Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mekanistisk indsigt i udviklingen af TNBS-medieret intestinal fibrose og evaluere de hæmmende virkninger af Rapamycin

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60067
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 4, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine, Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science, University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

I denne undersøgelse beskriver vi en detaljeret procedure for TNBS-medieret intestinal fibrose, som udviser sammenlignelig Patofysiologi til Crohns fibrose. Vi diskuterer også denne tilgang i lyset af Rapamycin faciliterede hæmmende virkninger på tarm fibrose.

Abstract

Der er udført signifikante undersøgelser for at forstå effektiv behandling af tarm fibrose. Men manglen på bedre kendskab til fibrose har hindret udviklingen af et forebyggende lægemiddel. Primært, at finde en egnet dyremodel er udfordrende i forståelsen af mekanismen af Crohns-associeret tarm fibrose patologi. Her har vi vedtaget en effektiv metode, hvor TNBS kemiske eksponering for mus rectums producerer betydeligt dyb ulceration og kronisk inflammation, og musene udvikler derefter kronisk tarm fibrose. Vi beskriver også en teknik, hvor en Rapamycin injektion viser inhiberende virkning på TNBS-medieret fibrose i musemodellen. For at vurdere den underliggende mekanisme af fibrose diskuterer vi metodisk en procedure til rensning af Cx3Cr1 + celler fra lamina propria af TNBS-behandlede og kontrolmus. Denne detaljerede protokol vil være nyttige for forskere, der undersøger mekanismen af fibrose og bane vejen for at finde en bedre terapeutisk opfindelse for Crohns-associeret tarm fibrose.

Introduction

Dysregulering af immun homøostase i tarmen fører til patogene inflammation og har været almindeligt kendt for at forårsage inflammatorisk tarmsygdom (IBD)1,2. Tarm fibrose er en kronisk konsekvens af inflammatoriske tarmsygdomme (Ibd'er), såsom Crohns sygdom (CD)3. Den irreversible Patofysiologi af CD omfatter intestinal forsnævring eller stenose af fibrose, som begrænser behandlingsmuligheder, og uden medicin i øjeblikket er til rådighed, den eneste behandling er kirurgi. I sidste ende er udviklingen af effektive terapier til at imødegå uhensigtsmæssig inflammation er meget nødvendig for at studere mekanismen af CD, og dette vil føre os et skridt nærmere.

En række genetiske musemodeller er tilgængelige til at studere IBD herunder IL10 ko, SAMP/YIT og adoptiv CD45+RB høj celle overførsel til scid mus4,5,6. Her viser vi proceduren for TNBS-medieret fibrose i musemodel af CD, som er sammenlignelig med patologien af human Crohns fibrose. Den TNBS-induceret model har visse fordele. Denne model er teknisk enkel; sygdommens indtræden er hurtig, billig og kan i vid udstrækning anvendes til forskellige dyr (f. eks. mus, rotte og marsvin7). Samtidig administration af ethanol og tnb'er (2, 4, 6-trinitrobenzen sulfonsyre) beskadiger pludseligt tarm barrieren og udsætter tyktarms vævet protein til tnbs og fremkalder betydelige immunologiske reaktioner8,9. Gentagen eksponering af TNB'ER fører til en over reaktiv reparationsproces, der reagerer på inflammation og skader, og udvikler en fibrotisk reaktion i tarmen. Således, TNBS-induceret fibrose model tjener til at være en meget overbevisende model til at studere Crohns-associeret tarm fibrose.

Endvidere, mononukleiske fagocytter er de primære celler, der mægle den medfødte immunrespons på patogenesen og skade i tarmen10,11,12,13. For at belyse den cellulære mekanisme og for at etablere rollen som Cx3Cr1+ mononukleiske phagocytter i tnbs fibrose model, viser vi proceduren for rensning af mononukleske phagocytter. Analyse af Cx3Cr1+ celler er et vigtigt skridt for at vurdere de inflammatoriske markører og bestemme den samtidige mekanisme for tarm fibrose. Kollektivt, denne detaljerede procedure for TNBS fibrose vil være nyttigt at forklare de cellulære mekanismer af tarm fibrose.

Protocol

Til dette manuskript blev alle humane prøver udtaget i henhold til den godkendte protokol af Institute Review Board (IRB) og af Udvalget for human Research på Albany Medical College. Al forskning, der involverer dyr, blev strengt fulgt i henhold til den godkendte protokol af den institutionelle Dyrebehandlings-og anvendelses komité på Albany Medical College samt National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr .

