Summary
Questo protocollo descrive come eseguire rapidi analisi della luciferasi a basso costo a medio-velocità utilizzando una luciferasi Gaussia legata all'insulina come proxy per la secrezione di insulina dalle cellule beta. Il saggio può essere eseguito con la maggior parte dei lettori di lastre di luminescenza e pipette multicanale.
Abstract
L'esecuzione di saggi basati su anticorpi per la raccolta post-campione di insulina secreta richiede di solito da poche ore a un giorno di tempo di analisi e può essere costoso, a seconda del saggio specifico. Luciferasi secreto saggia risultati accelerare i risultati e ridurre sostanzialmente il costo di analisi per campione. Qui presentiamo un approccio relativamente sottoutilizzato per misurare l'attività di venosacre dell'insulina dalle cellule del pancreas utilizzando Gaussia luciferate geneticamente inserite all'interno del peptide C. Durante l'elaborazione proteolitica del proinsulino, il peptide C viene ascisa rilasciando la luciferasi all'interno della vescica secretoria dell'insulina dove è co-secreto con insulina. I risultati possono essere ottenuti pochi minuti dopo la raccolta del campione a causa della velocità dei saggi luciferasi. Una limitazione del saggio è che si tratta di una misurazione relativa della secrezione di insulina e non una quantificazione assoluta. Tuttavia, questo protocollo è economico, scalabile e può essere eseguito utilizzando la maggior parte dei lettori di lastre di luminescenza standard. Pipette analogiche e digitali multicanale facilitano più passaggi del saggio. Molte diverse varianti sperimentali possono essere testate contemporaneamente. Una volta deciso un insieme mirato di condizioni, le concentrazioni di insulina dovrebbero essere misurate direttamente utilizzando saggi basati su anticorpi con curve standard per confermare i risultati del test luciferasi.
Introduction
Il metodo qui presentato consente di testare rapidamente e convenientemente la secrezione di insulina proveniente da una linea di cellule beta geneticamente modificate in formato 96-well-plate. La chiave di questo protocollo è una versione modificata dell'insulina con la Gaussia luciferasi (GLuc, 18 kDa) inserita (vedi figura 1)nel peptide C per generare insulina-Gaussia (InsGLuc)1,2. Altre proteine più grandi, come GFP (25 kDa), sono state inserite con successo nel peptide C dell'insulina e hanno esibito l'atteso trattamento post-traduzionale dal proinsulino-GFP all'insulina e gFP-C-peptide3,4. Per il saggio in questo protocollo, GLuc è stato ottimizzato per la codone per l'espressione dei mammiferi e sono state introdotte due mutazioni per migliorare la cinetica simile al bagliore5,6. Molteplici combinazioni e repliche delle condizioni di trattamento possono essere facilmente testate in formato 96-well-plate e i risultati della secrezione possono essere ottenuti immediatamente dopo l'esperimento.
Un vantaggio importante, come precedentemente osservato2, è il basso costo di questa misurazione della secrezione a base di luciferasi (< 0,01 USD/bene) che la differenzia dai costi relativamente più elevati e dagli aspetti tecnici dei saggi immunosorbena (ELISA) legati agli enzimi ( > 2 USD/bene) e la fluorescenza oomogenea risolta nel tempo (HTRF) o altri saggi basati sul trasferimento di energia di risonanza fàrster (FRET). Rispetto a questi saggi basati su anticorpi, che misurano la concentrazione di insulina facendo riferimento a una curva standard, il saggio di InsGLuc misura l'attività secretoria come un confronto relativo ai pozzi di controllo sulla piastra. Per questo motivo, ogni esperimento richiede l'inclusione di controlli adeguati. Questa distinzione è un compromesso per consentire misurazioni rapide ed economiche. Tuttavia, la secrezione di InsGLuc ha dimostrato di essere altamente correlata alla secrezione di insulina misurata da ELISA1,2. Questa tecnologia è stata scalata per lo screening ad alto throughput1,2,7 e ha portato all'identificazione di nuovi modulatori di secrezione di insulina tra cui un inibitore del canale di potassio tensione-gated7 così come un inibitore naturale del prodotto della funzione cellulare, la cromomicina A28. L'uso di InsGLuc è più appropriato per i ricercatori che intendono testare continuamente molte condizioni di trattamento diverse per il loro impatto sulla secrezione di insulina. Negli esperimenti di follow-up è necessario ripetere i risultati chiave in una linea cellulare di z, e in modo ottimale in isolotti murini o umani, e misurare la secrezione di insulina utilizzando un saggio basato su anticorpi.
