Methodenartikel

Generierung von ventrikulären HiPSC-abgeleiteten Cardiomyozyten und hochwertigen Zellpräparaten für die Calciumhandling-Charakterisierung

DOI:

10.3791/60135

⸱

17. Januar 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben und validieren wir eine Methode, um konsequent robuste humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten zu erzeugen und ihre Funktion zu charakterisieren. Diese Techniken können bei der Entwicklung mechanistischer Einblicke in Signalwege helfen, eine Plattform für groß angelegte Arzneimittelscreenings bieten und Herzkrankheiten zuverlässig modellieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) stellen eine wertvolle menschliche Quelle für die Untersuchung der grundlegenden Wissenschaft der Kalzium - Ca2+Handhabungs- und Signalwege sowie Hochdurchsatz-Medikamentenscreening und Toxizitätstests. Hierin bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Methoden zur Erzeugung hochwertiger iPSC-CMs, die molekulare und funktionelle Eigenschaften über verschiedene Zelllinien hinweg konsistent reproduzieren können. Darüber hinaus wird eine Methode beschrieben, um ihre funktionelle Charakterisierung durch die Bewertung der Ca2+-Handlingeigenschaften zuverlässig zu bewerten. Niedrige Sauerstoffwerte (O2), Laktatauswahl und längere Kulturzeit erzeugen hochreine und hochwertige ventrikuläre Kardiomyozyten. Ähnlich wie isolierte adulte Rattenkardiomyozyten (ARCMs) weisen 3 Monate alte iPSC-CMs eine höhere Ca 2+-Amplitude, eine schnellere Aufnahmerate von Ca2+ (Decay-Tau) und eine positive lusidrope Reaktion auf die adrenerge Stimulation im Vergleich zu Tag 30 iPSC-CMs auf. Die Strategie ist technisch einfach, kostengünstig und reproduzierbar. Es bietet eine robuste Plattform, um Herzerkrankungen zu modellieren und für das groß angelegte Arzneimittelscreening, um Ca2+ umgangen von Proteinen zu zielen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) sind eine attraktive menschliche Plattform, um eine Vielzahl von Herzerkrankungen in vitro1,2,3,4,5,6,7,8zu modellieren. Darüber hinaus können iPSC-CMs für die Vorhersage von Patientenreaktionen auf neuartige oder bestehende Medikamente verwendet werden, um Trefferverbindungen zu überprüfen und neue personalisierte Medikamente zu entwickeln9,10. Trotz erheblicher Fortschritte müssen jedoch bei der Verwendung von iPSC-CMs11mehrere Einschränkungen und Herausforderungen berücksichtigt werden. Folglich wurden Methoden zur Verbesserung der Kardialdifferenzierungsprotokolle, zur Verbesserung der Effizienz und Reifung von iPSC-CMs und zur Erzeugung spezifischer Kardiomyozytensubtypen (ventrikuläre, vorgerichtliche und knotenförmige) intensiv untersucht und bereits zu zahlreichen Kulturstrategien geführt, um diese Hürden zu überwinden12,13,14,15.

