Summary
In questo studio, descriviamo una procedura dettagliata di fibrosi intestinale mediata da TNBS, che presenta una fifisiopatologia paragonabile alla fibrosi di Crohn. Discutiamo anche di questo approccio alla luce della rapamicicina ha facilitato gli effetti inibitori sulla fibrosi intestinale.
Abstract
Studi significativi sono stati effettuati per comprendere la gestione efficace della fibrosi intestinale. Tuttavia, la mancanza di una migliore conoscenza della fibrosi ha ostacolato lo sviluppo di un farmaco preventivo. In primo luogo, trovare un modello animale adatto è difficile comprendere il meccanismo della patologia della fibrosi intestinale associata a Crohn. Qui, abbiamo adottato un metodo efficace in cui l'esposizione chimica TNBS ai rettori dei topi produce ulcerazione sostanzialmente profonda e infiammazione cronica, e i topi sviluppano quindi cronicamente la fibrosi intestinale. Inoltre, descriviamo una tecnica in cui un'iniezione di rapamicina mostra effetti inibitori sulla fibrosi mediata da TNBS nel modello murino. Per valutare il meccanismo sottostante della fibrosi, discutiamo metodicamente una procedura per purificare le cellule Cx3Cr1 dalla lamina propriativa dei topi trattati e di controllo tatuati dalla TNBS. Questo protocollo dettagliato sarà utile per i ricercatori che stanno studiando il meccanismo della fibrosi e spianare la strada per trovare una migliore invenzione terapeutica per la fibrosi intestinale associata a Crohn.
Introduction
La disregolazione dell'omeostasi immunitaria nell'intestino porta all'infiammazione patogena ed è stata ampiamente conosciuta per causare malattie infiammatorie intestinali (IBD)1,2. La fibrosi intestinale è una conseguenza cronica di malattie infiammatorie intestinali (IBD), come la malattia di Crohn (CD)3. La fisiofisiologia irreversibile di CD include stenosi intestinale o stenosi della fibrosi, che limita le opzioni di trattamento, e senza farmaci attualmente disponibili, l'unico trattamento è la chirurgia. In definitiva, lo sviluppo di terapie efficaci per contrastare l'infiammazione inappropriata è molto necessario per studiare il meccanismo del CD, e questo ci porterà un passo più vicino a questo.
Una varietà di modelli di topo genetici sono disponibili per studiare IBD tra cui IL10 KO, SAMP/Yit e adottivo CD45-RB trasferimento cellulare ad alta in topi SCID4,5,6. Qui, mostriamo la procedura per la fibrosi mediata da TNBS nel modello murino di CD, che è paragonabile alla patologia della fibrosi umana di Crohn. Il modello indotto da TNBS presenta alcuni vantaggi. Questo modello è tecnicamente semplice; l'insorgenza della malattia è rapida, poco costosa e potrebbe essere ampiamente utilizzata in diversi animali (ad esempio, topo, ratto e cavia7). La co-sottrazione di etanolo e TNBS (2,4,6-trinitrobenzene acido solfonico) danneggia bruscamente la barriera intestinale ed espone la proteina del tessuto del colon a TNBS e suscita risposte immunologiche sostanziali8,9. L'esposizione ripetuta di TNBS porta ad un processo di riparazione iperreattivo che risponde a infiammazione e lesioni e sviluppa una reazione fibrotica nell'intestino. Così, modello di fibrosi indotta da TNBS serve ad essere un modello molto interessante per studiare la fibrosi intestinale associata a Crohn.
Inoltre, i fagociti mononucleari sono le cellule primarie che arbitrano la risposta immunitaria innata alla patogenesi e alle lesioni nell'intestino10,11,12,13. Per chiarire il meccanismo cellulare e per stabilire il ruolo dei fagocitimononucleari del modello fibrosi TNBS, mostriamo la procedura di purificazione dei fagociti mononucleari. L'analisi dellecellule Cx3Cr1 è un passo essenziale per valutare i marcatori infiammatori e determinare il meccanismo concomitante per la fibrosi intestinale. Collettivamente, questa procedura dettagliata per la fibrosi TNBS sarà utile per spiegare i meccanismi cellulari della fibrosi intestinale.
Protocol
Per questo manoscritto, tutti i campioni umani sono stati acquistati secondo il protocollo approvato dall'Institute Review Board (IRB) e dal Comitato per la ricerca umana presso l'Albany Medical College. Tutte le ricerche che coinvolgono gli animali sono state rigorosamente seguite secondo il protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Albany Medical College e dal National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals .
1. Raccolta di campioni intestinali umani
- Raccogliere campioni di tessuto umano secondo i protocolli del comitato di ricerca dell'istituzione.
- Procurare il tessuto intestinale (ileocolonico) di un paziente CD diagnosticato con fibrosi e campioni di controllo da pazienti senza storia di IBD.
- Utilizzare parte del tessuto intestinale per l'immunohistologia, un'altra parte del tessuto per l'analisi dell'mRNA e una parte finale per l'espressione proteina di geni/marcatori fibrotici e citochini.
- Per l'analisi immunoistologia, prima fissare il campione di tessuto umano in 4% paraformaldeide per almeno 48 h e poi trasferirlo in un tubo contenente 70% etanolo per almeno 16 h. Utilizzare questo tessuto fisso per fare un blocco di paraffina incorporato e tagliare il tessuto spesso 5 m sezioni utilizzando un microtoma tissutale.
- Utilizzando un pennello, stendere delicatamente ogni sezione tagliata su uno scivolo di vetro per la colorazione.
- La sezione del tessuto macchiato scorre con macchia tricromatica per rilevare la deposizione di collagene, e con la macchia di sMA per rilevare i miofibromi (vedere la sezione 3 per informazioni dettagliate sul tricromo e la colorazione di .SMA). Esaminare le sezioni colorate al microscopio luminoso.
- Elaborare un'altra parte del campione di tessuto umano ottenuto per produrre il lisa tobreo proteico per rilevare la SMA tramite macchia occidentale (vedere la sezione 7 per informazioni dettagliate sull'analisi delle macchie occidentali).
- Ottenere RNA dalla parte finale del campione di tessuto umano utilizzando un reagente di estrazione (Tabella dei materiali) e convertire l'mRNA in cDNA tramite RT-PCR.
- Analizzare i geni fibrotici e citochine da qPCR (vedere la sezione 6 per informazioni dettagliate sulla preparazione dell'mRNA).
2. Induzione della fibrosi TNBS e del trattamento con rapamici nei topi
- Effettuare ricerche sugli animali secondo i protocolli di ricerca sugli animali approvati dall'istituzione.
- Rasare topi adulti intorno alla zona del collo al fine di pre-sensibilizzare a TNBS tramite esposizione dermica. Immergere il TNBS in un tampone di cotone e quindi applicare il TNBS all'area rasata del collo del mouse.
NOTA: La pre-sensibilizzazione è un passo molto importante in quanto migliora la risposta di ipersensibilità ritardata per avviare l'infiammazione mediata da TNBS. - Otto giorni dopo la pre-sensibilizzazione, indurre la colite per somministrazione intra-rettale una volta alla settimana per sei settimane. Applicare quattro mg di TNBS (nel 25% di etanolo) utilizzando un enema di 100 ll usando una siringa da 1 mL attaccata a un catetere in poliuretano francese 3,5 e dare ai topi di controllo 100 - L del 25% di etanolo solo.
- Anestesizza i topi con pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneali) o li esponi al 2,5% di isoflurane insieme a 1 L/min di ossigeno durante la somministrazione di TNBS. Confermare l'anestesizzazione pizzicando delicatamente le dita dei pipi' e cercando un'assenza di riflesso.
- Utilizzare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre i topi sono in anestesia.
- Iniettare la rapamicina a 2 mg/kg/giorno o veicolo (5% Tween-20 e 4% di etanolo) ogni giorno feriale per 3-6 settimane, intraperitoneali, sia ai topi di controllo che a quelli trattati con TNBS.
- Utilizzare 6 settimane TNBS mice intestino per analizzare i saggi extracellulari tra cui istometria, citometria di flusso, gonfiore occidentale ed estrazione di RNA. Per raccogliere gli organi, eutanasia i topi utilizzando l'inalazione di CO2 e confermare l'eutanasia con lussazione cervicale.
- Per raccogliere gli organi, eutanasia i topi utilizzando l'inalazione di CO2 e confermare l'eutanasia con lussazione cervicale. Dopo l'eutanasia, longitudinalmente aprire il topo sul suo lato ventrale utilizzando forbici e pinze di grado chirurgico. Rimuovere l'intero colon dal retto all'area terminale dell'ilium. Trasferire rapidamente il colon a freddo ghiaccio 1x HBSS e lavare il colon utilizzando lo stesso tampone.