1. indsamling af humane tarm prøver

  1. Indsamle humane vævsprøver i henhold til instituttets protokoller fra Forskningsudvalget.
  2. Indkøbe tarm væv (ileocolonic) af en CD patient diagnosticeret med fibrose og kontrolprøver fra patienter uden anamnese med Ibd'er.
  3. Brug en del af tarm vævet til immun histologi, en anden del af vævet til at analysere mRNA, og en sidste del for protein ekspression af fibrotiske og cytokingener/markører.
  4. For immunohistologi analyse, først fastsætte humant vævsprøve i 4% PARAFORMALDEHYD i mindst 48 h og derefter overføre det til et rør, der indeholder 70% ethanol i mindst 16 h. Brug dette faste væv til at lave en paraffin-indlejret blok og skær 5 μm tykt væv sektioner ved hjælp af en vævs mikrotom.
  5. Brug en børste til forsigtigt at sprede hvert snit på en glas slids til farvning.
  6. Plet vævs sektion slide med trikrom bejdse til påvisning af kollagen deposition, og med αSMA Stain til påvisning af myofibroblaster (Se afsnit 3 for detaljerede oplysninger om trichrome og αSMA farvning). Undersøg de farvede sektioner under et let mikroskop.
  7. Behandl en anden del af den opnåede humane vævsprøve for at gøre protein lysat detektere αSMA via Western blot (Se afsnit 7 for detaljerede oplysninger om Western blot-analyse).
  8. Få RNA fra den sidste del af humant vævsprøve ved hjælp af et ekstraktions reagens (tabel over materialer) og konverter mRNA til cDNA via RT-PCR.
  9. Analysér fibrotiske og cytokingener ved qPCR (Se afsnit 6 for detaljerede oplysninger om mRNA-præparat).

2. induktion af TNBS fibrose og Rapamycin-behandling i mus

  1. Udføre dyreforsøg i henhold til de dyre forskningsprotokoller, som institutionen har godkendt.
  2. Barberer voksne mus rundt om halsen område for at præ-sensibilisere til TNBS via dermal eksponering. Soak TNBS i en vatpind og derefter anvende TNBS til det barberede område af muse halsen.
    Bemærk: præ-sensibilisering er et meget vigtigt skridt, da det forbedrer forsinket overfølsomhedsreaktion for at initiere TNBS-medieret inflammation.
  3. Otte dage post præ-sensibilisering, inducerer colitis ved intra-rektal administration en gang om ugen i seks uger. Påfør fire mg TNBS (i 25% ethanol) ved hjælp af en 100 μL lavement via en 1 mL sprøjte fastgjort til en 3,5 fransk polyurethan kateter og give kontrol mus 100 μL af 25% ethanol kun.
    1. Anæstetize mus med pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) eller udsætte dem for 2,5% isofluran sammen med 1 L/min ilt under tnbs administration. Bekræft bedøvelsesmiddel ved forsigtigt at klemme tæer og leder efter en fravær af refleks.
  4. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens mus er under anæstesi.
  5. Injicer Rapamycin ved 2 mg/kg/dag eller køretøj (5% Tween-20 og 4% ethanol) hver ugedag i 3-6 uger, intraperitoneal, til både kontrol-og TNBS-behandlede mus.
  6. Brug 6-ugers TNBS post-behandlet mus tarm til at analysere ekstracellulære assays herunder histologi, flow cytometry, Western blotting og RNA ekstraktion. At høste organer, aflive mus ved hjælp af co2 indånding og bekræfte eutanasi med livmoderhals dislokation.
    1. At høste organer, aflive mus ved hjælp af co2 indånding og bekræfte eutanasi med livmoderhals dislokation. Efter eutanasi, i længderetningen åbne musen på sin ventrale side ved hjælp af kirurgisk kvalitet saks og pincet. Fjern hele tyktarmen fra endetarmen til det terminale ilium område. Hurtigt overføre tyktarmen til iskold 1x HBSS og vaske tyktarmen ved hjælp af samme buffer.
    2. Måle og sammenligne kolon længder af kontrol og TNBS-behandlede mus. Gør dette trin så hurtigt som muligt for at undgå at tørre ud af kolonerne for at undgå celledød.
    3. Skær tyktarmen i små stykker og holde ved-80 °C til opbevaring til fremtidige formål (RNA/Western blot analyse). Brug et andet stykke kolon til FACS analyse.
    4. Sørg for at klippe og indsamle Colon vævsprøver fra lignende områder af tyktarmen af både kontrol og tnbs-behandlede dyr.
      Bemærk: der forventes en dødelighed på 10%-20% med TNBS-inokulering, men med erfaring kan dødeligheden reduceres betydeligt.