Ungeachtet der Robustheit dieser Protokolle ist die Reproduzierbarkeit langer und komplexer Verfahren zur Erzielung hochwertiger Kardiomyozyten, die die gleiche Leistung und reproduzierbare Ergebnisse gewährleisten können, ein großes Anliegen bei der Verwendung von iPSC-CMs. Reproduzierbarkeit ist nicht nur beim Vergleich von Zelllinien mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen von entscheidender Bedeutung, sondern auch bei der Wiederholung zellulärer und molekularer Vergleiche derselben Zelllinie. Zellvariabilität, wie z. B. gut-zu-gut Unterschiede in der iPSCs-Dichte, kann die Herzdifferenzierung beeinflussen und eine geringe Ausbeute und schlechte Qualität von Kardiomyozyten erzeugen. Diese Zellen könnten weiterhin für Experimente verwendet werden, die keine reine Population von CMs erfordern (z. B. bei der Durchführung von Ca2+ transienten Messungen). In der Tat, bei der Durchführung elektrophysiologischer Analysen, werden die Nicht-CMs nicht schlagen, weder spontan noch unter elektrischer Stimulation, so dass es leicht sein wird, sie von der Analyse auszuschließen. Aufgrund der schlechten Qualität können iPSC-CMs jedoch veränderte elektrophysiologische Eigenschaften aufweisen (z. B. unregelmäßige Ca2+ transiente, niedrige Ca2+ Amplitude), die nicht auf ihre genetische Zusammensetzung zurückzuführen sind. Daher ist es wichtig, insbesondere bei der Verwendung von iPSC-CMs zur Modellierung von Herzerkrankungen die Ergebnisse eines minderwertigen CM nicht mit dem Psapnotyp zu verwechseln. Vor der Fortagung elektrophysiologischer Studien sind sorgfältige Screening- und Ausschlussprozesse erforderlich.

Diese Methode umfasst optimierte Protokolle zur Erzeugung von hochreinen und qualitativ hochwertigen Kardiomyozyten und zur Bewertung ihrer Funktion durch transiente Ca2+-Messungen mit einem Calcium- und Kontraktilitätserfassungs- und -analysesystem. Diese Technik ist eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, zwischen hocheffizienten und niedereffizienten iPSC-CM-Präparaten zu unterscheiden und eine physiologisch relevantere Charakterisierung menschlicher iPSC-CMs zu ermöglichen.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Experimente mit erwachsenen Rattenkardiomyozyten in dieser Studie wurden mit zugelassenen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Protokollen der Icahn School of Medicine am Berg Sinai durchgeführt. Die erwachsenen Rattenkardiomyozyten wurden von Sprague Dawley Rattenherzen nach der Langendorff-basierten Methode, wie zuvor beschrieben16,isoliert.

1. Vorbereitung der Medien

  1. Bereiten Sie hiPSC-Medien vor.
    1. Gleichgewichten Sie die Ergänzung und das Basalmedium auf Raumtemperatur (RT). Stellen Sie sicher, dass die Ergänzung vollständig aufgetaut hat. Mischen Sie 400 ml des Basalmediums und 100 ml des Zusatz- und Filters mit einem 0,22 m vakuumbetriebenen Filter. Bei 4 °C lagern und vor Gebrauch mit RT auslagern.
  2. Bereiten Sie RPMI + B27 vor.
    1. Gleichgewicht der B27 Ergänzung und das Basalmedium (RPMI 1640) zu RT. Stellen Sie sicher, dass die Ergänzung vollständig aufgetaut hat. Mischen Sie 490 ml des Basalmediums und 10 ml des 50-fachen Zusatz- und Filterfilters mit einem vakuumbetriebenen Filter von 0,22 m. Bei 4 °C lagern und vor Gebrauch mit RT auslagern.
  3. Bereiten Sie RPMI + B27 (-) Insulin vor.
    1. Gleichgewicht der B27 (-) Insulinergänzung und des Basalmediums (RPMI 1640) zu RT. Stellen Sie sicher, dass die Ergänzung vollständig aufgetaut ist. Mischen Sie 490 ml des Basalmediums und 10 ml des 50-fachen Zusatz- und Filterfilters mit einem vakuumbetriebenen Filter von 0,22 m. Bei 4 °C lagern und vor Gebrauch mit RT auslagern.
  4. Vorbereiten von Selektionsmedien (RPMI (-) Glukose + B27 + Laktat).
    1. Gleichgewicht der B27 Ergänzung und das Basalmedium (RPMI 1640 (-) Glukose) zu RT. Stellen Sie sicher, dass die Ergänzung vollständig aufgetaut ist. Mischen Sie 490 ml des Basalmediums und 10 ml des 50-fachen Zusatzes, fügen Sie 4 mM Natriumlactat in sterilem Wasser hinzu und filtern Sie mit einem 0,22 m großen vakuumbetriebenen Filter. Bei 4 °C lagern und vor Gebrauch mit RT auslagern.
  5. Bereiten Sie RPMI 20 vor.
    1. Gleichgewicht des Basalmediums (RPMI 1640) zu RT. Mischen Sie fetales Rinderserum (FBS) (20% Endkonzentration) und RPMI. Filtern Sie mit einem 0,22 m-Vakuumfilter und lagern Sie bei 4 °C. Equilibrate zu RT vor Gebrauch.
  6. Bereiten Sie Passaging-Medien vor, indem Sie den Rho-assoziierten, gewickelten Coil-haltigen Proteinkinase-Inhibitor (ROCK) (2 M Endkonzentration) hiPSC-Medien hinzufügen.
  7. Bereiten Sie D0-Medien vor, indem Sie Denk-3-Inhibitor, CHIR 99021 zu RPMI + B27 (-) Insulinmedien (10 M Endprodukt) hinzufügen.
  8. Bereiten Sie D3- und D4-Medien vor, indem Sie RPMI + B27 (-) Insulinmedien mit IWR-1 (5 'M final) mischen.
    HINWEIS: D1- und D5-Medien bestehen aus RPMI + B27 (-) Insulin. D7-Medien sind aus RPMI + B27.
  9. Vorbereiten des Sperrpuffers (2% Rinderserumalbumin [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 in phosphatgepufferter Kochsaline [PBS]): In einem 50 ml konischen Rohr 1 g BSA, 1 ml FBS, 49 ml PBS und 250 l NP-40 hinzufügen. Mischen, bis vollständig aufgelöst.