- Misurare e confrontare le lunghezze dei due punti del controllo e dei topi trattati con TNBS. Fare questo passo il più velocemente possibile per evitare l'essiccazione dei coloni al fine di evitare la morte delle cellule.
- Tagliare il colon a piccoli pezzi e mantenere a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio per scopi futuri (RNA/analisi delle macchie occidentali). Utilizzare un'altra parte del colon per l'analisi FACS.
- Assicurarsi di tagliare e raccogliere campioni di tessuto colonico da regioni simili del colon di entrambi gli animali di controllo e TNBS trattati con TNBS.
NOTA: si prevede una mortalità del 10%-20% con l'inoculazione di TNBS anche se con l'esperienza, il tasso di mortalità può essere significativamente ridotto.
3. Valutazione immuno-istopatologica della fibrosi intestinale
- Fissare i tessuti umani e/o topi nel 4% di paraformaldeide per 48 h, e quindi trasferire al 70% di etanolo per 16 h.
NOTA: La paraformaldeide è una sostanza chimica neurotossica, quindi evita l'inalazione; utilizzare una maschera per il viso durante l'utilizzo. - La paraffina incorpora i tessuti fissi del colon, affetta ad uno spessore di 5 m e mette direttamente i tessuti sui vetrini di vetro per l'istologia.
- Eseguire la colorazione H&E e Trichrome Blue secondo le istruzioni del produttore per rilevare il collagene.
- In breve, prima deparaffinare le sezioni sommergendo il vetrino contenente sezioni in due camere di xilene per 5 min in ogni camera.
- Risciacquare i vetrini con alcool al 100% per 1 min; ripetere questo passaggio tre volte. Risciacquare di nuovo con acqua del rubinetto per 1 min.
- Dopo di che, immergere i vetrini nella soluzione preriscaldata di Bouin a 56 s per 60 min. la soluzione di Bouin è di aspetto giallo; lavare dopo aver tolto i vetrini dalla soluzione di Bouin in acqua di rubinetto per 3 min o fino a quando i vetrini diventano incolore.
- Immergiti in vetrini nella soluzione Hematoxylin di Modified Mayer per 7 min a temperatura ambiente.
- Scivoli macchiati immergendosi in colorazione Trichrome per 5-8 min. Immediatamente, risciacquare i vetrini in acqua corrente per 5-10 s per rimuovere l'eccesso di macchie Trichrome.
- Disidratare i vetrini con alcool al 100% per 1 min. Ripetere questa procedura tre volte.
- Cancellare le diapositive con xilene per 1 min e ripetere il passaggio 3x.
- Montare diapositive con supporti di montaggio (Tabella dei materiali).
- Tenere con attenzione coverslip ad un'estremità con pinze e lasciarlo coprire l'intera sezione senza avere bolle. Se ci sono alcune bolle, rimuovere rapidamente le bolle toccando il coperchio.
- Utilizzare l'immunostaining per rilevare l'SMA.
- Bloccare le sezioni dei due punti nel buffer di blocco (0,2% Triton X-100 e 5% siero di capra normale in 1x PBS) per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare con 100 LL l di anticorpo primario diluito per la SMA (Tabella dei Materiali) sulla soluzione di scorrimento (0,2% Triton X-100 e 3% siero di capra normale in 1x PBS; anti-SMA 1:200) a 4 gradi durante la notte.
- Lavare le sezioni tre volte con 1x PBS.
- Utilizzare l'anti-tono della capra IgG (H e L) coniugato con Alexa Fluor 488 (Tabella dei materiali) come anticorpo secondario per 2 h a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni tre volte con 1x PBS.
- Utilizzare DAPI per contrastare il nucleo per 5 min.
- Lavare le sezioni tre volte con 1x PBS.
- Montare i vetrini con supporti di montaggio fluorescenti (Tabella dei materiali) e sigillare con una vetrina con smalto.
- Acquisire immagini utilizzando il microscopio confocale LSM 880 ed elaborare le immagini utilizzando il software al microscopio.
- Quantifica le immagini prendendo una media di più aree selezionate nella stessa sezione con ImageJ.
4. Isolamento della mimina intestinale e purificazione di Cx3Cr1- fagociti mononucleari
- Longitudinalmente aprire il colon in gelido Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; Tabella dei materiali) e lavare i due punti con lo stesso buffer.
