Summary
Neste estudo, nós descrevemos um procedimento detalhado da fibrose intestinal TNBS-negociada, que exibe a patofisiologia comparável à fibrose de Crohn. Nós igualmente discutimos esta aproximação à luz do rapamicina facilitamos efeitos inibitórios na fibrose intestinal.
Abstract
Foram realizados estudos significativos para compreender a gestão eficaz da fibrose intestinal. No entanto, a falta de melhor conhecimento da fibrose tem dificultado o desenvolvimento de um fármaco preventivo. Principalmente, encontrar um modelo animal adequado é desafiador na compreensão do mecanismo da patologia de fibrose intestinal associada à doença de Crohn. Aqui, nós adotamos um método eficaz onde a exposição química de tnbs aos RECOS dos ratos produz ulceração substancialmente profundo e inflamação crônica, e os ratos então desenvolvem cronicamente a fibrose intestinal. Também, nós descrevemos uma técnica onde uma injeção do rapamicina mostre efeitos inibitórios na fibrose tnbs-negociada no modelo do rato. Para avaliar o mecanismo subjacente da fibrose, nós discutimos metodicamente um procedimento para purificante pilhas de Cx3Cr1 + do própria do lamina de camundongos tnbs-tratados e de controle. Este protocolo detalhado será útil para os pesquisadores que estão investigando o mecanismo de fibrose e pavimentar o caminho para encontrar uma melhor invenção terapêutica para a fibrose intestinal associada à doença de Crohn.
Introduction
A desregulação da homeostase imune no intestino leva à inflamação patogênica e tem sido amplamente conhecida por causar doença inflamatória intestinal (IBD)1,2. A fibrose intestinal é uma consequência crônica de doenças inflamatórias intestinais (DII), como a doença de Crohn (DC)3. A fisiopatologia irreversível da DC inclui estenose intestinal ou estenoses de fibrose, o que limita as opções de tratamento, e sem medicamentos atualmente disponíveis, o único tratamento é a cirurgia. Em última análise, o desenvolvimento de terapias eficazes para combater a inflamação inadequada é muito necessário para estudar o mecanismo de CD, e isso vai nos levar um passo mais perto disso.
Uma variedade de modelos genéticos do rato está disponível para estudar IBD que inclui IL10 ko, SAMP/yit e transferência de pilha elevada adoptiva de CD45+RB em ratos de scid4,5,6. Aqui, nós mostramos o procedimento para a fibrose TNBS-negociada no modelo do rato do CD, que é comparável à patologia da fibrose de Crohn humana. O modelo induzido por TNBS tem certas vantagens. Este modelo é tecnicamente simples; o início da doença é rápido, barato, e poderia extensamente ser usado em animais diferentes (por exemplo, rato, rato e cobaia7). A coadministração de etanol e tnbs (2, 4, 6-trinitrobenzeno sulfônico Acid) danifica abruptamente a barreira intestinal e expõe a proteína do tecido do cólon para tnbs e elicita respostas imunológicas substanciais8,9. A exposição repetida de tnbs conduz a um processo de reparo exagerar que responde à inflamação e ao ferimento, e desenvolve uma reação fibrótica no intestino. Assim, o modelo de fibrose induzida por TNBS serve para ser um modelo muito convincente para estudar a fibrose intestinal associada a Crohn.
Além disso, os fagócitos mononucleares são as células primárias que arbitram a resposta imune inata à patogênese e lesão no intestino10,11,12,13. Para elucidar o mecanismo celular e estabelecer o papel dos fagócitos Cx3Cr1+ mononucleares no modelo de fibrose tnbs, mostramos o procedimento de purificação dos fagócitos mononucleares. A análise das células Cx3Cr1+ é um passo essencial para avaliar os marcadores inflamatórios e determinar o mecanismo concomitante de fibrose intestinal. Coletivamente, este procedimento detalhado para a fibrose de TNBS será útil explicar os mecanismos celulares da fibrose intestinal.
Protocol
Para este manuscrito, todas as amostras humanas foram adquiridas de acordo com o protocolo aprovado pelo Conselho de revisão do Instituto (IRB) e pela Comissão de pesquisa humana na faculdade de medicina de Albany. Todas as pesquisas envolvendo animais foram rigorosamente seguidas de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina de Albany, bem como o guia nacional de institutos de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório .
1. coleção de espécimes intestinais humanos
- Colete amostras de tecido humano de acordo com os protocolos do Comitê de pesquisa da instituição.
- Adquira o tecido intestinal (ileocolonic) de um paciente CD diagnosticado com a fibrose e as amostras de controle dos pacientes sem a história de IBDs.
- Use parte do tecido intestinal para a imunohistologia, uma outra parte do tecido para analisar o mRNA, e uma parte final para a expressão da proteína de genes/marcadores fibrótica e do citocinas.
- Para a análise de imunohistologia, primeiro fixar a amostra de tecido humano em 4% paraformaldeído para pelo menos 48 h e, em seguida, transferi-lo para um tubo contendo 70% etanol por pelo menos 16 h. Use este tecido fixo para fazer um bloco embebido em parafina e corte 5 μm de tecido grosso secções utilizando um micrótomo tecidual.
- Usando uma escova, espalhe delicadamente para fora cada seção do corte em uma corrediça de vidro para manchar.
- Deslize a lâmina da seção do tecido com mancha do Tricrômico para detectar o depósito do colagénio, e com a mancha do αsma para detectar miofibroblastos (veja a seção 3 para a informação detalhada sobre o Tricrômico e a coloração de αsma). Examine as secções manchadas um microscópio de luz.
- Processe outra parte da amostra de tecido humano obtida para fazer o lisado da proteína para detectar o αsma através do borrão ocidental (veja a seção 7 para a informação detalhada sobre a análise ocidental do borrão).
- Obter RNA da parte final da amostra de tecido humano usando um reagente de extração (tabela de materiais) e converter mRNA em cDNA via RT-PCR.
- Analise genes fibróticos e citocinas por qPCR (ver seção 6 para obter informações detalhadas sobre a preparação de mRNA).
2. indução de fibrose TNBS e tratamento da rapamicina em camundongos
- Realizar pesquisas de animais de acordo com os protocolos de pesquisa animal aprovados pela instituição.
- Barbear ratos adultos ao redor da área do pescoço, a fim de pré-sensibilização para TNBS através da exposição cutânea. Mergulhe TNBS em um cotonete de algodão e, em seguida, aplique TNBS para a área raspada do pescoço do mouse.
Nota: a pré-sensibilização é um passo muito importante, uma vez que melhora a resposta de hipersensibilidade tardia para iniciar a inflamação mediada por TNBS. - Oito dias após a pré-sensibilização, induzem a colite por administração intra-retal uma vez por semana durante seis semanas. Aplique quatro mg de TNBS (em etanol a 25%) utilizando um enema de 100 μL através de uma seringa de 1 mL ligada a um cateter de poliuretano francês 3,5 e dê aos ratos de controlo 100 μL de etanol a 25% apenas.
- Anestesiam camundongos com pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) ou expõem-nos a 2,5% de isoflurano, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a administração de TNBS. Confirme a anestesia delicadamente beliscando os dedos do pé e procurando uma ausência de reflexo.
- Use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura enquanto os ratos estão anestesia.
- Injetar rapamicina a 2 mg/kg/dia ou veículo (5% Tween-20 e 4% etanol) todos os dias da semana para 3-6 semanas, intraperitoneal, para ambos os controles e camundongos tratados com TNBS.
- Use 6 semanas TNBS pós-tratado intestino camundongos para analisar os ensaios extracelulares, incluindo histologia, citometria de fluxo, western blotting e extração de RNA. Para colher órgãos, eutanizar camundongos usando CO2 inalação e confirmar eutanásia com luxação cervical.
- Para colher órgãos, eutanizar camundongos usando CO2 inalação e confirmar eutanásia com luxação cervical. Após a eutanásia, abra longitudinalmente o rato em seu lado ventral usando tesouras da classe cirúrgica e fórceps. Remova o cólon inteiro do reto para a área de Ilium terminal. Transfira rapidamente os dois pontos ao gelo-frio 1x HBSS e lave os dois pontos usando o mesmo amortecedor.
