Method Article

Murine Appendektomie Modell der chronischen Colitis assoziiert entaktischen Darmkrebs durch präzise Lokalisierung von Caecal Patch

DOI:

10.3791/59921

⸱

August 24th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine, Xi'an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center, University of Health Network, 6Department of Pathology, Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache chirurgische Entfernung des Blinddarms (Kaecal-Patch) in einer Maus, gefolgt von der Induktion von entzündlichem Darmerkrankungen-assoziiertem Dickdarmkrebs. Dieses murine Appendektomie-Modell ermöglicht die Untersuchung der biologischen Rolle des Blinddarms bei der Pathogenese der menschlichen Magen-Darm-Krankheit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der menschliche Blinddarm wurde vor kurzem involviert, um wichtige biologische Rollen bei der Pathogenese verschiedener komplexer Krankheiten wie Dickdarmkrebs, entzündliche Darmerkrankungen und Parkinson zu spielen. Um die Funktion des Blinddarms zu untersuchen, wurde ein Darmkrankheits-assoziiertes taurines Appendektomie-Modell etabliert und sein Schritt-für-Schritt-Protokoll wird hier beschrieben. Dieser Bericht führt ein leichtes Protokoll für die Entfernung von Kaecal-Pflastern bei Mäusen ein, gefolgt von der chemischen Induktion von chronischem Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs unter Verwendung einer Kombination aus Dextransulfat-Natrium (DSS) und Azoxymethan (AOM). IgA-spezifische Zellen und IgA-Konzentration wurden bei der Entfernung des Kaecal-Patches bei männlichen C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu denen in der Scheingruppe signifikant reduziert. Gleichzeitige Verabreichung von 2% DSS und AOM führte zu fast 80% Mäuseüberleben in Schein- und Appendektomiegruppen ohne signifikanten Gewichtsverlust des Körpers. Histologische Ergebnisse bestätigten eine Darmentzündung und verschiedene Grade des Adenokarzinoms. Dieses Modell kann für die Untersuchung der funktionellen Rolle des Blinddarms bei der Aufrechterhaltung der Darmmikrobiota-Homöostase und Pathogenese von Darmkolitis und Malignitäten sowie für die mögliche Entwicklung von Medikament-Targeting-Therapien verwendet werden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die klinische Appendektomie ist ein Standard-chirurgisches Verfahren mit Entfernung des Blinddarms vor allem aufgrund von Entzündungen (z.B. Appendizitis)1,2,3. Die biologische Funktion des vermiformen menschlichen Blinddarms bleibt jedoch umstritten4,5,6. Der Blinddarm wurde als vestigialer Überrest betrachtet, der aus dem Cecum im Großdarm projiziert wird. Bis vor kurzem haben evolutionäre, immunologische, morphologische und mikrobiologische Studien darauf hingedeutet, dass der Anhang unterschiedliche Funktionen besitzen kann. Zu diesen Rollen gehören die Produktion von Immunglobinen (z. B. IgA und IgG), eine Vielzahl von B-Zellen und T-Zellen, die für adaptive Immunantworten innerhalb der Darm-assoziierten Lymphgewebe (GALTs) entscheidend sind, und die Auffüllung des Großdarms mit commensalen Mikrobiotas. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.

Klinische epidemiologische Studien von Patienten mit früherer Appendektomie oder akuter Appendizitis haben auch ihre potenzielle Rolle bei der Pathogenese menschlicher Krankheiten, wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD), Dickdarmkrebs und nicht-gastrointestinal Erkrankungen (z.B. Parkinson und Herz-Kreislauf-Erkrankungen)13,14,15,16,17,18. So zeigte eine große asiatische Populationskohortenstudie mit 75.979 Appendektomie-Patienten kürzlich einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Blinddarmkrebs- und Sterblichkeit14,19. Dementsprechend wird die Erstellung eines geeigneten Tier-Appendektomie-Modells, das einem Menschen ähnelt, hilfreich sein, um die biologischen Funktionen und molekularen Mechanismen des Blinddarms in der Krankheitspathogenese zu untersuchen.

Viele Säugetiere besitzen einen Blinddarm oder ein Blinddarm-ähnliches Organ, einschließlich Primaten, Lagomorphen (z.B. Kaninchen), einige Nagetiere und Beuteltiere20. Bei kleinen und häufig verwendeten Labortieren besitzt das Kaninchen den vermiformenen Blinddarm, der dem menschlichen21,22ähnelt, aber GALT beim Kaninchen ist im Vergleich zum Menschen extrem groß, da die Mehrheit der Lymphgewebe finden sich auch in Peyers Pflastern, die sich sowohl im Dünn- als auch im Dickdarm befinden21. Darüber hinaus zeigt das Kaninchen eine andere lymphoide follikelische Struktur, T-Zell-Verteilung, und Immunglobulindichte vom Menschen, die das Studium ihrer Anhänge ungeeignet macht21.