2. Herstellung von humanen embryonalen Stammzellen (hESC)-qualifizierten Matrix coated Plates und Coverslips

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter einer sterilisierten Gewebekulturhaube aus.

  1. TauhC-qualifizierte Matrix-Stock-Lösung über Nacht auf Eis bei 4 °C. Beziehen Sie sich auf das Produktspezifikationsblatt, um geeignete Aliquot-Volumen zu bestimmen, da dies je nach Bestand variieren kann. Bewahren Sie diese Aliquots bei -20 °C in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren auf.
  2. Um die Matrix für Beschichtungsplatten oder Glasabdeckungen zu verwenden, tauen Sie zunächst eine Aliquot von hESC-qualifizierter Matrix bei 4 °C für 30 min auf.
  3. Aliquot 24 ml kaltes Dulbecco s modifiziertes Eagle Medium (DMEM): Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F:12) In ein 50 ml konisches Rohr.
  4. Mischen Sie die kalten DMEM/F:12-Medien mit einer 2 ml Glaspipette, um die Oberfläche der Pipette abzukühlen.
  5. Mit der gleichen Pipette ca. 500 x 700 l kaltes DMEM/F:12 aufnehmen und mit der hESC-qualifizierten Matrix aliquot innerhalb des Mikrozentrifugenrohrs selbst mischen.
  6. Nach richtiger Mischung die Lösung auf das 50 ml konische Rohr mit dem kalten DMEM/F:12 übertragen und erneut mischen.
  7. Für eine Standard 6 WellPlatte, fügen Sie 1 ml dieser Mischung zu jedem Brunnen. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen vollständig abgedeckt ist. Lassen Sie die Platten bei RT unter der Gewebekulturhaube für mindestens 30 min. Auf Wunsch bei 4 °C unmittelbar nach der Beschichtung bis zu 1 Woche lagern und 30 min vor Gebrauch mit RT auslagern.
  8. Um die Platten zu verwenden, die Matrix ansaugen und durch entsprechende Medien ersetzen. Sofort verwenden.
  9. Bewahren Sie die Glasabdeckungen in einer sterilen Umgebung auf (z. B. in einer sterilen Gewebekulturhaube).
  10. Wischen Sie vor der Beschichtung jeden einzelnen Deckelrutsch mit 70% Ethanol ab. Sobald der Deckelrutsch trocken ist, legen Sie ihn in einen Brunnen einer sterilen 6-Well-Platte.
  11. Nehmen Sie die hESC-qualifizierte Matrixlösung mit 250 bis 300 l und geben Sie sie vorsichtig direkt auf die Mitte des Glasdeckels. Lassen Sie die Abdeckungen bei RT unter der Gewebekulturhaube für mindestens 30 min vor Gebrauch.