- Meça e compare os comprimentos do cólon do controle e dos camundongos tratados com TNBS. Faça esta etapa tão rapidamente como possível para evitar secar fora dos dois pontos a fim evitar mortes da pilha.
- Corte os dois pontos em pedaços pequenos e mantenha a-80 ° c para o armazenamento para finalidades futuras (análise do RNA/Western blot). Use outra parte do cólon para análise FACS.
- Certifique-se de cortar e recolher amostras de tecido Colônico de regiões semelhantes do cólon de ambos os animais tratados com TNBS e controle.
Nota: uma mortalidade de 10% a 20% é esperada com a inoculação de TNBS, embora com experiência, a taxa de mortalidade pode ser significativamente reduzida.
3. avaliação imuno-histopatológica da fibrose intestinal
- Corrigir tecidos humanos e/ou camundongos em 4% paraformaldeído para 48 h, e depois transferir para 70% etanol por 16 h.
Nota: paraformaldeído é um produto químico neurotóxico para evitar inalar; usar uma máscara facial ao usá-lo. - A parafina incorpora os tecidos fixos dos dois pontos, fatia a uma espessura de 5 μm, e põr diretamente os tecidos sobre corrediças de vidro para a histologia.
- Realize a coloração de H & e e trichrome Blue de acordo com as instruções do fabricante para detectar colágeno.
- Brevemente, primeiro desparaffinize seções submergindo o slide contendo seções em duas câmaras de xileno por 5 min em cada câmara.
- Enxágüe lâminas com álcool 100% por 1 min; Repita este passo três vezes. Enxague novamente com água da torneira durante 1 min.
- Depois disso, mergulhe as lâminas na solução de Bouin pré-aquecida a 56 ° c por 60 min. a solução de Bouin é amarela na aparência; Lave depois de tirar os slides da solução de Bouin em água da torneira por 3 min ou até que as lâminas se tornaram incolor.
- Mergulhe as lâminas na solução de hematoxilina de Mayer modificada por 7 min à temperatura ambiente.
- Lâminas de mancha por imersão em trichrome mancha por 5-8 min. imediatamente, enxaguar slides em água corrente para 5-10 s para remover o excesso de mancha de trichrome.
- Deshidratar slides com 100% de álcool por 1 min. Repita este procedimento três vezes.
- Limpar slides com xileno por 1 min e repita o passo 3x.
- Montagem de slides com suportes de montagem (tabela de materiais).
- Segure com cuidado a lamínula em uma extremidade com fórceps e deixe-a cobrir a seção inteira sem ter nenhumas bolhas. Se houver algumas bolhas, remova rapidamente as bolhas tocando na lamínula.
- Use imunocoloração para detectar αSMA.
- Bloqueie as secções do cólon no tampão de bloqueio (0,2% Triton X-100 e 5% de soro de cabra normal em 1X PBS) durante 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar com 100 μL de anticorpo primário diluído para αSMA (tabela de materiais) na solução de slides (0,2% Triton X-100 e 3% de soro de cabra normal em 1X PBS; anti-αsma 1:200) a 4 ° c durante a noite.
- Lave as secções três vezes com 1X PBS.
- Use a cabra anti-mouse IgG (H + L) conjugada com Alexa fluor 488 (tabela de materiais) como um anticorpo secundário para 2 H à temperatura ambiente.
- Lave as secções três vezes com 1X PBS.
- Use DAPI para neutralizar o núcleo por 5 min.
- Lave as secções três vezes com 1X PBS.
- Monte corrediças com suportes de montagem fluorescentes (tabela dos materiais), e selo com um lamela usando o lustrador de prego.
- Adquira imagens usando o microscópio confocal do LSM 880 e as imagens do processo usando o software do microscópio.
- Quantifique imagens tomando uma média de várias áreas selecionadas na mesma seção com o ImageJ.
4. isolação do própria intestinal do lamina e da purificação de fagócitos de Cx3Cr1+ mononucleares
- Abra longitudinalmente os dois pontos no gelo-frio solução de sal equilibrado de Hank (HBSS; Tabela de materiais) e lave os dois pontos com o mesmo tampão.