3. immuno-histopatologisk vurdering af tarm fibrose

  1. Fix humane og/eller mus væv i 4% PARAFORMALDEHYD for 48 h, og derefter overføre til 70% ethanol for 16 h.
    Bemærk: PARAFORMALDEHYD er et neurotoksisk kemikalie, så undgå indånding; Brug en ansigtsmaske, mens du bruger den.
  2. Paraffin indlejre de faste tyktarms væv, Skive til en 5 μm tykkelse, og direkte sætte væv på glas slides for histologi.
  3. Udfør H & E og Trikrom blå farvning i henhold til producentens anvisninger til at detektere kollagen.
    1. Kortvarigt, første afparaffiniser sektioner ved at nedsænke det dias, der indeholder sektioner i to kamre af xylen i 5 min i hvert kammer.
    2. Skyl slides med 100% alkohol i 1 min; Gentag dette trin tre gange. Skyl igen med vand fra hanen i 1 min.
    3. Derefter nedsænkes slides i forvarmet Bouin opløsning ved 56 °C i 60 min. Bouin opløsning er gul i udseende; vask efter at have taget diasene ud af Bouin-opløsningen i ledningsvand i 3 minutter, eller indtil slides blev farveløs.
    4. Sænk slides i modificeret Mayer's Hematoxylin-løsning i 7 minutter ved stuetemperatur.
    5. Pletten glider ved at fordybe i Trikrom plet i 5-8 min. straks skylles slides i rindende vand til 5-10 s at fjerne overskydende Trikrom plet.
    6. Dehydrat slides med 100% alkohol i 1 min. Gentag denne procedure tre gange.
    7. Ryd slides med xylen i 1 min og Gentag trin 3x.
    8. Monter slides med monterings medie (tabel over materialer).
  4. Hold forsigtigt dæksedlen i den ene ende med pincet, og lad den dække hele afsnittet uden at have bobler. Hvis der er nogle bobler, Fjern hurtigt bobler ved at trykke på coversedlen.
  5. Brug immun farvning til at detektere αSMA.
    1. Bloker kolon sektioner i blokerende buffer (0,2% Triton X-100 og 5% normal Goat serum i 1x PBS) for 1 h ved stuetemperatur.
    2. Inkubatér med 100 μL fortyndet primært antistof for αSMA (tabel over materialer) på slide opløsningen (0,2% Triton X-100 og 3% normalt gede serum i 1x PBS; anti-αsma 1:200) ved 4 °c natten over.
    3. Vask sektionerne tre gange med 1x PBS.
    4. Brug ged anti-Mouse IgG (H + L) konjugeret med Alexa fluor 488 (tabel over materialer) som et sekundært antistof for 2 H ved stuetemperatur.
    5. Vask sektionerne tre gange med 1x PBS.
    6. Brug DAPI til at modvirke kernen i 5 min.
    7. Vask sektionerne tre gange med 1x PBS.
    8. Monter slides med fluorescerende monterings medier (tabel over materialer), og forsegl med en dækseddel ved hjælp af neglelak.
  6. Erhverve billeder ved hjælp af LSM 880 confokale mikroskop og proces billeder ved hjælp af mikroskop software.
  7. Kvantificere billeder ved at tage et gennemsnit på flere udvalgte områder i samme sektion med ImageJ.

4. isolering af tarm lamina propria og oprensning af Cx3Cr1+ mononukleiske phagocytter