3. Herstellung von kleinen Molekülen

HINWEIS: Rekonstituieren Sie alle kleinen Moleküle und Wnt-Modulatoren in DMSO, sofern nicht anders angegeben.

  1. Bereiten Sie 10 mM Aliquots von je 25 L IWR-1 und CHIR 99021 vor und lagern Sie bei -20 °C.
  2. 10 mM Aliquots von je 50 L Thiazovivin (ROCK-Hemmer) rekonstituieren und bei -20 °C lagern.

4. Wartung und Passage von iPSCs

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter einer sterilen Gewebekulturhaube durch.

  1. Pflegen Sie die iPSCs in Standard 6 Wellplatten und führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch. Pflegen Sie die Zellen mit 2 ml HiPSC-Medien pro Brunnen. Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag. Halten Sie die Zellen bei 37 °C, 6%O2, 5%CO2. Durchgehen die Zellen, wenn sie zwischen 70-80% konfluent sind.
  2. Equilibrate PBS ohne Ca2+ und Mg2+ bis RT.
  3. Um den Passaging-Prozess zu starten, fügen Sie 1 ml PBS ohne Ca2+ und Mg2+ zu dem Brunnen hinzu, der durchlaufen werden muss. Inkubieren Sie bei RT für 7-10 min. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die PBS-Behandlung nicht zu einer vollständigen Dissoziation der Monoschicht geführt hat.
  4. Entfernen Sie PBS und ersetzen Sie durch 1 ml Passaging-Medien. Verwenden Sie einen Zellheber, um die Zellen sanft zu kratzen und von der Oberfläche des Brunnens zu heben.
  5. Die Zellen werden mit einer sterilen 2 ml Glaspipette mechanisch dissoziiert. Wiederholen Sie dies, bis die Zellen unter dem Mikroskop gleichmäßig in kleine Kolonien zerlegt sind.
  6. Sobald die Zellen ausreichend dissoziiert sind, fügen Sie 5 ml Passaging-Medien hinzu, um die Zellen 1:6 zu teilen. Passen Sie die Menge der passagingen Medien an, die hinzugefügt werden sollen, um dem bevorzugten Split-Verhältnis zu entsprechen.
  7. Aspirieren Sie die hESC-qualifizierte Matrix aus der hESC-qualifizierten Matrix-beschichteten Platte und ersetzen Sie sie durch 1 ml Passaging-Medien pro Brunnen. Fügen Sie 1 ml dissoziierte Zellen pro Brunnen hinzu.

5. Kardiomyozytendifferenzierung

  1. Verwenden Sie hiPSC-Linien, die gut etabliert sind (mehr als 20 Passagen) und zeigen eine homogene Morphologie, bevor Sie mit der Herzdifferenzierung beginnen.
  2. Stellen Sie sicher, dass die iPSCs etwa 70 bis 80 % konfluent sind.
  3. Waschen Sie die Zellen 1x in PBS ohne Ca2+ und Mg2+.
  4. Fügen Sie 2 ml D0-Medien (Schritt 1,7) pro Bohrkörper hinzu und übertragen Sie die Zellen zurück zum Inkubator.
  5. Nach 24 h, ersetzen Sie mit 3 ml D1-Medien pro Brunnen für 48 h.
  6. Ersetzen Sie am 3. Tag die Medien durch 2 ml D3-Medien pro Brunnen. Wiederholen Sie dies mit D4-Medien am 4. Tag.
  7. Ersetzen Sie am 5. Tag die Medien durch 3 ml D5-Medien pro Brunnen.
  8. Ersetzen Sie am 7. Tag die Medien durch 3 ml D7-Medien pro Brunnen und übertragen Sie sie mit 37 °C, 5%CO2und normalerO2-Konzentration in einen Inkubator. Ersetzen Sie die D7 -Medien (RPMI + B27) alle 2 Tage.