- Tagliare circa 5 cm piccoli pezzi di tessuti del colon utilizzando forbici sterili in HBSS.
- Trasferire piccoli pezzi di tessuto del colon in un tubo conico da 50 mL contenente 10 mL di tampone di pre-digestione (1x HBSS con 5% FBS, 5 mM EDTA e 1 mM DTT), e agitare per 20 min a 100 rpm in un incubatore di 37 gradicentigradi 11.
NOTA: L'incubazione del tessuto colonico in 37 gradi centigradi a 100 rpm shaking condizione consente una digestione efficiente del tessuto di collagenasi e un'elevata resa di cellule vitali. - Eliminare l'epitelio colonico staccato passando attraverso un colino cellulare di 40 m.
- Raccogliere il tessuto rimanente dal colino e digerirli ulteriormente nel buffer di digestione contenente Collagenase tipo IV e DNase I (Tabella dei materiali) in 1x HBSS con 5% FBS per 20 min a 37 s a 100 rpm.
- Vorticare i tessuti digeriti per circa 20 s e passare attraverso un colino cellulare di 40 m per ottenere frazioni propria di lamina.
- Centrifugare la lamina propria frazioni per pellet giù le cellule a 700 x g in 4 gradi centigradi
- Per escludere le cellule morte dalla lamina propria utilizzare un gradiente di densità (Tabella dei materiali).
NOTA: il supporto sfumato di densità utilizzato qui (Tabella dei materiali) può causare la perdita di cellule mononucleari; tuttavia, rimuove notevolmente le cellule morte dalla preparazione, che nel complesso aumenta la purezza.- Crea soluzioni multimediali per gradienti da 100 mL ciascuna del 30% e 70%. Risospendere le cellule ottenute in 10 mL della soluzione 30% e sovrapporle a 5 mL della soluzione 70% in un tubo da 15 mL.
- Centrifugare il gradiente in condizioni senza freni a 1.000 x g e temperatura ambiente. Raccogliere la fase ad anello bianco contenente lamina proprialymphocites, che sarà tra il 30% e 70% strati gradiente.
- Lavare le cellule ottenute sospendendo nuovamente in HBSS ghiacciato e centrifugare a 500 x g, 20 s, per 10 m. Re-sospendi le cellule in FACS (fluorescence-activated cell sorting) buffer (PBS, pH 7.4, con 1% BSA e 2 mM EDTA).
- Purificare i fagociti mononucleari dalla purificazione delle cellule raccolte utilizzando perline magnetiche e/o smistature FACS.
- Depurazione magnetica
- Prima di colorare con anticorpi, primo blocco della superficie cellulare delle cellule propria di lamina incubando con anti-topo CD16/CD32 Fc bloccante per 15 minuti sul ghiaccio.
- Incubare cellule con anticorpi anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) insieme a microsfere anti-PE (Tabella dei materiali) per 30 min sul ghiaccio, per catturare le cellule legate. Lavare le celle con buffer FACS.
- Passare le cellule legate anticorpo/perline attraverso una colonna di smistamento delle cellule magnetica in un campo magnetico per rimuovere le cellule non associate. Lavare tre volte con il buffer FACS. Rimuovere la colonna dal campo magnetico e spingere lo stantuffo nella colonna per produrre le celle legate al tallone.
- Ordinamento FACS
NOTA: lo smistamento FACS può essere utilizzato al posto della purificazione magnetica. Anche se la purificazione magnetica è un metodo facile ed economico, è limitata alla sola purificazione di singole cellule, non alle sottopopolazioni di cellule. Pertanto, per isolare le sottopopolazioni di cellule, il metodo di smistamento FACS è un metodo efficace per ordinare singole cellule e sottopopolazioni di cellule.- Bloccare le celle di lamina propria con blocco CD16/CD32 Fc anti-mouse(Tabella dei materiali).
- Stacito incubando con anticorpi anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C e MHCII.
- Ordinare utilizzando un citometro di flusso FACS, gating per CD11c-CD64- CD11b- Cx3Cr1- Ly6C- celle per purificare la popolazione CX3Cr1 (P3 - P4).
- Depurazione magnetica
- Le cellule sortite di lisce per la preparazione totale dell'RNA e rilevano i marcatori citochine e fibroti (vedere la sezione 6 per la preparazione di RNA e cDNA).
- Analizza l'espressione dell'mRNA dei marcatori fibrotici e l'analisi infiammatoria della citochina dalle sospensioni isolate a singola cellula dalla purificazione magnetica.
