshan Liang Ya Dental EquipmentLY-C240
LTQ Orbitrap MassenspektrometerThermo ScientificLTQ Orbitrap XLAnalyse
MicroforgeNarishige, Co.MF-9Herstellung von Sonden zur Zellauswahl
MicrounionIDEX Health & Science LLCM-539 PEEK-Schlauchmit leitfähiger Verbindung
, 1/32 x 0,005 x 5 FußIDEX Gesundheit & Gesundheit Science LLC1576für leitfähige Verbindungen
, 1/32 x 0,007 x 5 FußIDEX Gesundheit & Gesundheit Science LLC1577Konduktiver Verbindungsaufbau
Penicillin/StreptomycinGibco/Life Technologies15140-122Zellkultur-Petrischale
, 35x10 mmVWR25382-334Probenvorbereitung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)VWR0780-50LZellkultur
PlatindrahtNarishige, Co.Modell PT-AMicroforge
NetzteilNikonPSM-2120ICMP
RPMI, 1X mit Corning GlutagroCorning10-104-CVZellkultur
Single-Bore RöhrchenBoralex5065Herstellung von Zellauswahlsonden
Aderendhülsen aus Edelstahl, für 1/16" ODIDEX Gesundheit & Gesundheit Science LLCVHP-200-01xHerstellung von Ionentransferrohren
Edelstahlrohre, 1/32x 205 & Mikro; m x30 cmIDEX Gesundheit & Gesundheit Science LLCU-1128Ionentransferrohr Herstellung
Spritze, 250 & Mikro; LHamilton1725LTN250ULProbenahmespritze
T25 KolbenCellStar690160Zellkultur
Thermo LTQ XL Ionenquellen-SchnittstellenflanschNeues ObjektivPB5500Analyse
ThermoPlateTokaiHit55R30NICMP
TrypLE ExpressGibco12605-010Zellkultur
Röhrchenschneider, für 1/16" EdelstahlSUPELCO58692-UHerstellung von Ionentransferröhrchen
USB-Digitalfotografiemikroskopdx.comSO2 25~500XAnalyse
UV-härtendesHarz Prime DentalArtikel-Nr. 006.030Einzelsondenherstellung
Vertikaler PipettenabzieherDavid Kopf InstrumentsModell 720Herstellung von Zellauswahlsonden
SpannungsgehäusePicoChipPCH-A00120ICMP/MS-Schnittstelle
DrahtschneiderCraftsman4 1/2 in EndzangeLeitfähiges Verschraubungssetup
mit Zellkultur-Inline-Mikrofilter mit einer Sonde PEEK-Schlauch

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111(2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445(2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101(2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891(2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201(2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981(2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173(2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911(2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell Mass SpectrometryCell Manipulation SystemSingle Probe SCMSSuspension Cell AnalysisMass Spectrometry AnalysisIntracellular Metabolite DetectionNanoelectrospray IonizationPatient Derived CellsDrug QuantificationCellular Heterogeneity

Related Articles