  1. I længderetningen åbne tyktarmen i iskold Hank's afbalancerede salt opløsning (HBSS; Tabel over materialer) og vask tyktarmen med den samme buffer.
  2. Skær ca. 5 cm små stykker tyktarms væv ved hjælp af steril saks i HBSS.
  3. Små tyktarms vævet stykker i et 50 mL konisk rør indeholdende 10 mL præ-fordøjelses buffer (1x HBSS med 5% FBS, 5 mM EDTA og 1 mM DTT), og rystes i 20 min ved 100 rpm i en 37 °C inkubator11.
    Bemærk: inkubation af Colon tissue i 37 °c ved 100 rpm ryste tilstand giver mulighed for effektiv kollagenase væv fordøjelse og højt udbytte af levedygtige celler.
  4. Kassér løsrevet Colon epitel ved at passere gennem en 40 μm celle sien.
  5. Opsamles det resterende væv fra sien og yderligere fordøje dem i fordøjelses bufferen indeholdende Kollagenase type IV og DNase i (tabel over materialer) i 1X hbss med 5% FBS for 20 min ved 37 °c ved 100 rpm.
  6. Vortex de Ford øjede væv i ca. 20 s og passere gennem en 40 μm celle si at opnå lamina propria fraktioner.
  7. Centrifuger lamina propria fraktioner for at pille ned cellerne ved 700 x g i 4 °c
  8. At udelukke døde celler fra lamina propria bruge en tæthed gradient (tabel over materialer).
    Bemærk: densitetsgradient medier, der anvendes her (tabel over materialer) kan forårsage tab af mononukleale celler; men det fjerner i høj grad døde celler fra præparatet, som generelt øger renheden.
    1. Lav 100 mL hver af 30% og 70% tætheds gradient medie opløsninger. De opnåede celler opslæmmes i 10 mL af 30% opløsningen og overlejringen oven på 5 mL af 70% opløsningen i et 15 mL rør.
    2. Centrifuger gradient i en bremse-fri tilstand ved 1.000 x g og stuetemperatur. Saml den hvide ring fase, der indeholder lamina propria lymfocytter, som vil være mellem de 30% og 70% gradient lag.
  9. De opnåede celler vaskes ved at resuspendere i iskold HBSS og centrifugeres ved 500 x g, 20 °c, i 10 min. re-suspendere celler i FACS (Fluorescens-aktiverede celle sortering) BUFFER (PBS, pH 7,4, med 1% BSA og 2 mm EDTA).
  10. Purify mononukleske phagocytter fra de indsamlede celler rensning ved hjælp af magnetiske perler og/eller FACS sortering.
    1. Magnetisk rensning
      1. Før farvning med antistoffer, første blok celle overflade af lamina propria celler ved inkubeering med anti-Mouse CD16/CD32-FC Blocker for 15 min på is.
      2. Incubate celler med anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) antistoffer sammen med anti-PE mikroperler (tabel over materialer) for 30 min på is, at fange de bundne celler. Vask celler med FACS buffer.
      3. Pass antistof/perle bundne celler gennem en magnetisk-aktiveret celle-sortering kolonne i et magnetisk felt for at fjerne ubundne celler. Vask tre gange med FACS buffer. Fjern kolonnen fra magnetfeltet og skub stemplet i kolonnen for at give perler bundne celler.
    2. FACS sortering
      Bemærk: FACS sortering kan bruges i stedet for magnetisk rensning. Selvom magnetisk rensning er en nem og omkostningseffektiv metode, er den begrænset til kun at rense enkeltceller, ikke til subpopulationer af celler. For at isolere subpopulationer af celler er FACS-sorteringsmetoden derfor en effektiv metode til sortering af enkeltceller og subpopulationer af celler.
      1. Bloker lamina propria celler med anti-Mouse CD16/CD32-FC blocker (tabel over materialer).
      2. Plette celler ved at inkube med anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C og MHCII antistoffer.
      3. Sorter ved hjælp af en FACS flow cytometer, gating for CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- celler til at rense Cx3Cr1 (P3 + P4) befolkning.
  11. Lyse sorteret celler for total RNA forberedelse og detektere cytokin og fibrotiske markører (Se afsnit 6 for RNA og cDNA præparat).
  12. Analysér mRNA-ekspression af fibrotiske markører og inflammatorisk cytokinanalyse fra isolerede enkelt celle suspensioner fra magnetisk rensning.
  13. For FACS analyse, blokere celler med anti-Mouse CD16/CD32-FC blocker (tabel over materialer) før farvning med antistoffer mod overflade eller intracellulære markører.