Mäuse sind das am häufigsten verwendete Tiermodell, um die humane Pathophysiologie zu studieren und die verschiedenen bestehenden und neuartigen Therapuetika23,24,25zu testen. Der einzelne weiße große Lymphoidhaufen an der Spitze des Caecums bei Mäusen, bekannt als der Kaecal-Patch, wird angenommen, dass er ähnliche Funktionen wie der menschliche Blinddarm26,27,28ausführt. Dennoch ist es praktisch schwierig, den Kaecal-Patch von Caecum bei Mäusen zu trennen. Bisher beinhalten die üblichen chirurgischen Verfahren zur Induktion von Blinddarmentzündungen in einem Mausmodell einen relativ großen Schnitt (z. B. 1–2 cm) durch die Bauchwand, um Zugang zum gesamten Caecum zu erhalten (Zusatztabelle 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Hierin, um ein Appendektomie-Modell im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen zu generieren, stellt dieser Bericht ein leichtes chirurgisches Protokoll für die Entfernung von Kaecal-Pflasterbeiten bei Mäusen vor. Es folgt die kombinierte Verabreichung des genotoxischen Mittels AOM und des proinflammatorischen Mittels DSS zur Induktion von Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs ähnlich dem beim Menschen. IBD hat sich als Risikofaktor für Darmkrebs37,38gezeigt. Die Kombination von AOM/DSS-induziertem chronischem Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs ist gut etabliert, und Leser können sich auf Neufert et al. und Thaker et al. für detaillierte Verfahren39,40beziehen. Dieses reproduzierbare und schnelle murine Appendektomie-Modell kann verwendet werden, um Blinddarm-modulierte Darmentzündungen und Dickdarm-Mikrobiota zu studieren, insbesondere bei der Entwicklung und Progression von IBD und Dickdarmkrebs.

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Protocol

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Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Xi'an Jiaotong University (Nr. XJTULAC2019-1023).