6. Auswahlverfahren und iPSC-CM Dissoziation

  1. Ersetzen Sie die RPMI + B27-Medien zehn Tage vor der Durchführung der Transientenmessungen ca2+ oder einer funktionstüchtigen Analyse durch 3 ml Auswahlmedien pro Brunnen für 48 h.
  2. Ersetzen Sie das Medium durch 3 ml Auswahlmedien für weitere 48 stunden.
  3. Ersetzen Sie das Medium mit 2 ml RPMI + B27-Medien pro Bohrung für 24 h.
  4. Mantel Standard 6 Brunnenplatten, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
  5. Fügen Sie 1 ml steriles 0,25% Trypsin mit EDTA zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 5 min.
  6. Mit einer 1.000-L-Pipette dissoziieren Sie die Zellen mechanisch, so dass einzelne Zellen gesehen werden können, wenn sie unter dem Mikroskop beobachtet werden.
  7. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles 15 ml konisches Rohr und fügen Sie 2 ml RPMI 20 Medien pro Brunnen hinzu. Zentrifuge für 5 min bei 800 x g.
  8. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in RPMI + B27 Medien wieder aus. Aspirieren Sie die hESC-qualifizierte Matrix von den Platten und ersetzen Sie sie durch 1 ml RPMI + B27-Medien.
  9. Mit einer 1.000 ml Pipettespitze wird das Zellpellet mechanisch dissoziiert, bis die Lösung homogen erscheint.
  10. Übertragen Sie etwa 500.000 Zellen auf jeden Brunnen. Transfer zum Inkubator für 24 h.
  11. Ersetzen Sie das Medium durch 3 ml Auswahlmedium pro Bohrung für 48 h.
  12. Ersetzen Sie das Medium durch 3 ml RPMI + B27 pro Bohrgut. Verwalten Sie Zellen in D7-Medien (RPMI + B2, die Medien alle 2 Tage wechseln, bis sie für die Funktionsanalyse bereit sind.

7. Vorbereitung von iPSC-CMs für die Durchflusszytometrie

  1. Sobald die Zellen im gewünschten Alter sind und metabolische Selektion durchlaufen haben (Abschnitt 6), waschen Sie die Zellen mit PBS ohne Ca2+ und Mg2+.
  2. 1 ml pro Bohrung Trypsin 0,25% hinzufügen und bei 37 °C für 5 x 7 min inkubieren.
  3. Pipette die Mischung 5 x 10x mit einer P1000 Spitze, um die Zellen zu singularisieren, und übertragen Sie in ein 15 ml Rohr mit 2 ml RPMI 20.
  4. Drehen Sie die Zellen bei 600 x g für 5 min.
  5. Fügen Sie dem Zellpellet 100 L Fixationslösung (4% PFA) hinzu. Fügen Sie die Lösung tropfenweise mit kontinuierlichen, sanften Wirbeln hinzu und legen Sie sie dann 15 min auf Eis.
  6. Fügen Sie 1,5 ml PBS hinzu. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und aspirieren Sie den Überstand.
  7. Fügen Sie für jedes Experiment eine ungefärbte Kontrolle pro Fixierungs-/Permeabilisierungsbedingung ein.
  8. Wiederaussetzung von Zellen in 500 l Blockierlösung (2% FBS/2% BSA in PBS mit 0,1% NP-40) für 30 min bei RT.
  9. Ohne die Blockierungslösung zu entfernen, fügen Sie den primären Antikörper MLC2V/MLC2A (5 mg/mlL) hinzu und inkubieren Sie 45 min bei RT.
  10. Waschen Mit Blockierpuffer. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation und Aspiratlösung.
  11. Sekundärantikörper Alexa Fluor 555/488(1:750) im Sperrpuffer für 45 min bei RT oder über Nacht bei 4 °C verdünnt hinzufügen.
  12. Fügen Sie 1,5 ml PBS hinzu. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation und Aspiratlösung.
  13. Resuspend-Zellen in 250 bis 300 L PBS. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die Zellen zu disaggregieren.
  14. Bereiten Sie runde Bodenrohre mit einer 35 m Nylon-Netzzellen-Siebkappe vor. Das Zellsieb mit 50 l PBS vorbefeuchten und die Röhre auf Eis stellen.
  15. Übertragen Sie die Lösung mit den disaggregierten Zellen mit den Zellsiebkappen in die runden Unterrohre. Lassen Sie die Zelllösung natürlich abtropfen oder tippen Sie den Boden des Rohres gegen eine flache Oberfläche, um eine vollständige Drainage und Sammlung der Zellen in das Rohr zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass Sie die Röhre so schnell wie möglich wieder auf Eis stellen.
  16. Spülen Sie das Zellsieb mit 250 L PBS, um Restzellen wiederherzustellen.
  17. Bewahren Sie die Rohre auf Eis und Decken mit Aluminiumfolie bis zur Strömungszytometrieanalyse.

8. Kardiomyozyten auf Glasdecken verschichten

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Umgebung aus.

  1. Bereiten Sie die Glasabdeckungen wie in den Schritten 2.10 und 2.11 beschrieben vor.
  2. Nachdem die iPSC-CMs ausgewählt wurden und im gewünschten Alter sind, führen Sie die Schritte 6.5-6.7 aus, um die iPSC-CMs zu trennen.
  3. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einer ausreichenden Menge an RPMI 20-Medien, um etwa 300.000 Zellen pro 250 l zu haben.
  4. Mit einer 2 ml Glaspipette wird das Zellpellet mechanisch dissoziiert, bis die Lösung homogen erscheint.
  5. Aspirieren Sie die hESC-qualifizierte Matrix aus den Coverlips.
  6. Mit einer 1000-L-Pipette 250 l der Lösung aus dem 15 ml konischen Rohr mischen und ziehen.
  7. Geben Sie die 250 l der Lösung langsam auf die Glasabdeckungen ab, wobei besonders darauf geachtet wird, den Bereich, in dem die hESC-qualifizierte Matrixbeschichtung vorhanden ist, nur zu ergänzen.
  8. Übertragen Sie vorsichtig auf den Inkubator und verlassen Sie über Nacht, wobei darauf zu achten, nicht zu schütteln oder die Zellen auf den Abdeckungen zu verbreiten. Am nächsten Morgen, sanft 2 ml D7 (RPMI + B27) Medien zu jedem Brunnen mit dem Coverslip hinzufügen. Wechseln Sie die Medien nach 24 h und alle 2 Tage danach.

9. Fixieren von Zellen

  1. Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende PBS-Menge mit Ca2+ und Mg2+ auf 4 °C ausgeglichen ist.
  2. Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd(PFA) Lösung in PBS mit Ca2+ und Mg2+ verdünnt und auf 4 °C ausgeglichen.
  3. Sobald die iPSC-CMs altersgerecht sind, metabolische Selektion durchlaufen haben (Abschnitt 6), und auf Deckscheiben plattiert wurden (Abschnitt 8), waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml kaltem PBS mit Ca2+ und Mg2+ pro Brunnen.
  4. Fügen Sie 1 ml kalte 4% PFA hinzu und lassen Sie die Zellen bei RT 15 min unter der Haube.
  5. Waschen Sie die Zellen mit kalten PBS, um überschüssiges PFA zu entfernen.
  6. 2 ml PBS mit Ca2+ und Mg2+ hinzufügen und bei 4 °C lagern.