5. analyse af strømnings cytometri

  1. Celle-overflade farvning og analyse
    1. Resuspension 5-10 × 105 isolerede lamina propria celler i 50 ml FACS buffer (1% BSA, 2 mm EDTA i PBS, pH 7,4).
    2. Inkuber celler med anti-Mouse CD16/CD32-(tabel over materialer) ved en 1:50 fortynding for at blokere FC-receptorer på is i 10 min.
    3. Vask cellerne med 500 μL iskold FACS buffer for at fjerne ubundet anti-CD16/CD32-før farvning af celleoverfladen.
    4. Overflade pletlet koloniske enkelt celle suspensioner (106 celler/50 ml) med fluorescerende mærket antistof ved 1:100 fortynding på is i 30 min for at evaluere Colon lamina propria.
    5. Vask mærkede celler med 500 μL iskold FACS buffer to gange for at fjerne ubundne antistoffer.
    6. Analysér mærkede mononukleare celler ved flow cytometri. Gate for Live, derefter for FSC+SSC+ efterfulgt af CD11b+ Cx3Cr1+, og derefter analysere andre MAKROFAG aktiverings MARKØRER, herunder mhcii, CD80, CD86 og CD40.
  2. Intracellulær cytokin-farvning og-analyse
    1. For intracellulær cytokin farvning, fix og permeabilize overflade-farvede celler ved hjælp af en fiksering/permeabilization løsning Kit (tabel over materialer); Følg venligst producentens anvisninger for detaljerede trin.
    2. Gate lamina propria celler til live, derefter for FSC+SSC+ efterfulgt af CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ til at detektere intracellulære niveau af IL23 cytokin og CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ til detektere intracellulært niveau af IL1β cytokin.
  3. αSMA farvning og analyse
    1. Vask celler med FACS buffer to gange ved at centrifuger ved 200 x g og 4 °c i 5 min for at fjerne overskydende fikativ buffer.
    2. For at bestemme αSMA-niveauet, permeabilize celler med en fiksering/permeabilization løsning Kit (tabel over materialer).
    3. Inkuber celler med anti-αSMA-AF488-antistoffer (tabel over materialer) ved brug af 1:1000 fortynding på is i 30 min.
    4. Vask celler to gange og derefter gøre FACS analyse. Gate for Live, FSC+SSC+ efterfulgt af påvisning af αsma+ celler i Colon celler.

6. RNA-isolation, RT-PCR, real-time PCR

  1. Isoler RNA fra MACS eller FACS renset celler eller kolon exciseret væv ved homogenisering dem i ekstraktions reagens (tabel over materialer).
    Bemærk: Brug sikkerhedsbriller og andre laboratorie beskyttelsesudstyr, når du arbejder med denne reagens, da det er en lunge-og hudirriterende. Arbejd sikkert i en hætte.
  2. Tilsæt 0,5 μL RNase-fri glykogen fra 20 μg/mL glykogen stamopløsning (tabel over materialer) for at forbedre genfinding af totalt RNA før bund FÆLDELSE af RNA med isopropanol.
  3. Resuspension af RNA-pellet i 50 μL RNase frit vand (tabel over materialer) og inkuber ved 55 °c i 5 min for at opløse RNA-ganen fuldstændigt.
  4. Se RNA-koncentrationer ved hjælp af et spektrofotometer ved 260 nm.
  5. Syntetisere cDNA ved hjælp af 1 μg total RNA og en reverse transkriptionssyntese Kit (tabel over materialer).
  6. Analysér genekspression ved hjælp af 2 μL cDNA som skabeloner via real-time PCR. Brug et 96-Well PCR Plate qPCR Master Mix-sæt (tabel over materialer). Brug CT-værdier til at beregne fold ændringen af RNA-overflod efter normalisering af GAPDH/HPRT-værdierne.

7. Western blotting

  1. Lyse tyktarms vævet ved hjælp af RIPA lysis buffer (1% NP40).
  2. Løs proteinlysat i en 8% bis-Tris gel ved en konstant spænding på 80 V.
  3. Overfør gel-protein til nitrocellulose membran (er) i kold overførings buffer, der kører ved en konstant strøm på 50 mA i 2 timer ved 4 °C.
  4. Bloker ikke-specifikke regioner på den overførte protein membran ved hjælp af 5% ikke-fedt mælk i TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) i mindst 1 h ved stuetemperatur.
  5. At detektere αsma niveauer, der inkuberes ved membran (r) med αsma primær påvisning antistof ved 4 °c natten over.
  6. Vask membraner 3-4 gange med TBST i 15 min. intervaller.
  7. Inkuber med HRP-konjugeret sekundært antistof (1:10000) i 5% ikke-fedt mælk i TBST.
  8. Udvikle membraner ved hjælp af en ECL udvikle kit.
  9. Normaliser protein signal intensiteter med GAPDH som en belastningskontrol for densitometri analyse.

8. statistisk analyse

  1. Analysér data ved hjælp af dataanalyse software valg ved at sammenligne vilde type og KO dyr.
  2. Overvej P-værdien af < 0,05 at være signifikant (* P < 0,05; * * P < 0,01; * * * P < 0,001).
  3. Brug elevens t-test til at afprøve forskellene mellem to grupper og ANOVA-test til analyse mellem mere end to grupper.