- Corte cerca de 5 cm pequenos pedaços de tecidos de cólon usando tesouras estéreis em HBSS.
- Transfira partes pequenas do tecido do cólon em um tubo cónico de 50 mL que contem 10 mL do amortecedor da pre-digestão (1x HBSS com 5% FBS, 5 milímetros de EDTA e de 1 milímetro DTT), e agitar por 20 minutos em 100 RPM em uma incubadora de 37 ° c11.
Nota: a incubação do tecido Colônico em 37 ° c em 100 RPM que agita a condição permite a digestão eficiente do tecido do colagenase e o rendimento elevado de pilhas viáveis. - Descarte o epitélio Colônico destacado passando por um filtro de células de 40 μm.
- Recolher o tecido remanescente do filtro e digeri-los em tampão de digestão contendo Collagenase tipo IV e DNase I (tabela de materiais) em 1x HBSS com 5% FBS por 20 min a 37 ° c a 100 RPM.
- Vórtice os tecidos digeridos por aproximadamente 20 s e passe através de um filtro de células de 40 μm para obter frações própria de lâmina.
- Centrifugue as frações da lâmina própria para a pelota para baixo as pilhas em 700 x g em 4 ° c
- Para excluir as células mortas da lâmina própria use um gradiente de densidade (tabela de materiais).
Nota: a mídia de gradiente de densidade usada aqui (tabela de materiais) pode causar perda de células mononucleares; no entanto, ele remove muito as células mortas da preparação, que aumenta globalmente a pureza.- Faça 100 mL cada uma das soluções de mídia de gradiente de densidade de 30% e 70%. Suspender as células obtidas em 10 mL da solução de 30% e sobrepor-se em cima de 5 mL da solução de 70% em um tubo de 15 mL.
- Centrifugue o gradiente em uma condição livre de freio em 1.000 x g e temperatura ambiente. Colete a fase do anel branco contendo linfócitos da lâmina própria, que será entre as camadas de gradiente de 30% e 70%.
- Lave as células obtidas por re-suspendendo no gelo-frio HBSS e centrífuga em 500 x g, 20 ° c, por 10 min. re-suspender as células em FACS (fluorescência-ativado célula de triagem) tampão (PBS, pH 7,4, com 1% BSA e 2 mm EDTA).
- Purify os fagócitos mononucleares da purificação das pilhas coletadas usando grânulos magnéticos e/ou classificação de FACS.
- Purificação magnética
- Antes de manchar com anticorpos, primeira superfície da pilha do bloco de pilhas do própria do lamina incubando com o bloqueador do anti-rato CD16/CD32 FC por 15 minutos no gelo.
- Incubar as células com anticorpos anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) juntamente com microgrânulos anti-PE (tabela de materiais) por 30 min no gelo, para capturar as células ligadas. Lave as células com o tampão FACS.
- Passar as células de anticorpo/talão ligado através de uma coluna de classificação de célula magnética ativada em um campo magnético para remover células não acopladas. Lave três vezes com o tampão FACS. Retire a coluna do campo magnético e empurre o êmbolo na coluna para produzir células ligadas ao cordão.
- Classificação FACS
Nota: a classificação de FACS pode ser usada no lugar da purificação magnética. Embora a purificação magnética seja um método fácil e rentável, limita-se apenas a purificar células únicas, não para subpopulações de células. Portanto, para isolar subpopulações de células, o método de classificação FACS é um método eficaz de classificação de células únicas, bem como subpopulações de células.- Obstrua pilhas do própria do lamina com o bloqueador do anti-rato CD16/CD32 FC (tabela dos materiais).
- Células de mancha incubando com anticorpos CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, e MHCII.
- Classifique usando um cytometer do fluxo de FACS, gating para CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- Cells para purificar a população de Cx3Cr1 (P3 + P4).
- Purificação magnética
- Lyse ordenou pilhas para a preparação total do RNA e detecte marcadores do citocinas e do fibrótica (veja a seção 6 para a preparação do RNA e do cDNA).
- Analise a expressão de mRNA dos marcadores fibrótica e da análise inflamatório do citocinas das suspensões isoladas da único-pilha da purificação magnética.