10. Immunfluoreszenz Färbung

  1. Entfernen Sie PBS aus den festen Zellen, und fügen Sie 1 ml Blockierpuffer hinzu. 1 h bei RT inkubieren.
  2. Entfernen Sie den Sperrpuffer, und fügen Sie den primären Antikörper (5 mg/ml) hinzu, der im Sperrpuffer verdünnt ist. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  3. Waschen Sie 3x in PBS mit Ca2+ und Mg2+ für je 5 min.
  4. Fügen Sie sekundären Antikörper hinzu, der im Blockierpuffer 1:1.000 verdünnt wird.
  5. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen, und brüten Sie 45 min bei RT. Bewahren Sie die Aluminiumfolie für die folgenden Schritte auf.
  6. Waschen Sie 3x in PBS mit Ca2+ und Mg2+, je 5 min.
  7. Fügen Sie eine ausreichende Menge an DAPI-Arbeitslösung hinzu, um die Zellen vollständig abzudecken und 10 min bei RT zu brüten.
  8. Waschen Sie die Probe gründlich mit PBS mit Ca2+ und Mg2+, um überschüssige DAPI zu entfernen.
  9. Nehmen Sie neue Glasgbessern und fügen Sie einen Tropfen Montagemedien in der Mitte hinzu. Verwenden Sie den Trense, um die Montagemedien gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Abdeckungen mit den Zellen nach unten auf die Folien.
    HINWEIS: Zellen können 30 Tage lang gelagert werden, wenn sie vor Licht geschützt sind.