- Per l'analisi FACS, bloccare le cellule con bloccante anti-topo CD16/CD32 Fc (Tabella dei materiali) prima della colorazione con anticorpi contro i marcatori superficiali o intracellulari.
5. Analisi della citometria di flusso
- Colorazione e analisi della superficie cellulare
- Risospendere 5-10 x 105 cellule isolate di lamina propria in 50 mL di buffer FACS (1% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7.4).
- Incubare cellule con anti-mouse CD16/CD32 (Tabella dei Materiali) ad una diluizione 1:50 per bloccare i recettori Fc sul ghiaccio per 10 min.
- Lavare le cellule con 500 tamponi FACS ghiacciati per rimuovere l'anti-CD16/CD32 non legato prima della colorazione della superficie cellulare.
- Sospensioni a celle unifamiliari con macchie superficiali (106 celle/50 mL) con anticorpi fluorescenti etichettati a 1:100 didiluizione sul ghiaccio per 30 min per valutare lamina colonica.
- Lavare due volte le cellule etichettate con 500 l di tampone FACS ghiacciato per rimuovere gli anticorpi non legati.
- Analizzare le cellule mononucleari etichettate dalla citometria di flusso. Gate for Live, quindi per FSC,SSC, seguito da CD11be Cx3Cr1 , quindi analizza altri marcatori di attivazione del macrofagio, tra cui MHCII, CD80, CD86 e CD40.
- Colorazione e analisi della citochina intracellulare
- Per la colorazione intracellulare della citochina, fissare e permeabilizzare le cellule macchiate di superficie utilizzando un kit di soluzione di fissazione/permeabilizzazione (Tabella dei materiali); seguire le istruzioni del produttore per la procedura dettagliata.
- Cancello cellule di lamina per Live, poi per FSC-SSC, seguito da CD11b, Cx3Cr1,IL23, per rilevare il livello intracellulare di citochina IL23 e CD11b, Cx3Cr1,IL1, a rilevare il livello intracellulare di citochina IL1.
- Colorazione e analisi SMA
- Lavare due volte le cellule con buffer FACS centrifugando a 200 x g e 4 gradi centigradi per 5 min per rimuovere il buffer fissativo in eccesso.
- Per determinare il livello di SMA, permeabilizzare le celle con un kit di soluzioni di fissazione/permeabilizzazione (Table of Materials).
- Incubare cellule con anticorpi anti-SMA-AF488 (Tabella dei materiali) utilizzando 1:1.000 diluizione sul ghiaccio per 30 min.
- Lavare le cellule due volte e poi fare analisi FACS. Gate for Live, FSC-SSC- seguito dal rilevamento dicelle nelle celle coloniche.
6. Isolamento dell'RNA, RT-PCR, PCR in tempo reale
- Isolare l'RNA da cellule MACS o FACS purificate o tessuto eccitato dal colon omogeneizzandoli nel reagente di estrazione (Tabella dei materiali).
NOTA: Utilizzare occhiali di sicurezza e altri dispositivi di laboratorio quando si lavora con questo reagente in quanto è un polmone e pelle irritante. Lavora in sicurezza in un cappuccio. - Aggiungete 0,5 l di glicogeno privo di RNase dalla soluzione di riserva di glicogeno a 20 g/mL (Tabella dei materiali) per migliorare il recupero dell'RNA totale prima della precipitazione dell'RNA con isopropanolo.
- Risospendere il pellet di RNA in 50 gradi l di RNase acqua libera (Tabella dei materiali) e incubare a 55 gradi centigradi per 5 min per sciogliere completamente il palato dell'RNA.
- Leggere le concentrazioni di RNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm.
- Sintetizza il cDNA usando 1 g di RNA totale e un kit di sintesi della trascrizione inversa (Tabella dei materiali).
- Analizzare l'espressione genica utilizzando 2 l di cDNA come modelli tramite PCR in tempo reale. Utilizzare un kit PCR qPCR Master Mix di 96 pozze(Table of Materials). Utilizzare i valori CT per calcolare la variazione di piegatura dell'abbondanza di RNA dopo la normalizzazione dei valori GAPDH/HPRT.
7. Gonfiore occidentale
- Tessuto colondico Lyse utilizzando il buffer di lisi RIPA (1% NP40).
- Risolvere il lisate proteico in un gel bis-Tris dell'8% a una tensione costante di 80 V.