Representative Results

Vi vedtog TNBS colitis musemodel til at studere og belyse de underliggende mekanismer af tarm fibrose8. Her udførte vi en detaljeret tids kursus undersøgelse af TNBS-medieret colitis, hvor TNBS blev rektalt administreret ugentligt til vildtype mus i op til seks uger som repræsenteret skematisk (figur 1a). Efter seks ugers behandling med TNBS bemærkede vi, at koloniske længder forkortes progressivt i løbet af TNBS-behandlingen, fra et gennemsnit på 5 ± 0,5 cm i kontrolgruppen til 3 ± 0,5 cm i TNBS-gruppen; en sådan kvantitativ analyse af tyktarms længde repræsenterer en meget tydelig reduktion i tyktarms længde (figur 1B). For at sikre, at TNBS Crohns sygdomsmodel kan sammenlignes med den humane Crohns fibrose-model og ikke var en artefakt relateret til metoden, analyserede vi fibrotiske markører på flere niveauer i en detaljeret tids kursus undersøgelse for TNBS injektion til vildtype . Ophobning af alpha-glat muskel actin (αSMA) positive celler og kollagen deposition i submucosale lag er blevet rapporteret i de fleste af fibrose forekomster og betragtes som et kendetegn for fibrotiske hændelser14. Vi fandt, at tyktarmen sektioner af tnbs-behandlede mus, der var plettet med αsma viste en 4-6-fold stigning i Colon submucosa lag positivt plettet med αsma (figur 1C). Desuden viste Trichromblå farvning for disse sektioner også en 2-4-fold stigning, hvilket tyder på signifikant kollagen deposition, som validerer svær tarm fibrose (figur 1D). Vi vurderede endvidere aktiveringen af myofibroblaster ved at detektere αSMA-positive celler ved FACS-analyse i TNBS-behandlede mus Colon og fandt en signifikant akkumulering af αSMA-positiv farvning (figur 1E). Desuden fandt vi en betydelig induktion i ekspression af αSMA, Col-I, og Col-III målt ved qPCR analyse i TNBS-behandlede mus (figur 1F). Øget ekspression af αSMA-protein i Western blot-analyse afslørede øget fibrose (figur 1G). Samlet set, tnbs kinetik behandling giver en mulighed for at få adgang til formodede immunrespons i kroniske tilstande, som nøje efterligner CD kronisk fase tilstand og er afgørende for fibroseudvikling.

For at sammenligne TNBS fibrose med Crohns associerede fibrose analyserede vi ekspression af fibrose markører og cytokiner i fersk vævs biopsi fra ileum af patienter med aktiv CD eller under remission. Bemærkelsesværdigt, vi fandt markant induktion af fortykkelse af αSMA-positive lag og øget kollagen deposition som detekteret af trikrom farvning i aktive CD sektioner (figur 2A). Vi udførte også Western blot-analyse og bekræftede induktion af αSMA-ekspression i aktive CD-prøver (figur 2B). Derudover observerede vi signifikant induktion af fibrose markører, herunder αSMA, Kol1, som påvist ved qPCR-analyse (figur 2C).

Næste, at bestemme en mekanisme til at begrænse tnbs fibrose vi evalueret virkningerne af Rapamycin, en farmakologisk hæmmer af MTOR aktivitet15,16. Derfor behandlede vi mus med både TNBS og Rapamycin og analyserede αSMA-og kollagen-niveauet i tyktarms histologi og har vist kvantitativ måling af αSMA og kollagen i densitometriske plot (figur 3A). Vores data tyder på, at Rapamycin reducerer den αSMA-positive farvning i submucosale lag og mindsker kollagen deposition. For yderligere at validere og kvantificere fibrotiske reaktioner fastsatte vi αSMA-, kollagen-og TGFβ-udtrykkene af qPCR og αSMA-ekspression ved flowcytometri i TNBS-behandlede kolon (figur 3B, 3c). Vi har også vist Cx3Cr1+ mononukleiske fagocytter inducere en inflammatorisk immunrespons på skade9. Således ønskede vi at se, om administration af Rapamycin i TNBS-behandlede mus kunne vende de inflammatoriske og fibrotiske virkninger. Derfor, vi renset Cx3Cr1+ residente mononukleiske phagocytter fra Colon enkelt celle suspensioner ved hjælp af magnetiske mikroperler (figur 3D). Vi fandt et forhøjet niveau af p-P70 og p-S6 i Cx3Cr1+ residente mononukleiske phagocytter ved Western blot analyse fra tnbs-behandlede mus, og dette niveau blev blokeret af Rapamycin (figur 3E). Desuden fandt vi, at Rapamycin behandling dæmper IL-23 og IL-1β i den TNBS-behandlede gruppe (figur 3F). Desuden er disse fund belyse den effektive mekanisme, der er involveret i induktion af TNBS-fibrose og har vist, at Rapamycin dæmper induktion af fibrose.

