Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.
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Methodenartikel
Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
ATPase-Enzyme nutzen die in Adenosintriphosphat gespeicherte freie Energie, um eine Vielzahl von endergonischen biochemischen Prozessen in vivo zu katalysieren, die nicht spontan auftreten würden. Diese Proteine sind entscheidend für alle Aspekte des Zelllebens, einschließlich Stoffwechsel, Zellteilung, Reaktionen auf Umweltveränderungen und Bewegung. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen nicotinamidadenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelten ATPase-Assay, der an das semi-hohe Durchsatzscreening kleiner Molekül-ATPase-Inhibitoren angepasst wurde. Der Assay wurde als Beweis für das Prinzip auf Herz- und Skelettmuskel Myosin II, zwei aktinbasierte molekularmotorische ATPases, angewendet. Die Hydrolyse von ATP wird mit der Oxidation von NADH durch enzymatische Reaktionen im Assay gekoppelt. Zunächst wird die von der ATPase erzeugte ADP durch Pyruvatkinase (PK) zu ATP regeneriert. PK katalysiert den Übergang von Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat parallel. Anschließend wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat reduziert, was die Oxidation von NADH parallel katalysiert. Somit steht die Abnahme der ATP-Konzentration in direktem Zusammenhang mit der Abnahme der NADH-Konzentration, gefolgt von einer Veränderung der intrinsischen Fluoreszenz von NADH. Solange PEP im Reaktionssystem verfügbar ist, bleibt die ADP-Konzentration sehr gering, wodurch eine Hemmung des ATPase-Enzyms durch sein eigenes Produkt vermieden wird. Darüber hinaus bleibt die ATP-Konzentration nahezu konstant, was zu linearen Zeitkursen führt. Die Fluoreszenz wird kontinuierlich überwacht, was eine einfache Abschätzung der Datenqualität ermöglicht und dabei hilft, potenzielle Artefakte herauszufiltern (z. B. durch zusammengesetzte Fällungen oder thermische Veränderungen).
Einleitung
Myosine sind mechanochemische Energiewandler, die Adenosintriphosphat (ATP) hydrolysieren, um richtungsweisende Bewegungen entlang der Filamente des Aktin-Zytoskeletts in Eukaryoten1,2zu erzeugen. Sie haben sich sowohl strukturell als auch kinetisch an ihre verschiedenen intrazellulären Funktionen angepasst, wie z.B. den Transport von Organellen, Muskelkontraktion oder die Erzeugung von Zytoskelettspannung1,2. Die Myosin-Überfamilie wird durch 40 Myosin-Gene repräsentiert, die zu 12 verschiedenen Myosin-Klassen im menschlichen Genom3<....
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Protokoll
1. Vorbereitung von Lagerlösungen und Reagenzien
- Bereiten Sie die Lagerlösung Dithiothreitol (DTT) vor, indem Sie kristallines DTT in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 1000 mM auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Aliquot und lagern bei -20 °C.
- Bereiten Sie die ATP-Lagerlösung vor, indem Sie kristallines ATP in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 mM auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Aliquot und lagern bei -20 °C.
- 10x NADH-Puffer mit 70 mM 3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM Ethylenglykol-Bis(-Aminoethylet....
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Ergebnisse
Die typische Plattenlayoutkarte, die für Screening-Experimente verwendet wird, ist in Abbildung 1dargestellt. Die erste und letzte Zeile sind für die NADH-Kalibrierung und Positivkontrolle reserviert (20 M Para-Aminoblebbistatin, 0,5% DMSO). Die übrigen Reihen (B bis O) werden verwendet, um die hemmende Aktivität von Verbindungen zu testen. Hierbei werden fünfzehnstufige serielle 1:2 Verdünnungen ab 10 mM Compoundkonzentration in DMSO vorbereitet un.......
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Diskussion
Kritische Schritte im Protokoll
Optimieren Sie das Plattenlayout, indem Sie mehrere Platten nur mit Negativkontrolle betreiben (ATPase-Reaktion ohne Inhibitor). Prüfen Sie die Ergebnisse sorgfältig auf Muster in Reaktionsgeschwindigkeiten. Diese können z. B. durch Kanteneffekte und/oder Unvollkommenheiten in der hydrophilen Oberflächenbeschichtung von "unverbindlichen" Platten entstehen. Wenn ein Muster beobachtet wird, ändern Sie den Plattentyp und/oder das Plattenlayout, um .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Neurological Disorders and Stroke und des National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 384-Well-Niedrigflansch Schwarzes Polystyrol NBS-Mikroplatte mit flachem Boden | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosin 5′-Triphosphat-Dinatriumsalzhydrat) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | ||
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Kundenspezifische Synthese |
| BSA (Rinderserumalbumin, proteasefrei) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Zentrifuge 5430 R, gekühlt, mit Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Zentrifuge 5430, ungekühlt, mit Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethylsulfoxid) | Sigma | D2650 | |
| DVB-T (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Mehrkanal-Pipette; 384-Format; 8-Kanal | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Mehrkanal-Pipette; 96-Format; 8-Kanal | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerin | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Milchsäuredehydrogenase aus Kaninchenmuskel) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesiumchlorid-Hexahydrat) | Sigma | M2670 | |
| Mikroplattenschüttler | VWR | 12620-926 | |
| Mikrotiterplatte, 384 Well, PP, Small Volume, Deep Well, natürliche | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propansulfonsäure)& | nbsp; Sigma | M1254 | |
| Myosin-Motorprotein (volle Länge) (Rinderherzmuskel) | Zytoskelett | MY03 | |
| Myosin-Motorprotein (volle Länge) (Kaninchen-Skelettmuskel) | Zytoskelett | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes Dinatriumsalzhydrat) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Natriumazid) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Natriumhydroxid) | Sigma | S8045 | |
| Optischer Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optischer Filter Fura2 380/10nm (Anregung) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optisches Modul: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 Software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Kundenspezifische Synthese |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Kundenspezifische Synthese |
| PEP (Phospho(enol)pyruvinsäure-Monokaliumsalz) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvatkinase aus Kaninchenmuskel) | Sigma | P9136 | |
| Kaninchenmuskel Aceton Pulver | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
Referenzen
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Po....
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Nachdrucke und Genehmigungen