- Trasferire la proteina gel nella membrana di nitrocellulosa in tamponare a freddo rincorrere a una corrente costante di 50 mA per 2 h a 4 gradi centigradi.
- Bloccare le regioni non specifiche sulla membrana trasferita proteina utilizzando il 5% di latte non grasso in TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) per almeno 1 h a temperatura ambiente.
- Per rilevare i livelli di SMA, incubare la membrana(e) con l'anticorpo di rilevamento primario di .SMA a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Lavare le membrane 3-4 volte utilizzando TBST in intervalli di 15 min.
- Incubare con anticorpo secondario coniugato HRP (1:10,000) nel 5% di latte non grasso in TBST.
- Sviluppare membrane utilizzando un kit di sviluppo ECL.
- Normalizza le intensità del segnale proteico con GAPDH come controllo di carico per l'analisi della densitometria.
8. Analisi statistica
- Analizzare i dati utilizzando il software di analisi dei dati di scelta confrontando tra animali selvatici e KO.
- Considerare il valore P di <0.05 come significativo (Sezione P < 0,05; .
- Utilizzare il test t di Student per testare le differenze tra due gruppi e il test ANOVA per l'analisi tra più di due gruppi.
Representative Results
Abbiamo adottato il modello murino per la colite TNBS per studiare e chiarire i meccanismi alla base della fibrosi intestinale8. In questo caso, abbiamo eseguito uno studio dettagliato del corso temporale della colite mediata da TNBS, in cui la TNBS è stata pubblicamente amministrata settimanalmente a i topi di tipo selvatico per un massimo di sei settimane come rappresentata schematicamente (Figura 1A). Dopo sei settimane di trattamento Con TNBS, abbiamo notato che le lunghezze coloniche si accorciano progressivamente nel corso del trattamento TNBS, da una media di 5 x 0,5 cm nel gruppo di controllo a 3 x 0,5 cm nel gruppo TNBS; tale analisi quantitativa della lunghezza del colon rappresenta una riduzione molto evidente della lunghezza del colon (Figura 1B). Per garantire che il modello di malattia del TNBS Crohn sia paragonabile al modello di fibrosi umana di Crohn e non fosse un artefatto correlato alla metodologia, abbiamo analizzato i marcatori fibrotici a più livelli in uno studio dettagliato del corso temporale per l'iniezione di TNBS al tipo selvaggio . L'accumulo di cellule positive alfa-liscio (SMA) e la deposizione di collagene all'interno di strati submucosali sono stati segnalati nella maggior parte delle incidenze di fibrosi ed è considerato un segno distintivo per gli eventi fibrotivi14. Abbiamo scoperto che le sezioni del colon dei topi trattati con TNBS che sono stati macchiati con la SMA ha mostrato un aumento di 4-6 volte dello strato di submucosa colonico macchiato positivamente con la sMA(Figura 1C). Inoltre, la colorazione blu Trichrome per queste sezioni ha anche mostrato un aumento di 2-4 volte, suggerendo una deposizione significativa di collagene, che convalida la fibrosi intestinale grave (Figura 1D). Abbiamo ulteriormente valutato l'attivazione dei miofibroblasti rilevando le cellule sMA-positive mediante l'analisi FACS nel colon dei topi trattati con TNBS e abbiamo trovato un accumulo significativo di colorazione positiva di SMA (Figura 1E). Inoltre, abbiamo riscontrato un'induzione sostanziale nell'espressione di SMA, Col-I e Col-III misurata dall'analisi qPCR nei topi trattati con TNBS (Figura 1F). L'aumento dell'espressione della proteina SMA nell'analisi delle macchie occidentali ha rivelato un aumento della fibrosi(Figura 1G). Nel complesso, il trattamento della cinetica TNBS offre l'opportunità di accedere alla risposta immunitaria putativa in condizioni croniche, che imita da vicino la condizione di fase cronica del CD ed è essenziale per lo sviluppo della fibrosi.
Per confrontare la fibrosi TNBS con la fibrosi associata di Crohn, abbiamo analizzato l'espressione dei marcatori di fibrosi e delle citochine nella biopsia dei tessuti freschi dall'ileo dei pazienti con CD attivo o in remissione. Sorprendentemente, abbiamo riscontrato una marcata induzione di ispessimento di strati positivi allo SMA e una maggiore deposizione di collagene, come rilevato dalla colorazione tricromatica nelle sezioni attive del CD (Figura 2A). Abbiamo anche eseguito l'analisi western blot e confermato l'induzione dell'espressione SMA in campioni di CD attivi (Figura 2B). Inoltre, abbiamo osservato un'induzione significativa dei marcatori di fibrosi, tra cui la SMA, il Col1, come rilevato dall'analisi qPCR (Figura 2C).
Successivamente, per determinare un meccanismo per limitare la fibrosi TNBS abbiamo valutato gli effetti della rapamicicina, un inibitore farmacologico dell'attività mTOR15,16. Di conseguenza, abbiamo trattato i topi sia con La TNBS che con la rapamicina e analizzato il livello di SMA e collagene nella istologia della colonologia e abbiamo mostrato la misurazione quantitativa di SMA e collagene nella densitometria trama (Figura 3A). I nostri dati suggeriscono che la rapamicina riduce la colorazione SMA-positiva nello strato submucosal e riduce la deposizione di collagene. Per convalidare e quantificare ulteriormente le risposte fibrotiche, abbiamo determinato le espressioni sMA, collagene e TGF per qPCR e l'espressione sMA per citometria di flusso nei due punti trattati tramite TNBS(Figura 3B, 3C). Abbiamo anche dimostrato che Cx3Cr1- i fagociti mononucleari inducono una risposta immunitaria infiammatoria alla lesione9. Così, volevamo vedere se la somministrazione di rapamicinegli nei topi trattati con TNBS potesse invertire gli effetti infiammatori e fibrotici. Pertanto, abbiamo purificato Cx3Cr1- fagociti mononucleari residenti dalle sospensioni coloniche a singola cellula utilizzando microsfere magnetiche (Figura 3D). Abbiamo riscontrato un aumento del livello di p-p70 e p-S6 in Cx3Cr1- fagociti mononucleari residenti dall'analisi delle macchie occidentali da topi trattati con TNBS, e questo livello è stato bloccato dalla rapamicicina (Figura 3E). Inoltre, abbiamo scoperto che il trattamento della rapamicicina smorza l'IL-23 e l'IL-1 nel gruppo trattato con TNBS (Figura 3F). Inoltre, questi risultati chiariscono il meccanismo efficace coinvolto nell'induzione della TNBS-fibrosi e hanno dimostrato che la rapamicicina attenua l'induzione della fibrosi.
Figura 1: La corretta somministrazione di TNBS porta allo sviluppo della fibrosi intestinale nei topi. A. Rappresentazione schematica del trattamento tNBS settimanale somministrato ai topi selvatici. B. Immagini del colon e misurazione delle lunghezze del colon da topi trattati con TNBS, raccolte nelle settimane 0, 2, 4 e 6 trattamento post-TNSB. C-D. Analisi istologica delle sezioni del colon macchiata con anticorpo anti-SMA per l'attivazione di miofibroblasti e colorazione blu tricromo per collagene; barra della scala 100 m. E. Analisi FACS per identificare le cellule positive SMA nel colon e la quantificazione delle cellule sMA-positive. F. Marcatori fibrotici e citochine rilevati da qPCR. G. analisi macchia occidentale della SMA da colon lismi di topi trattati tamponati e di controllo. Questa cifra modificata viene riutilizzata con il permesso della precedente pubblicazione9 in Mucosal Immunology, 2019 di Mathur et al.
Figura 2: La fibrosi TNBS è paragonabile alla fibrosi intestinale associata a Crohn. A. Immagini rappresentative delle biopsie di controllo del colon, CD attivo che mostra un aumento significativo della colorazione blu tricromatica e colorazione .SMA-positiva negli strati submucosali, barra in scala 50 m. B. Analisi occidentale dell'espressione e della quantificazione della SMA. Analisi C. qPCR di marcatori fibrotici e citochine. Questa cifra modificata viene riutilizzata con il permesso della precedente pubblicazione9 in Mucosal Immunology, 2019 di Mathur et al.