Figure 1
Figur 1: vellykket TNBS administration fører til udvikling af tarm fibrose i mus. A. skematisk diagram repræsentation af ugentlige tnbs behandling givet til vild-type mus. B. kolon billeder og måling af kolon længder fra tnbs-behandlede mus, høstet i uge 0, 2, 4, og 6 post-TNSB behandling. C-D. Kolon sektioner ' histologisk analyse farvet med anti-αSMA-antistof til aktivering af myofibroblaster og trikrom blå farvning for kollagen; skala bjælke 100 μm. E. FACS analyse til at identificere αSMA-positive celler i tyktarmen og kvantificering af αSMA-positive celler. F. fibrotiske markører og cytokiner påvist ved qPCR. G. Western blot analyse af αsma fra Colon LYSAT af tnbs-behandlede og kontrol mus. Dette modificerede tal genbruges med tilladelse fra tidligere publikation9 i mucosal immunologi, 2019 af Mathur et al. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: TNBS fibrose er sammenlignelig med Crohns associerede tarm fibrose. A. repræsentative billeder af kolon biopsier af kontrol, aktiv cd viser en betydelig stigning af trikrom blå farvning og αsma-positiv farvning i submucosale lag, skala bar 50 μm. B. Western blot analyse af αSMA udtryk og kvantificering. C. qPCR-analyse af fibrotiske markører og cytokiner. Dette modificerede tal genbruges med tilladelse fra tidligere publikation9 i mucosal immunologi, 2019 af Mathur et al. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: behandling med Rapamycin effektivt Amelio tnbs-induceret fibrose. A. kolon histologisk analyse-repræsentative billeder af myofibroblast farvning med anti-αsma-antistof og kollagen farvning med trikrom blå, skala bar 100 μm. B. qPCR analyse af αsma, kollagen og tgfβ udtryk i kontrol/ TNBS-behandlede muse koloner. C. FACS analyse af αsma i enkelt cellesuspension fra mus kolon behandlet med kontrol/tnbs. D. skematisk til rensning af Cx3Cr1+ celler fra Colon lamina propria fraktion og FACS analyse af rensede celler. E. Western blot analyse af p-P70 og p-S6 niveauer i rensede Cx3Cr1 + mononukleiske phagocytter fra mus behandlet med tnbs og/eller Rapamycin. F. qPCR-analyse af ekspression i rensede Cx3Cr1 + mononukleiske phagocytter, som producerer Il-23 og Il-1β. Dette modificerede tal genbruges med tilladelse fra tidligere publikation9 i mucosal immunologi, 2019 af Mathur et al. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Sårheling eller vævsreparation er en tæt reguleret biologisk proces17. Under vævsskade med en kemisk, mekanisk og infektion tilstand, en inflammatorisk respons udløser vævs reparationsprocessen. Men en dysreguleret og patologisk inflammatorisk respons fører til udvikling af ardannelse eller en fibrotisk reaktion, som kan forringe vævs reparationsfunktionen9,18,19. Her viser vi proceduren for den TNBS-inducerede fibrose dyremodel, som i betydelig grad deler Patofysiologi med human Crohns sygdom. Efterfølgende inokulering af TNBS kemisk udsættelse for beskadigelse af muse epitelet forårsager dybe sår og inducerer fibroseudvikling. Med en pålidelig, lav pris, og hurtig induktion af sygdommen debut, denne metode er bredt accepteret af flere forskningsgrupper involveret i undersøgelser for vævsskade, transmural inflammation og tarm-hjerne akse.

For at implementere TNBS fibrose-modellen med succes er der flere vigtige trin. For eksempel, tilstrækkelig dosering og timing af TNBS administration er meget vigtige. En 6-8-ugers TNBS inokulation giver mulighed for dyb vævs ulceration og anbefales stærkt til kroniske fibrotiske undersøgelser. Outcoming afføring fra mus og retrograd refleks af inokulerede TNB'ER er to store problemer, som kan resultere i levering af variable doser til mus. Forsigtigt tryk nær musene endetarmen kan hjælpe med at frigive afføring før administration af tnbs. Holde hovedet af dyret ned i et par sekunder dramatisk hjælper med at stoppe reverse refluks af tnbs. Holde musene i et bur, placere buret på en varmepude, og give musene med Napa nektar kunne også være nyttige strategier for at forhindre høj dødelighed.