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Protocol
1. Preparazione di reagenti, supporti e buffer (tabella 1)
- Preparare il supporto MIN6 completo in 500 mL di penicillina ad alto glucosio (4,5 g/L) Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) con i seguenti additivi: 15% siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL penicillina, 100 g/mL streptomycin, 292g/mL L-amine, 500 il mercaptoetanolo.
NOTA: La linea cellulare stabile in questo caso viene mantenuta in 250 g/mL di antibiotico G418. - Preparare il buffer di bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) creando una soluzione contenente 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2e 1 album di siero bovino mg/mL mg/mL di grado bovino (BSA). Il glucosio deve essere aggiunto dove specificato da un titolo di 2 M.
NOTA: KRBH viene utilizzato per incubare le cellule con e senza stimolazione al fine di valutare l'insulina e/o la secrezione di luciferasi. - Preparare la soluzione stock coelenterazine (PT) come segue. Preparare il metanolo acidificato aggiungendo 106 -L di HCl concentrato a 10 mL di metanolo. Successivamente, sciogliere l'XT lofilizzato nel metanolo acidificato a 1 mg/mL e conservare a -80 gradi centigradi in tubi a vite.
NOTA: Questi stock mantengono un'attività sufficiente nei saggi luciferasi di routine, anche dopo 1 anno di conservazione adeguata. - Preparare Gaussia luciferase (GLuc) assaggio buffer basato sulla letteratura9 così come le informazioni sui brevetti10 per aiutare in emivita del saggio di luciferasi della Gaussia in formato 96 ben piastra. Utilizzare la formula: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/mL Na2PO4, 300 mM sodio ascorbate, 200 mM Na2SO3 in acqua. Congelare le scorte a -20 gradi centigradi. Dopo lo scongelamento, conservare il buffer a 4 gradi centigradi.
- Per preparare la soluzione di lavoro della lucifera di Gaussia, aggiungere al buffer di analisi GLuc 4,2 l/mL della soluzione di 1 mg/mL (2,36 mM) di Unità XT. Questo si traduce in una soluzione di lavoro 2x di 10 M IN XT che avrà una concentrazione finale di 5 M nel saggio.
2. Cultura delle cellule InsGLuc MIN6 e semina per i saggi di secrezione
- Per colture cellule MIN6, tripsinizzare e semiare le cellule una volta alla settimana utilizzando tecniche di coltura cellulare standard. Cambiare i supporti sulle celle ogni due o tre giorni. Includere nel supporto un antibiotico di selezione appropriato, ad esempio 250 g/mL di G418.
- Per fornire un numero sufficiente di cellule settimanalmente per gli esperimenti, mantenere le cellule in flaconi T75. Semina 6 x 106 cellule per T75 in 10 mL di supporti in genere produrrà 30 x 106 a 40 x 106 celle totali per T75 dopo 7 giorni di coltura.
- Per preparare le cellule per la placcatura in piastre da 96 pozzetti, lavare due volte un T75 confluente di cellule InsGLuc MIN6 con PBS e aggiungere 2 mL di provetterina. Incubare a 37 gradi centigradi per 5 min o fino a quando le cellule si dissociano dal pallone. Determinare la concentrazione cellulare per millililatore.
- Diluire le celle in un supporto completo a 1 x 106 celle/mL per ottenere 1 x 105 celle in 100 : l per pozzo in una piastra di 96 pozzetti. Le cellule devono essere sufficientemente confluenti per il saggio dopo 3-4 giorni.
NOTA: Per estendere il periodo di coltura, metà della concentrazione cellulare può essere placcata. I cambiamenti dei media non sono necessari prima del giorno del saggio a meno che le cellule non siano sottoposte a trattamenti sperimentali.
- Diluire le celle in un supporto completo a 1 x 106 celle/mL per ottenere 1 x 105 celle in 100 : l per pozzo in una piastra di 96 pozzetti. Le cellule devono essere sufficientemente confluenti per il saggio dopo 3-4 giorni.
3. Saggio gaussia luciferasi secrezione
- Il giorno del saggio preparate abbastanza KRBH per l'esperimento (passaggio 1.2). Sono necessari almeno 50 mL di KRBH per piastra da 96 pozzetti, quindi preparare almeno 75 mL per garantire un buffer sufficiente per l'esperimento. Preparare un buffer aggiuntivo se diverse combinazioni di condizioni di trattamento farmacologico richiederanno KRBH per la diluizione.
- Preparare un serbatoio con KRBH senza glucosio. Decantare il mezzo da 96-well plate(s) invertendo rapidamente la piastra su un lavandino di laboratorio e poi macchiare saldamente su una pila di tovaglioli di carta per rimuovere il mezzo in eccesso.
- Utilizzando una pipetta elettronica o manuale a 8 canali, pipetta 100 -L /well KRBH dal serbatoio attraverso le lastre di 96 pozzi. Ripetere per un totale di due lavamenti.
- (Passaggio facoltativo dei trattamenti composti acuti) Se non esegue trattamenti farmacologici, procedere con i passaggi 3.5 e 3.6 senza modifiche. Per testare gli effetti di piccole molecole sulla secrezione di insulina, i composti possono essere aggiunti alle cellule durante il periodo di preincubazione, il periodo di stimolazione o entrambi.
- Una tecnica è quella di aggiungere composti in lotto al KRBH in tubi da 1,5 mL e utilizzare una pipetta digitale a 8 canali regolabile per trasferire il farmaco-KRBH dai tubi alle cellule in piastre di 96 pozzi.
NOTA: Se non è disponibile una pipetta regolabile, è possibile creare una piastra replica 96 po' di droga-KRBH e utilizzare una pipetta standard a 8 canali per trasferire il buffer. Ulteriori modifiche al paradigma di trattamento possono essere apportate per trattare le cellule per 24 h nei media prima del saggio, come descritto in precedenza1,8.
- Una tecnica è quella di aggiungere composti in lotto al KRBH in tubi da 1,5 mL e utilizzare una pipetta digitale a 8 canali regolabile per trasferire il farmaco-KRBH dai tubi alle cellule in piastre di 96 pozzi.
- Aggiungere 100 L di KRBH contenente la concentrazione desiderata di glucosio o composti e mettere il piatto nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 1 ora.
NOTA: A seconda del layout sperimentale, è estremamente utile avere una pipetta elettronica multicanale che consenta di eseguire la transizione delle distanze del canale da una colonna di otto tubi da 1,5 mL alle 8 fileni di una piastra di 96 pozze. - Dopo l'1 h di preincubazione, decantare il tampone nel lavandino e macchiare saldamente su un tovagliolo di carta. Aggiungere 100 l di KRBH senza glucosio per bene per lavare via lo sfondo accumulato di Luciferasi Gaussia. Decant la piastra di nuovo e aggiungere il controllo e le condizioni stimolanti alla piastra a 100 .L per bene. Collocare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi per 1 ora.
- Raccogliere con cura 50 -L di supernatant utilizzando una pipetta multicanale, cambiando le punte tra le condizioni di trattamento, se necessario, e trasferire il supernatante in una piastra di saggio bianca bianca pulita da 96 piani.
NOTA: Le piastre chiare con pareti bianche possono essere utilizzate se necessario, anche se una quantità significativa di segnale luciferasi andrà persa. - Dopo la raccolta di 50 -L di KRBH supernatant, il campione può essere analizzato immediatamente. Se necessario, sigillare e conservare i campioni a 4 gradi centigradi per un paio di giorni (attività GLuc emivita di 6 giorni) o -20 gradi centigradi per un mesedi 11,12.
4. Segreto Gaussia luciferasi assay
- Per preparare la soluzione di lavoro dei divini GLuc, pipettare la quantità necessaria di soluzione di stock di CTz (4,2 l/mL) nel buffer di asdetto GLuc. Per evitare il riscaldamento della TTz, pipettare rapidamente il TTz al congelatore -80 gradi o tenere il tubo sul ghiaccio secco.
- Utilizzando una pipetta elettronica multicanale, aggiungere rapidamente 50 l della soluzione di lavoro di prova GLuc per bene attraverso il piatto 96-well contenente i supernatants KRBH raccolti. Se ci sono goccioline sui lati di eventuali pozzi, ruotare brevemente la piastra in una centrifuga da tavolo-top-secchio.
- Leggete la luminescenza in un lettore di lastre adatto in pochi minuti e leggete ogni pozzo con un tempo di integrazione di 0,1 s.
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Representative Results
Per misurare le prestazioni del saggio in condizioni di controllo, è possibile completare una semplice curva dose-risposta del glucosio o una stimolazione utilizzando il paradigma del diazossido. Nel caso del primo, pre-incubare le cellule per 1 h in condizioni prive di glucosio, seguito dal trattamento di 1 h con crescenti concentrazioni di glucosio dovrebbe comportare una scarsa attività secretoria a e al di sotto di 5 mM, mentre si osserva una maggiore secrezione sopra 8 glucosio mM (Figura 2). Stimolazione con 35 mM KCl serve anche come un controllo positivo per la secrezione stimolata. L'inclusione di farmaci che modulano la secrezione durante il periodo di stimolazione dovrebbe dare l'inibizione o il potenziamento previsto dell'attività GLuc secreta (Figura 3). Ad esempio, il diazoxide lega il canale KATP e impedisce che si chiuda in base all'aumento del rapporto [ATP/ADP], bloccando la depolarizzazione della membrana e prevenendo la secrezione13. Esters Phorbol come para-methoxyamphetamine (PMA) attivano la chinasi C proteica C (PKC) e sono amplificatori noti di secrezione di insulina14. Infine, la stimolazione con 1 epinefrina attiva i recettori -adrenergici2Ache a loro volta attivano il complesso eterotrimerico della proteina G Gi, inibendo la depolarizzazione della membrana e la secrezione di insulina15. È importante riconoscere che mentre le cellule MIN6 sono una linea cellulare immortale, iniziano a perdere risposte adeguate sulla secrezione di insulina indotta dal glucosio (come lo spostamento a sinistra della curva di risposta) dopo il passaggio prolungatodi 16. Per questo motivo, è buona norma coltivare regolarmente tutte le linee cellulari MIN6 per un massimo di otto settimane (splitting una volta alla settimana) prima di ricominciare da scorte di azoto liquido.
Figura 1: Descrizione del reporter di InsGLuc. (A) In primo luogo, è stata generata una linea cellulare stabile di z (in questo caso le cellule MIN6) che esprime il transgene insulino-Gaussia dal promotore dell'insulina del ratto. (B) La proteina completa è sintetizzata e confezionata in granuli di insulina insieme all'insulina endogena. Le conversioni prohormonegeti fendeno il peptide, indicato da asterischi. (C) L'insulina elaborata e la Gaussia sono cosecrete e l'attività di luciferasi viene rilevata con l'aggiunta di PT in una reazione indipendente dall'ATP e dipendente dall'ossigeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il reporter InsGLuc è un proxy fedele della secrezione