- Para análise de FACS, bloqueie as células com bloqueador de FC CD16/CD32 (tabela de materiais) antes de se manchar com anticorpos contra marcadores superficiais ou intracelulares.
5. análise de citometria de fluxo
- Coloração e análise de superfície celular
- Resuspend 5-10 × 105 células isoladas da lâmina própria em 50 ml de tampão FACS (1% BSA, 2 mm EDTA em PBS, pH 7,4).
- Incubar células com anti-mouse CD16/CD32 (tabela de materiais) em uma diluição 1:50 para bloquear receptores FC no gelo por 10 min.
- Lave as células com 500 μL de tampão FACS gelado para remover o anti-CD16/CD32 não acoplado antes da coloração da célula-superfície.
- Suspensões colónicas da único-pilha da mancha de superfície (106 Cells/50 ml) com o anticorpo fluorescente-etiquetado na diluição 1:100 no gelo por 30 minutos para avaliar a propria Colônica do lamina.
- Lave as células rotuladas com 500 μL de tampão FACS gelado duas vezes para remover anticorpos não acoplados.
- Analise células mononucleares rotuladas por citometria de fluxo. Portão para viver, então para FSC+SSC+ seguido por CD11b+ Cx3Cr1+e, em seguida, analisar outros marcadores de ativação de macrófago, incluindo mhcii, CD80, CD86 e CD40.
- Coloração e análise de citocinas intracelulares
- Para a coloração de citocinas intracelulares, fixar e permeabilizar as células manchadas de superfície usando um kit de solução de fixação/permeabilização (tabela de materiais); por favor, siga as instruções do fabricante para obter etapas detalhadas.
- Pilhas da lâmina própria da porta para vivo, então para FSC+SSC+ seguido por CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ para detectar o nível intracelular de IL23 citocinase CD11b + Cx3Cr1 + IL1β+ a detectam níveis intracelulares de citocinas IL1β.
- coloração e análise de αSMA
- Lave as células com tampão FACS duas vezes por centrifugação a 200 x g e 4 ° c por 5 min para remover o excesso de tampão fixador.
- Para determinar o nível αSMA, permeabilize as células com um kit de solução de fixação/permeabilização (tabela de materiais).
- Incubar células com anticorpo anti-αSMA-AF488 (tabela de materiais) usando 1:1000 de diluição no gelo por 30 min.
- Lave as células duas vezes e, em seguida, fazer análise FACS. Portão para Live, FSC+SSC+ seguido pela detecção de αsma+ células em células colônicas.
6. isolação do RNA, RT-PCR, PCR do tempo real
- Isolar o RNA de MACS ou FACS células purificadas ou cólon extirpado tecido homogeneizando-os em reagente de extração (tabela de materiais).
Nota: Use óculos de segurança e outros equipamentos de proteção de laboratório ao trabalhar com este reagente, pois é um irritante do pulmão e da pele. Trabalhe com segurança em um capô. - Adicionar 0,5 μL de glicogênio livre de RNase de 20 μg/mL de solução de glicogênio (tabela de materiais) para melhorar a recuperação do RNA total antes da precipitação do RNA com isopropanol.
- Ressuscitem o RNA pellet em 50 μL de água livre de RNase (tabela de materiais) e incubar a 55 ° c por 5 min para dissolver completamente o palato de RNA.
- Leia as concentrações de RNA utilizando um espectrofotômetro a 260 nm.
- Sintetizar cDNA usando 1 μg de RNA total e um kit de síntese de transcrição reversa (tabela de materiais).
- Analise a expressão gênica usando 2 μL de cDNA como modelos via PCR em tempo real. Use um 96-bem PCR placa qPCR Master Mix Kit (tabela de materiais). Use os valores de TC para calcular a mudança de dobra da abundância de RNA após normalizar os valores de GAPDH/HPRT.
7. western blotting
- Tecido de cólon lise usando tampão de Lise RIPA (1% NP40).
- Resolva o lisado da proteína em um gel de bis-Tris de 8% em uma tensão constante de 80 V.