1. Mäuse-Appendektomie

  1. Haus 8–10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse in einer zertifizierten spezifisch-pathogenfreien (SPF) Umgebung für 1 Woche vor der Operation.
  2. Bereiten Sie folgende sterile chirurgische Instrumente vor: ein Paar Mikroschere, ein Paar Mikrozange, zwei Größen (4-0 und 8-0) sterilisierter nicht resorbierbarer Nähte, ein elektrischer Gerinnungsstift mit Nadelhalter, 75% medizinischer Alkohol, Jod-basiertes Peeling ( z. B. Entojod) und eine Packung steriler Wattestäbchen.
  3. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit vorgewärmter 0,9% physiologischer Salzlösung für die Bauchspülung und Hydratation während der Operation.
  4. Anästhetisieren Sie eine nicht-schnelle Maus intraperitoneal (i.p.) mit 1% Natriumpentobarbital in einer Dosis von 100 mg/kg. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf Pedalreflexe.
    HINWEIS: Es wird eine einzelne Anästhesiedosis verabreicht, um eine vollständige beruhigende Wirkung in der Maus zu gewährleisten. Unter den Umständen kurzer Verfahren können 50 mg/kg Natriumpentobarbital i.p. ausreichen.
  5. Rasieren Sie das Bauchhaar vorsichtig mit einem elektrischen Rasierer.
  6. Legen Sie die Maus auf das Heizkissen, um Unterkühlung zu verhindern.
  7. Sichern Sie die Maus auf einer Plattform in einer Supine-Position, indem Sie vier Streifen medizinisches Klebeband über die Gliedmaßen legen, um Haltungsbewegungen während der Operation zu verhindern.
  8. Berühren Sie sanft den ganzen Bauch, um das Gefühl einer Beule zu finden.
    HINWEIS: In den meisten Fällen gibt das Gefühl einer Beule immer die genaue Position des Caecums an. Um mögliche Schäden am Rest des Darms zu vermeiden, ist diese Vorortung des Cecums vor dem Bauchschnitt wichtig.
  9. Mit einem sterilen Vorhang abdecken und den rasierten Bereich des Bauches desinfizieren, indem Sie abwechselnd chirurgische Peelings von Jodlösung und 75% Alkohol anwenden. Wiederholen Sie den Vorgang 2x.
  10. Machen Sie einen Längsschnitt zwischen 0,5 und 1,0 cm an der Mittellinie des Bauches.
  11. Nach der vorgegebenen Position des Caecums erreichen Sie das Caecum und entfernen Sie sanft (caecal patch). Verwenden Sie eine sterile, vorgewärmte Salzlösung des physiologischen pH-Werts, um den Darm zu hydratisieren.
    HINWEIS: Der Kaecal-Patch einer Maus ist Teil des Caecums und zeichnet sich durch das Vorhandensein von weißen eiförmigen Follikel auf der Oberfläche aus.
  12. Um mögliche Komplikationen der postoperativen Blutung und Infektion zu verhindern, ligate die mesentischen Blutgefäße des Caecums mit dem 8-0 naht. Das Caecum mit steriler Saline hydratisieren.
  13. Markieren Sie den Resektionsbereich mit der 4-0-Naht mit einer offenen Schleife in der Nähe des Scheitelpunkts des Caecums am proximalen Dickdarm.
    HINWEIS: Das Markieren des Caecums mit einer offenen Schleife verhindert auch das Auslaufen von Kaekalinhalten aus dem Schnitt.
  14. Schneiden Sie den Kaecal-Patch unterhalb der markierten Resektion mit Mikroscheren ab und wischen Sie den restlichen Kaekalgehalt mit medizinischen Wattestäbchen aus. Dann desinfizieren Sie den Stumpf von Caecum mit Jod-basiertem Peeling.
  15. Schließen Sie den Stumpf mit der laufenden Naht mit dem 8-0 naht.
  16. Entfernen Sie vorsichtig die 4-0-Gewindeschleife, die zuvor zur Markierung der Resektion am Stumpf des Caecums verwendet wurde.
  17. Sterilisieren Sie die vernähte Position mit Jod-basiertem Peeling. Rehydrieren Sie die chirurgische Stelle mit Saline wieder.
  18. Schließen Sie die Muskulaturschicht mit der laufenden Naht mit 8-0 Nahtgewinde.
  19. Schließen Sie die Hautschichten mit unterbrochenen Nähten mit 4-0 Nahtfaden.
  20. Desinfizieren Sie den chirurgischen Schnitt 2x mit Jod-basiertes Peeling, dann entfernen Sie Jod mit 75% medizinischem Alkohol.
  21. Drehen Sie die Maus vorsichtig zurück, subkutan (s.c.) injizieren 0,1 mg/kg Körpergewicht von Buprenorphin und 0,4 ml physiologische reine Salzlinie und lassen Sie die Maus auf dem Heatpad ruhen, bis sie ins Bewusstsein zurückkehrt.
  22. Setzen Sie die Maus zurück in den sterilen Käfig und beobachten Sie 3 Tage nach der Operation 3 Tage lang genau auf Anzeichen von Schmerzen, um die Genesung sicherzustellen.
    HINWEIS: Zur Schmerzlinderung der einzelnen Maus kann eine postoperative Anwendung von 0,05 mg/kg Buprenorphin erforderlich sein. Erlauben Sie Mäusen, sich 7 Tage nach der Operation zur weiteren Induktion von Colitis-assoziierten Dickdarmkrebs zu erholen.

2. Induktion von chronischem Colitis-assoziiertem Dickdarmkrebs mit AOM und DSS

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren 7 Tage nach der Appendektomie durch.

  1. Bereiten Sie die AOM-Stammlösung vor, indem Sie 25 mg AOM in 2,5 ml 0,9% steriler Saline in einer Konzentration von 10 mg/ml auflösen.
    HINWEIS: AOM ist lichtempfindlich.
    1. Aliquot 2,5 ml vorbereitete AOM-Lagerlösung in 5 ml Glasrohre, die mit Aluminiumfolie umwickelt sind, und bei jedem Gebrauch bei -20 °C lagern.
    2. Ein Aliquot von AOM einmal auftauen und auf eine Konzentration von 1 mg/ml mit 0,9% steriler Salzin verdünnen (Verhältnis 1:10).
      VORSICHT: AOM ist extrem krebserregend; führen Sie daher den gesamten Vorbereitungsvorgang in einer Dunstabzugshaube durch.
  2. 4 g DSS-Pulver in 200 ml autoklaviertem Wasser auflösen, um 2% (w/v) DSS-Lösung vorzubereiten.
    HINWEIS: Die Konzentration von DSS kann je nach Mausstamm, Geschlecht und Induktionszyklus variieren; 3% DSS kann für andere Mäusestämme verwendet werden.
  3. Gleichzeitig das frisch zubereitete AOM/DSS an die Mäuse anbringen. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
    1. Intraperitoneal injizieren 0,01 ml/g frisch zubereitete AOM-Arbeitslösung für jede Maus und ersetzen Sie das autoklavierte Wasser durch 2% DSS-Lösung für 5 Tage ad libitum.
      HINWEIS: Jeder Käfig enthält fünf Mäuse; überprüfen Sie regelmäßig die DSS-Trinkflasche, um sicherzustellen, dass während der Behandlungszeit kein Niederschlag auftritt.
    2. Gewicht und genau überwachen jede Maus jeden Tag.
      HINWEIS: Während der Verabreichung, einschläfern Mäuse mit bis zu 20% Gewichtsverlust im Vergleich zu seinem anfänglichen Gewicht oder Anzeichen der Huddle, Schielen, Unterkühlung, und schlechte Aktivität.
  4. Geben Sie eine frische Flasche autoklaviertes Wasser am Tag 6 nach der Verabreichung von AOM/DSS bis zum 21. Tag (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Dies ist ein vollständiger Zyklus, der 21 Tage umfasst.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.4 für weitere zwei Zyklen und opfern Sie die Mäuse an Tag 70.