di insulina dalle cellule beta MIN6. (A) Risposta delle cellule MIN6 InsGLuc all'aumento delle concentrazioni di glucosio e kCl (35 mM) con secrezione di luciferasi della Gaussia. I dati sono l'attività media di luciferasi piega: SE rispetto alle condizioni di glucosio da 0 mM per tre esperimenti indipendenti. P < 0,05. La figura è stata modificata con il permesso di Kalwatet al. © American Chemical Society 2016. (B) Il reporter InsGLuc nelle cellule MIN6 mostra la risposta secretoria prevista al paradigma di biossido di anidride (Dz) in cui il trattamento di 250 M Dz tiene aperto il canale KATP, bloccando il depolarizzazione della membrana a meno che non venga fornito il KCl extracellulare (35 mM) per suscitare l'afflusso di calcio "scatenante". Ulteriore aggiunta di glucosio (20 mM) sotto la condizione di Dz - KCl rivela l'amplificazione metabolica della secrezione che si verifica senza ulteriori aumenti nell'afflusso di calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'inclusione di composti che modulano la secrezione durante la secrezione stimola il glucosio stimola la secrezione di InsGLuc. Le cellule InsGLuc MIN6 placcate in formato 96-well come descritto sono state preincubate in KRBH senza glucosio per 1 h. Le cellule sono state poi trattate con o senza 20 mdi di glucosio in presenza di zolfo dimetilico (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), diarogetto (250 m), PMA (100 n) o l'epinefrina (1 M) per 1 h. Il grafico a barre rappresenta la media di almeno 3 esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer di bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) | |||
| Soluzione di riserva o polvere | merce | Concentrazione finale | 100 mL |
| Kcl | 0,25 M | 5 mM | 2 ml |
| Nacl | 4 M | 120mm | 3 ml |
| Hepes, pH 7.4 | 1 M | 15 mM | 1,5 ml |
| NaHCO3 | 0,5 M | 24 mM | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M | 2 mM | 0,2 ml |
| acqua | H2o | 88,4 ml | |
| Grado RIA BSA | polvere | 1 mg/mL | 100 mg |
| Riprenditi il giorno dell'esperimento. | |||
| Buffer di analisi Gaussia | |||
| Soluzione di riserva o polvere | merce | Concentrazione finale | 50 mL |
| Fosfato disodio | polvere | 0,1% (1 mg/mL) | 50 mg |
| Glicerolo | 40% | 5% | 6,25 mL |
| Bromuro di sodio | polvere | 150mm | 772 mg |
| EDTA pH 8 | 0,5M | 1 mM | 100 ll |
| Tris-HCl pH 8 | 1M (in modo instato | 25 mM | 1,25 mL |
| Acido Ascorbico | polvere | 300mm | 2,64 g |
| Na2SO3 | polvere | 200mm | 1,26 g |
| acqua | fino a 50mL | ||
| Conservare in aliquote a -20 gradi centigradi, scongelare uno alla volta e tenere a 4 gradi centigradi. | |||
| -Ricetta modificata da Luft et al. BMC Biochimica 2014, 15:14. | |||
| Acidificata MeOH | |||
| Soluzione di riserva o polvere | merce | Concentrazione finale | 10 mL |
| metanolo | 100% | 10 mL | |
| Hcl | 11,65 M | 1,06% | 0,106 mL |
| Soluzione Coelenterazine | |||
| Soluzione di riserva o polvere | merce | Concentrazione finale | 1 mL |
| Coelenterazina | polvere | 1 mg/mL (2,36 mM) | 1 mg |
| Metanolo acido | 1 mL | ||
| 4,2 l_L di stock per 1 mL di Gaussia Assay Buffer si traduce in 10 M DI TZ da utilizzare come soluzione di lavoro 2x. | |||
| Ad esempio, aggiungere 50 l di 2x soluzione di lavoro a 50 L di krBH contenente Gaussia secernono. | |||
Tabella 1: Ricette di soluzioni di buffer e stock utilizzate per eseguire i saggi presentati.