- Transferência de gel-proteína para membrana de nitrocelulose (s) em tampão de transferência a frio rodando a uma corrente constante de 50 mA para 2 h a 4 ° c.
- Bloquear regiões não específicas na membrana transferida de proteínas utilizando 5% de leite não gordo em TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0, 5% Tween-20) durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
- Para detectar níveis de αSMA, incubar membrana (s) com anticorpo de detecção primária αSMA a 4 ° c durante a noite.
- Lave as membranas 3-4 vezes usando TBST em intervalos de 15 min.
- Incubar com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:10000) em 5% de leite não gordo em TBST.
- Desenvolva membranas usando um kit de desenvolvimento ECL.
- Normalize intensidades do sinal da proteína com GAPDH como um controle do carregamento para a análise da densitometria.
8. análise estatística
- Analise os dados usando o software de análise de dados de escolha, comparando entre o tipo selvagem e animais KO.
- Considerar o valor de P de < 0,05 para ser significante (* P < 0, 5; * * P < 0, 1; * * * P < 0, 1).
- Use o teste t de Student para testar as diferenças entre dois grupos e o teste ANOVA para análise entre mais de dois grupos.
Representative Results
Nós adotamos o modelo do rato da colite de TNBS para estudar e elucidar os mecanismos subjacentes da fibrose intestinal8. Aqui, nós executamos um estudo detalhado do curso do tempo da colite TNBS-negociada, onde TNBS estêve administrado rectal semanal aos ratos do tipo selvagem por até seis semanas como representado esquematicamente (Figura 1a). Após seis semanas de tratamento com TNBS, observou-se que os comprimentos colônicos encurtam progressivamente ao longo do tratamento com TNBS, a partir de uma média de 5 ± 0,5 cm no grupo controle para 3 ± 0,5 cm no grupo TNBS; Essa análise quantitativa do comprimento do cólon representa uma redução muito aparente do comprimento do cólon (Figura 1B). Para garantir que o modelo de doença de Crohn do TNBS é comparável ao modelo de fibrose humana de Crohn e não foi um artefato relacionado à metodologia, analisamos os marcadores fibróticos em vários níveis em um estudo detalhado do curso de tempo para a injeção de TNBS para o tipo selvagem . A acumulação de pilhas positivas do actínio do músculo alfa-liso (αsma) e a deposição do colagénio dentro das camadas submucosal foram relatadas em a maioria das incidências da fibrose e são consideradas como uma indicação para eventos fibrótica14. Nós encontramos que as seções dos dois pontos de camundongos TNBS-tratados que foram manchadas com o αSMA mostraram um aumento 4-6-fold na camada relativa ao cólon da submucosa manchada positivamente com o αSMA (Figura 1C). Além disso, a coloração azul Tricrômico para essas seções também mostrou um aumento de 2-4 vezes, sugerindo deposição significativa de colágeno, que valida a fibrose intestinal grave (Figura 1D). Nós avaliamos mais a ativação dos miofibroblastos detectando pilhas de αsma-positivas pela análise de FACS em dois pontos dos ratos tnbs-tratados e encontramos uma acumulação significativa de coloração de αsma-positive (Figura 1e). Além disso, constatou-se indução substancial na expressão de αSMA, Col-I e col-III mensuradas pela análise de qPCR em camundongos tratados com TNBS (Figura 1F). A expressão aumentada da proteína de αSMA na análise ocidental do borrão revelou a fibrose aumentada (Figura 1G). Globalmente, o tratamento da cinética do TNBS oferece uma oportunidade para acessar a resposta imune putativa em condições crônicas, que imita de perto a condição de fase crônica do CD e é essencial para o desenvolvimento da fibrose.
Para comparar a fibrose do TNBS com a fibrose associada de Crohn, analisamos a expressão de marcadores de fibrose e citocinas em biópsia de tecido fresco do íleo de pacientes com CD ativo ou remissão. Notàvel, nós encontramos a indução marcada do engrossamento de camadas αsma-positivas e o depósito aumentado do colagénio como detectado pela mancha do Tricrômico em seções ativas do CD (Figura 2A). Também realizamos a análise de Western blot e confirmamos a indução da expressão de αSMA em amostras de CD ativas (Figura 2B). Além disso, observou-se indução significativa de marcadores de fibrose, incluindo αSMA, Col1, como detectado pela análise de qPCR (Figura 2C).