3. Bewertung von Darmentzündung und Tumor (70 Tage nach der Verabreichung von AOM)

  1. Opfern Sie die Mäuse durch CO2-Inhalation mit einer Füllrate von 10% in der Euthanasiekammer, gefolgt von zervikaler Dislokation.
  2. Ernten Sie den gesamten Dickdarm von oben die ileo-kolikische Kreuzung zum Anus.
  3. Setzen Sie die Lumenseite aus, indem Sie den Kolon längs öffnen. Schneiden Sie den ganzen Dickdarm in 10 cm lange Stücke und fixieren Sie das Dickdarmgewebe in 10% Formalin für 72 h für Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung.

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Results

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Etablierung eines murinen Appendektomiemodells

Dieses murine Appendektomie-Modell des chronischen Colitis assoziierten Dickdarmkrebses kann durch Befolgen der sequenziellen chirurgischen und Induktionsschritte erzeugt werden, wie in Abbildung 1dargestellt. Die häufigsten Positionen von caecum sind in der linken und rechten iliac fossa gefolgt von der Mittellinie des Bauches (Abbildung 2). Die erfolgreiche Rate der Vor...

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Discussion

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Ein murines Appendektomie-Modell von Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs wurde mit chirurgischen Schritten mit einer hohen Überlebensrate bei Mäusen erhalten. In den meisten Fällen war es schwierig, seiner Lage ohne Laparotomie vorzugreifen, da das Caecum unter der Bauchwand positioniert war(Zusatztabelle 1, Zusatztabelle 2und Abbildung 2), da es schwierig war, seiner Lage ohne Laparotomie vorzugreifen. In diesem chirurgischen Protokoll wurde ein einfacher Schritt zur Berühru...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird teilweise durch Fundamental Research Funds for the Central University (G2018KY0302), University Fundamental Research Development Fund (KT00062), National Natural Science Foundation of China (81870380) und Clinical Research Award des Erstes angeschlossenes Krankenhaus der Xi'an Jiaotong Universität in China (Nr. XJTU1AF-CRF-2015-029). Die Autoren danken Dr. Chengxin Shi für seine technischen Vorschläge während der frühen Explorationsphase des murinen Appendektomiemodells sowie dem Pathologen Dr. Xi Liu für die Bewertung der H&E-Färbungsergebnisse von Kolitis und kolorektalen Tumoren. Y.L. führte die Operation Demonstration durch, führte Datenanalysen durch und schrieb den Entwurf des Manuskripts; J.L., G.L., Z.P. und Y.M. nahmen an der chirurgischen Vorbereitung, Gewebesammlungen und Videoproduktion teil; M.Z. führte die Durchflusszytometrie und ELISA durch; Q.W. und H.X. leisteten die technische Unterstützung bei der Erzeugung eines klinisch relevanten murinen Modells; R.X.Z. entwarf die Studie, überwachte die Forschung und schrieb und dokumentierte das Manuskript; J.S. überprüfte das Manuskript.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Azoxymethan (AOM)Sigma-Aldrich, Inc.A5486
Dextransulfat-Natriumsalz (DSS)MP Biomedicals, Inc.160110
EntoiodineShanghai likon high technology desinfektion co. LTD310102
digitaler MessschieberNingbo yuanneng trading co. LTD4859263
4-0 Silk SuturesYuanlikang co. LTD20172650032
8-0 Prolene NähteYuanlikang co. LTD20172650032
Elektrischer GerinnungsstiftChuang mei medical equipment co. LTD28221777292
Einwegspritze 1mlShengguang medical products co. LTD3262-2014
Einwegspritze 10mlShengguang medical products co. LTD3262-2014
75% medizinischer AlkoholShandong anjie High-Tech-Desinfektionstechnologie co. LTD371402AAJ008
Pentobarbital-NatriumsalzSigma-Aldrich, Inc.57-33-0
Physiologische KochsalzlösungShandong qidu pharmaceutical co. LtdH37020766
Saugfähiges WattestäbchenHenan ruike medical co., LTDRK051
Chirurgische Instrumente-OphthalmicJinzhong Shanghai co. LTDWA3050

References

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