11. Bewertung von intrazellulären Ca2+ Transienten

  1. Sobald die iPSC-CMs mindestens 3 Monate alt sind, metabolische Selektion durchlaufen haben (Abschnitt 6), und auf Decklippen plattiert wurden, behandeln Sie sie mit 2 l Fura-2, AM (Endkonzentration: 1 m) und 10 min bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Fura-2 ist lichtempfindlich. Führen Sie alle Ladevorgänge und Experimente im Dunkeln durch.
  2. Bereiten Sie das Kalzium- und Kontraktilitätserfassungs- und -analysesystem vor.
    1. Schalten Sie das System ein, um sicherzustellen, dass die Lichtbogenlampe initiiert wird (Abbildung 1B).
    2. Legen Sie die Kammer auf das System und schließen Sie die Rohre von der Pumpe an die entsprechenden Ein- und Ausgänge und den elektrischen Draht vom Stimulator an die Kammer an, wie in Abbildung 1Cdargestellt.
    3. Füllen Sie das Perfusionsrohr, das durch den flüssigen Inline-Heizer läuft, mit 37 °C vorgewärmter Tyrodes Lösung.
    4. Passen Sie die Blendenbemaßen der Kamera und des Rahmens an, um den Hintergrundbereich zu minimieren.
  3. Montieren Sie einen Glasdeckel mit iPSC-CMs in die Kammer und befestigen Sie.
  4. Fügen Sie die Lösung von Tyrode vorsichtig mit 500 l der Tyrodes-Lösung direkt auf die befestigte Glasabdeckung und beginnen Sie, die Kammer (1,5 ml/min) mit der Tyrodes Lösung zu durchdringen.
  5. Pace iPSC-CMs mit 1 Hz Feldstimulation mit dem elektrischen Stimulator (10 V, 4 ms).
  6. Inkubieren Sie iPSC-CMs in der Kammer mit Stimulation für mindestens 3-5 min für die Zellen, um den Fura-2 Farbstoff zu waschen und sich an die Umwelt anzupassen und den Fluoreszenzfarbstoff auszuwaschen.
  7. Passen Sie das Sichtfenster auf den linken oberen Bereich des Glasdeckels an.
  8. Beginnen Sie mit der Aufnahme.
  9. Nachdem Sie einen konsistenten Stream von 5-10 Peaks gesammelt haben, klicken Sie auf Pause, um die Aufnahme vorübergehend zu beenden.
  10. Stellen Sie sicher, dass weder der Fokus noch die Abmessungen des Sichtfensters verändert werden, verschieben Sie die Bühne des Mikroskops in den angrenzenden Bereich, bewegen Sie sich zum entgegengesetzten Ende, und nehmen Sie die Aufnahme fort.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 11.9 und 11.10, um über den Coverslip zu scannen, zunächst nach links zu bewegen, dann im Zick-Zack-Bereich nach unten, um den gesamten Coverslip-Bereich abzudecken. Diese besteht aus 80 bis 100 Messungen pro Deckslip.
    HINWEIS: Beschränken Sie die Gesamtmesszeit auf 10 min, da sekundäre Faktoren zu einer Abnahme der Ca2+ transienten Führen.
  12. Sobald die Ca2+ Transienten erfasst sind, analysieren Sie die Daten mit der Fluoreszenz-Spurenanalyse-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das in Abbildung 1A beschriebene Protokoll erzeugte hochreine Kardiomyozyten, die mit der Zeit in der Kultur einen ventrikulären/erwachsenen-ähnlichen Phänotyp erwerben. Wie durch Immunfluoreszenzfärbung für die atrialen und ventrikulären Myosin-Regulatorischen Lichtketten-2-Isoformen (MLC2A bzw. MLC2V) beurteilt, war die Mehrheit der durch dieses Protokoll erzeugten Zellen mlC2A-positiv an Tag 30 nach Induktion der herzkargen Differenzierung, während MLC2V in viel niedriger...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische Schritte für die Verwendung menschlicher iPSC-CMs als experimentelle Modelle sind: 1) Erzeugung hochwertiger Kardiomyozyten (CMs), die die konsistente Leistung und reproduzierbare Ergebnisse gewährleisten können; 2) die Zellen in kulturreif für mindestens 90 Tage reifen lassen, um ihren Phänotyp angemessen zu bewerten; 3) Durchführung elektrophysiologischer Untersuchungen, z. B. transiente Kalziummessungen (Ca2+),um eine physiologisch relevante funktionelle Charakterisierung menschlicher iPSC-CMs zu ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch den AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.) unterstützt; Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 und AHA 18TPA34170460 (C.K.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-Aktin, α-Antikörper der glatten Muskulatur, Maus monoklonalSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 Ziege Anti MausInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 Ziege Anti KaninchenInvitrogenA21428
B27 SupplementGibco17504-044
B27(-) Insulin SupplementGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI NuklearfärbungThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutamin + 15mM HepesGibco11330-032
Double Ended Cell Lifter, Flat Blade und J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 WellCorning353046
Fluidische Inline-Heizungfür lebende ZellenIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC-qualifizierte MatrixCorning354277Matrigel Matrix
hPSC-MedienGibcoA33493-01StemFlex Basalmedium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Bildgebungskammer für lebende ZellenLebendzellinstrumentEC-B25
MLC-2A, monoklonale Maus-AntikörperSynaptische Systeme311011
Myozyten-Calcium- und KontraktilitätssystemIonoptixISW-400
Myosin-Leichtketten-2-Antikörper, Kaninchen polyklonal (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Einwegfiltereinheiten mit PES-MembranThermoFisher124-0045
PBS mit Calcium und MagnesiumCorning21-030-CV
PBS ohne Calcium und MagensiumCorning21-031-CV
Premium Glas DeckgläserLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-Glukose (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Natrium-L-LactatSigma AldrichL7022
StemFlex SupplementGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Trypsin-EDTA (0,25%)ThermoFisher25200056
Tyrode's LösungBoston BioproductsBSS-355wStellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 1,2 mM Calciumchlorid hinzu
Instrument

Referenzen

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