Figura 3: Il trattamento della rapamicia migliora efficacemente la fibrosi indotta da TNBS. A. Analisi istologica del colon - immagini rappresentative della colorazione del miofibroblasto con anticorpo anti-SMA e colorazione del collagene con colorazione tricromatica blu, barra della scala 100 m. B. qPCR analisi dell'espressione di I due punti del topo trattati tè tanNBS. C. FACS analisi di SMA in sospensione a cella singola dal colon del mouse trattati con Control/TNBS. D. Schematico per la purificazione di Cx3Cr1- cellule di lamina colonica propria frazione e analisi FACS delle cellule purificate. E. Analisi macchia occidentale dei livelli di p-p70 e p-S6 in fagociti mononucleari Cx3Cr1 purificati da topi trattati con TNBS e/o rapamicia. F. qPCR analisi dell'espressione in fagociti mononucleari Cx3Cr1 purificati, che produce IL-23 e IL-1. Questa cifra modificata viene riutilizzata con il permesso della precedente pubblicazione9 in Mucosal Immunology, 2019 di Mathur et al.
Discussion
La guarigione delle ferite o la riparazione dei tessuti è un processo biologico ben regolato17. Durante la lesione dei tessuti con una condizione chimica, meccanica e infezione, una risposta infiammatoria innesca il processo di riparazione dei tessuti. Tuttavia, una risposta infiammatoria disregolata e patologica porta allo sviluppo di cicatrici o una reazione fibrotica, che potrebbe compromettere la funzione di riparazione dei tessuti9,18,19. Qui, mostriamo la procedura per il modello animale fibrosi indotta da TNBS, che condivide in modo significativo la fisiopatologia con la malattia umana di Crohn. L'inoculazione successiva dell'esposizione chimica della TNBS a danneggiare l'epitelio del topo provoca ulcerazioni profonde e induce lo sviluppo della fibrosi. Con un affidabile, basso costo, e rapida induzione dell'insorgenza della malattia, questo metodo è ampiamente accettato da più gruppi di ricerca coinvolti in studi per lesioni tissutali, infiammazione transmurale e l'asse intestino-cervello.
Per implementare con successo il modello di fibrosi TNBS, ci sono diversi passaggi essenziali. Per esempio, dosaggio adeguato e tempi di somministrazione TNBS sono molto importanti. Un 6-8-8-settimana inoculazione TNBS permette ulcerazione del tessuto profondo ed è altamente raccomandato per gli studi fibrotici cronici. L'uscita delle feci dai topi e il riflesso retrogrado del TNBS inoculato sono due problemi principali, che potrebbero comportare la somministrazione di dosi variabili ai topi. Una leggera pressione vicino al retto dei topi può aiutare a rilasciare gli sgabelli prima della somministrazione di TNBS. Tenendo la testa dell'animale verso il basso per alcuni secondi aiuta drammaticamente a fermare il reflusso inverso di TNBS. Mantenere i topi in una gabbia, posizionare la gabbia su un termoma e fornire ai topi il nettare Napa potrebbe anche essere utile strategie per prevenire un'elevata mortalità.
Qui, discutiamo anche l'infiammazione intestinale durante la fibrosi TNBS e il loro impatto sulla risposta fibrotica. il ruolo mTOR/autofagia è ampiamente implicato nell'omeostasi intestinale e nella patogenesi iBD20,21. Abbiamo identificato che la segnalazione mTOR/autofagia è fondamentale per modulare le risposte pro-infiammatorie da CItochine IL-23 e IL1 - da Cx3Cr1- fagociti mononucleari che influenzano l'asse PRO-fibrotico IL-23/IL-22 (Figura 3A)9 . Di conseguenza, purificare singole cellule Cx3Cr1- mononucleari per l'immunoprofilatura e l'espressione genica è una fase critica del modello. Discutiamo in dettaglio il protocollo per isolare la lamina propriamente e forniamo la procedura di purificazione per le cellule mononucleari Cx3Cr1- mononucleari utilizzando perline magnetiche.
Collettivamente, nonostante la presenza di modelli genetici e spontanei per la malattia di Crohn, la cotosi di TNBS rimane uno strumento potente per studiare l'immuno-patogenesi del CD e ha il potenziale per valutare i trattamenti fibrosi di Crohn. La principale limitazione dell'utilizzo di modelli di fibrosi chimicamente indotti come il TNBS è la possibilità di un'elevata variabilità da utente a utente e la possibilità di outlier nei dati. Una dimensione del campione di 5-8 animali per gruppo insieme a una maggiore esperienza utente può aumentare la coerenza del modello. Tuttavia, trovare un modello genetico adatto che causa fibrosi spontanea di Crohn è e sarà sempre giustificato.
Disclosures
Interessi concorrenti: gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01NS093045 (Y.H.), dalla niH K08DK088950 (X.Z.), da R03DK099566 (X.z.), e dalla Crohn's & Colitis Foundation of America research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
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