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Discussion
Qui presentiamo un metodo per valutare rapidamente le risposte di secrezione di insulina stimolate dal glucosio dalle cellule MIN6. Per le migliori risposte nel saggio è importante seminare le cellule MIN6 alla densità corretta e permettere loro di diventare 85-95% confluente. In questo modo le risposte delle cellule al glucosio a causa del miglioramento dei contatti cellulare-cellulare e della sincronizzazione, che si verifica sia negli isolotti primari17,18,19,20,21, sia mIN6 celle16,18. Per prevenire perdite in risposta secretoria alla stimolazione del glucosio, è importante mantenere le cellule al più basso possibile di un passaggio e coltura le cellule per solo 6-8 settimane prima di scongelare una nuova fiala da scorte di azoto liquido. È possibile apportare modifiche alla strategia di placcatura nella sezione 2 del protocollo per adattarsi alle attrezzature disponibili, se necessario. Placcatura insGLuc MIN6 cellule in piatti 96-pozzo per saggi di secrezione offre un gran numero di pozzi per manipolazioni sperimentali (comprese le repliche) così come mantenere la precisione della placcatura in un ambiente di laboratorio normale, come placcatura in piatti con più alto bene spesso richiede attrezzature speciali solitamente disponibili in core di screening ad alta velocità.
I saggi attuali per la secrezione dell'insulina, diversi dal risultato indiretto di luciferalità qui descritto, includono: ELISA che utilizzano letture colorimetriche (analisi diretta), radioimmunosi (analisi della concorrenza) che utilizzano letture radioattive, anticorpi basati su FRET analisi della concorrenza22 e HTRF23 che utilizza FRET tra anticorpi legati ai coloranti per misurare direttamente l'insulina e apimi di DNA24. Ognuno di questi metodi ha i suoi vantaggi, ma in generale sono più costosi e / o dispendiosi in termini di tempo di un assaggio luciferasi. Una limitazione fondamentale del saggio InsGLuc è il fatto che l'attività luminescente della luciferasi co-secret è solo un proxy per la secrezione di insulina effettiva. Inoltre, non vi è alcuna differenza prevista nell'attività di luciferasi tra Gaussia con frammenti di C-peptide sul suo N- e C-termini o Gaussia all'interno della proteina proinsulina, poiché Gaussia luciferase è stata utilizzata con successo come tag per misurare la secrezione di altre proteine25. Questo mette in evidenza il requisito di studi di conferma utilizzando saggi che misurano l'insulina trattata specificamente. Alternative alle misurazioni dirette e indirette della secrezione di insulina possono essere utilizzate anche per valutare la funzione delle cellule . Esiste una varietà di giornalisti ottici per le letture, tra cuirapporto ATP:ADP, afflusso di calcio, rapporto NAD /NADH, attivazione di ellisi extracellulari regolate dal segnale (ERK) o livelli di monofafato di adenosina ciclica (cAMP)26.
Le future applicazioni di InsGLuc, in particolare, sembrano essere nello screening ad alta velocità. Questo test è già stato utilizzato in una manciata di piccoli schermi pubblicati1,2 e schermi più grandi inediti sono completati7 o in corso. Lo sviluppo di altre iterazioni di questa tecnologia può comportare l'etichettatura di altri ormoni isolota secreti con lucifere per facilitare misurazioni rapide, come per glucagone o somatostatina. Le modifiche potrebbero essere apportate in ogni caso in cui la linea cellulare viene ricreata utilizzando approcci alternativi tra cui CRISPR/Cas9, lentivirus o inserimento mediato da trapostasi in qualsiasi linea di cellule beta adatta. Ulteriori possibili modifiche al reporter originale possono includere la sostituzione di lucifere alternate secrete per Gaussia o la combinazione di più diverse lucifere secrete legate a diversi ormoni per un saggio multiplexed. Oltre alla coltura cellulare, la tecnologia CRISPR/Cas9 presenta la possibilità di generare un modello murino in cui una luciferasi adeguata viene buttata nella regione di codifica C-peptide di Ins2 nel genoma. Tale topo sarebbe fattibile dato che i topi transgenici sono stati creati con GFP bussato allo stesso sito C-peptide27 e consentirebbe la misurazione della funzione endogena delle cellule z con un saggio luciferasi in vivo o ex vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano tutti gli attuali ed ex membri del laboratorio Cobb per il lavoro prezioso e le discussioni, e Dionne Ware per l'assistenza amministrativa. Michael Kalwat è supportato da una Juvenile Diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso NIH R37 DK34128 e Welch Foundation Grant I1243 a Melanie Cobb. Le prime parti di questo lavoro sono state sostenute anche da un NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
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- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
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