Em seguida, para determinar um mecanismo para limitar a fibrose tnbs avaliamos os efeitos da rapamicina, um inibidor farmacológico da atividade do mTOR15,16. Nesse sentido, tratamos camundongos com TNBS e rapamicina e analisamos A αSMA e o nível de colágeno na histologia do cólon e mostramos mensuração quantitativa de αSMA e colágeno no gráfico de densitometria (Figura 3A). Nossos dados sugerem que o rapamicina reduza a coloração de αsma-positive na camada submucosal e diminua a deposição do colagénio. Para validar e quantificar ainda mais as respostas fibróticas, determinamos as expressões αSMA, colágeno e TGFβ por qPCR e expressão de αSMA por citometria de fluxo em cólon tratado com TNBS (Figura 3B, 3C). Nós mostramos também Cx3Cr1+ os fagócitos mononucleares induzem uma resposta imune inflamatório à lesão9. Assim, nós queríamos ver se a administração de rapamicina em camundongos tnbs-tratados poderia reverter os efeitos inflamatórios e fibróticos. Conseqüentemente, nós purificamos os fagócitos mononucleares residentes de Cx3Cr1+ das suspensões Colônica da única pilha usando microesferas magnéticos (Figura 3D). Nós encontramos um nível aumentado de p-P70 e de p-S6 em Cx3Cr1+ fagócitos mononucleares residentes pela análise ocidental do borrão dos ratos tnbs-tratados, e este nível foi obstruído pelo rapamicina (Figura 3e). Além disso, verificou-se que o tratamento com rapamicina amortece os IL-23 e IL-1 β no grupo tratado com TNBS (Figura 3F). Além disso, estes resultados elucidar o mecanismo eficaz envolvido na indução de tnbs-fibrose e mostraram que o rapamicina atenua a indução da fibrose.
Figura 1: a administração bem-sucedida de TNBS leva ao desenvolvimento de fibrose intestinal em camundongos. A. representação do diagrama esquemático do tratamento semanal de tnbs administrado a camundongos de tipo selvagem. Imagens de B. Colon e medida de comprimentos dos dois pontos dos ratos tnbs-tratados, colhidas nas semanas 0, 2, 4, e 6 tratamento do borne-tnsb. C-D. A análise histológica dos cortes do cólon manchou com o anticorpo de anti-αsma para a ativação de miofibroblastos e de coloração azul do Tricrômico para o colagénio; barra de escala 100 μm. E. Análise de FACS para identificar células αSMA-positivas no cólon e quantificação de células αSMA-positivas. F. marcadores fibróticos e citocinas detectadas pela qPCR. Análise de G. Western blot de αsma do lisado dos dois pontos de camundongos tnbs-tratados e do controle. Esta figura modificada está sendo reutilizada com a permissão da publicação precedente9 na imunologia Mucosal, 2019 por Mathur et al. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: a fibrose do TNBS é comparável à fibrose intestinal associada à doença de Crohn. A. imagens representativas de biópsias de cólon de controle, CD ativo mostrando um aumento significativo da coloração azul Tricrômico e coloração αsma-positiva em camadas submucosas, barra de escala 50 μm. B. Análise de Western blot de expressão e quantificação de αSMA. Análise de C. qPCR de marcadores fibrótica e de cytokines. Esta figura modificada está sendo reutilizada com a permissão da publicação precedente9 na imunologia Mucosal, 2019 por Mathur et al. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: o tratamento com rapamicina melhora efetivamente a fibrose induzida por TNBS. Análise histológica de A. Colon-imagens representativas da coloração de Miofibroblasto com anticorpo anti-αsma e coloração de colágeno com azul de trichrome, barra de escala 100 μm. B. qPCR análise de αsma, colágeno e TGFβ expressão em controle/ Os dois pontos de rato tratados com TNBS. Análise de C. FACS de αsma na única suspensão da pilha dos dois pontos do rato tratados com controle/tnbs. D. Schematic para a purificação de Cx3Cr1+ Cells da fração Colônica do própria do lamina e da análise de FACS de pilhas purified. Análise de e. Western blot de níveis de p-P70 e de p-S6 em fagócitos Cx3Cr1 + mononucleares purificados dos ratos tratados com tnbs e/ou Rapamycin. Análise de F. qPCR da expressão em fagocitos Cx3Cr1 + mononucleares purificados, que produz Il-23 e Il-1 β. Esta figura modificada está sendo reutilizada com a permissão da publicação precedente9 na imunologia Mucosal, 2019 por Mathur et al. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Cicatrização de feridas ou reparação tecidual é um processo biológico rigorosamente regulado17. Durante a lesão tecidual com uma condição química, mecânica e de infecção, uma resposta inflamatória desencadeia o processo de reparo tecidual. No entanto, uma resposta inflamatória disregulada e patológica leva ao desenvolvimento de cicatrizes ou a uma reação fibrótica, o que pode prejudicar a função de reparo tecidual9,18,19. Aqui, mostramos o procedimento para o modelo animal de fibrose induzida por TNBS, que compartilha significativamente a fisiopatologia com a doença de Crohn humana. A inoculação sucessiva da exposição química do TNBS para danificar o epitélio do camundongo provoca ulcerações profundas e induz o desenvolvimento da fibrose. Com um confiável, baixo custo, e rápida indução do início da doença, este método é amplamente aceito por vários grupos de pesquisa envolvidos em estudos de lesão tecidual, inflamação transmural e do eixo do intestino-cérebro.
Para implementar com sucesso o modelo de fibrose TNBS, existem várias etapas essenciais. Por exemplo, a dosagem e o sincronismo adequados da administração de TNBS são muito importantes. Uma inoculação de 6-8 semanas do tnbs permite A ulceração profunda do tecido e é altamente-recomendado para estudos fibrótica crônicos. O tamborete de Outcoming dos ratos e o reflexo retrógrado de TNBS inoculados são dois problemas principais, que poderiam conduzir à entrega de doses variáveis aos ratos. A pressão suave perto do reto de camundongos pode ajudar a liberar fezes antes da administração de TNBS. Segurando a cabeça do animal para baixo por alguns segundos dramaticamente ajuda a parar o refluxo reverso de TNBS. Manter os ratos em uma gaiola, colocando a gaiola em uma almofada de calor, e fornecendo os ratos com néctar de Napa também poderia ser estratégias úteis na prevenção de alta mortalidade.
Aqui, nós igualmente discutimos a inflamação do intestino durante a fibrose de tnbs e seu impacto na resposta fibrótica. o papel de mTOR/Autophagy é implicado extensamente na homeostase intestinal e na patogénese20,21de IBD. Nós identificamos que a sinalização de mTOR/Autophagy é crítica para modular respostas pro-inflammatory das citocinas IL-23 e IL1β dos fagócitos mononucleares de Cx3Cr1+ que afetam a linha central pro-fibrotic Il-23/Il-22 (Figura 3A)9 . Desse modo, as únicas pilhas Cx3Cr1+ mononucleares de purificação para o de e a expressão de gene são uma etapa crítica do modelo. Nós discutimos em detalhe o protocolo para isolar o própria do lamina e fornecemos o procedimento da purificação para Cx3Cr1+ pilhas mononucleares usando grânulos magnéticos.
Coletivamente, apesar da presença de modelos genéticos e espontâneos para a doença de Crohn, TNBS-colite continua a ser uma potente ferramenta para estudar a imuno-patogénese da DC e tem o potencial para avaliar os tratamentos de fibrose de Crohn. A maior limitação do uso de modelos de fibrose induzida quimicamente como TNBS é a chance de alta variabilidade do usuário ao usuário e a possibilidade de outliers nos dados. Um tamanho amostral de 5-8 animais por grupo, juntamente com uma maior experiência do usuário, pode aumentar a consistência do modelo. Entretanto, encontrar um modelo genético apropriado que causa a fibrose espontânea de Crohn é e será garantido sempre.
Disclosures
Interesses concorrentes: os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por NIH Grant R01NS093045 (YH), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), e The Crohn ' s & colite Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (RM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
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