Her diskuterer vi også tarmbetændelse under TNBS fibrose og deres indvirkning på fibrotisk respons. MTOR/autophagy rolle er stort set impliceret i intestinal homøostase og i IBD patogenesen20,21. Vi identificerede, at mTOR/autophagy signalering er afgørende for at modutere pro-inflammatoriske reaktioner fra IL-23 og IL1β cytokiner fra Cx3Cr1+ mononukleiske phagocytter, der påvirker Pro-FIBROTISK Il-23/Il-22 akse (figur 3A)9 . Derved er rensning af enkelt Cx3Cr1+ mononukleare celler til immunoproarkivering og genekspression et kritisk trin i modellen. Vi diskuterer i detaljer protokollen til isolering af lamina propria og giver rensningsproceduren for Cx3Cr1+ mononukleare celler ved hjælp af magnetiske perler.

Kollektivt, på trods af tilstedeværelsen af genetiske og spontane modeller for Crohns sygdom, TNBS-colitis er fortsat et potent værktøj til at studere immuno-patogenesen af CD og har potentiale til at evaluere Crohns fibrose behandlinger. Den største begrænsning ved brug af kemisk inducerede fibrose modeller som TNBS er chancen for stor variation fra bruger til bruger og muligheden for afvigende data. En stikprøvestørrelse på 5-8 dyr pr. gruppe sammen med større brugeroplevelse kan øge konsistensen af modellen. Men at finde en passende genetisk model forårsager spontan Crohns fibrose er og vil altid være berettiget.

Disclosures

Konkurrerende interesser: Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant R01NS093045 (Y.H.), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.) og Crohns & colitis Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 e-bioscience 53-9760-82
Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 e-bioscience 149760-80
Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 Biolegend Inc 101226
Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 Biolegend 149006
Anti-mouse purified CD16/32 Fc block Biolegend Inc 14-9760-80
Anti-PE MicroBeads Miltenyi 130-105-639
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody e-bioscience 7074
Bovine Serum Albumin InvivoGen tlrl-isdn
Collagenase type IV Roche 1088866001
DAPI SIGMA D9542
DMEM Corning 10013-CV
DNase I from bovine pancreas Roche D263-5vl
Falcon® 40µm Cell Strainer Corning 352340
Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit BD Bioscience 555028
FlowJo FlowJo LLC www.flowjo.com
Glycogen Roche 10901393001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate e-bioscience 5018
Graphpad Prism 7 GraphPad Software Inc www.graphpad.com
H&E kit American Mastertech Kit HXMMHPT
Image J NIH www.imagej.nih.gov/ij/
Mouse: C57BL/6J Jackson Laboratories 664
MS Columns Miltenyi 130-042-201
Percol GE Healthcare 17-0891-01
PMA/Ionomycin salt Sigma P8139
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermofisher A25777
Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 Cell signaling 5174
Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 Cell signaling 2708
Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 Cell signaling 9208
Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E Cell signaling 4858
Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein Cell signaling 2217
Rapamycin LC LABORATORIES 1003799
TNBS Sigma 92823
Trichorme staining kit American Mastertech Kit STOSTBPT
TRIzol Life technologies 15596018
Verso cDNA Synthesis Kit Thermofisher AB1453B
Zen black 2.1 Carl Zeiss www.zeis.com
Zen blue lite 2.3 Carl Zeiss www.zeis.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140, 859-870 (2010).
  2. Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
  3. Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
  4. Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
  5. Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
  6. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
  7. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
  8. Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
  9. Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
  10. Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
  11. Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
  12. Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
  13. Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
  14. Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
  15. Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
  16. Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
  17. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
  18. Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
  19. Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
  20. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
  21. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).

Tags

Immunologi og infektion TNBS-medieret tarm fibrose Crohns sygdom inflammation Rapamycin autophagy hjemmehørende makrofag genekspression
Mekanistisk indsigt i udviklingen af TNBS-medieret intestinal fibrose og evaluere de hæmmende virkninger af Rapamycin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X.… More

Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X. F., Huang, Y., Zhu, X. Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin. J. Vis. Exp. (151), e60067, doi:10.3791/60067 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter