Hier wird ein Protokoll zur Verwendung von Alginat als Polymer bei der Mikroverkapselung von verewigten Zellen zur langfristigen Lieferung von Biologika an Nagetieraugen vorgestellt.
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Methodenartikel
Gekapselte Zelltechnologie für die Lieferung von Biologika an das Mausauge
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Viele aktuelle Therapeutika in Der Entwicklung für Erkrankungen der hinteren Pol des Auges sind Biologika. Diese Medikamente müssen häufig verabreicht werden, in der Regel über intravitreale Injektionen. Verkapselte Zellen, die das Biologische der Wahl exzessiver exzessiver exzessierend sind, werden zu einem Werkzeug für die lokale Proteinproduktion und -freisetzung (z. B. durch langfristige Medikamentenabgabe). Darüber hinaus verwenden Verkapselungssysteme durchlässige Materialien, die die Diffusion von Nährstoffen, Abfällen und therapeutischen Faktoren in und aus Zellen ermöglichen. Dies geschieht, während die Zellen aus dem Wirt Immunantwort maskiert, Vermeidung der Notwendigkeit der Unterdrückung des Wirts-Immunsystem. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Alginat als Polymer in der Mikroverkapselung gekoppelt mit dem Elektrospray-Verfahren als Mikroverkapselungstechnik. ARPE-19-Zellen, eine spontan entstehende humane RPE-Zelllinie, wurde aufgrund ihrer Lebensdauer in Langzeit-Zelltherapieexperimenten eingesetzt und wird hier zur Verkapselung und Abgabe der Kapseln an Mausaugen eingesetzt. Das Manuskript fasst die Schritte zur Zellmikroverkapselung, Qualitätskontrolle und Augenzustellung zusammen.
Einleitung
Zellbasierte Therapien stellen revolutionäre biologische Techniken dar, die in der Medizin weit verbreitet sind. Kürzlich wurden sie erfolgreich bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Augenerkrankungen und Krebs angewendet. Zelltherapien decken ein breites Spektrum von Bereichen ab, vom Zellersatz bis zur Medikamentenabgabe, und dieses Protokoll konzentriert sich auf Letzteres. Biologisch abbaubare Alginat-Mikrokapseln (MC) haben Wirksamkeit als Abgabesystem gezeigt, und sie werden immer weit verbreitet im biomedizinischen Bereich verwendet. Alginat wurde in der Mikroverkapselung aufgrund seines einfachen Gelierprozesses, der biologischen Abbaubarkeit, der ausgezeichneten Biokompatibilität und der Stabilität unter in vivo Bedingungen1,2,3,4verwendet.
Das Elektrospray-Verfahren wurde als Mikroverkapselungstechnik erfolgreich eingesetzt, um Peptide und Proteine mit Alginat (Basispolymer) und Poly-l-Ornithin (Sekundärbeschichtungspolymer) zu verkapseln. Beide Polymere sind natürlich erweise wiedergefunden und für ihre Biokompatibilitätverwendet 5,6,7. Die Hauptherausforderung bei zellbasierten Therapien ist jedoch die Unterdrückung des Wirtsimmunsystems, um Nebenwirkungen zu vermeiden, die durch immunsuppressive Medikamente verursacht werden. Die Durchlässigkeit von Alginat-Mikrokapseln gilt als geeignete Eigenschaft für die Zellverkapselung, die die Diffusion von Nährstoffen, Abfällen und therapeutischen Faktoren in und aus Zellen ermöglicht, während sie vom Wirt Immunantwort8,9,10maskiert werden.
Im Auge wurden verkapselte Zellen in klinischen Studien zur konstanten Abgabe von Biologika (d. h. Wachstumsfaktoren11,12 und Wachstumsfaktor-Antagonisten13) zur Behandlung von Retinitis pigmentosa oder altersbedingter Makuladegeneration eingesetzt. Andere Ziele wie Komplementhemmer14 werden derzeit ebenfalls in präklinischen Umgebungen untersucht.
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Protokoll
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augenheil- und Sehforschung durchgeführt und vom Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee unter der Protokoll-ID 00399 genehmigt.
1. Zellkultur
- Generieren Sie menschliche retinale Pigmentepithelzellen (ARPE-19) Zelllinie stabil das Gen der Wahl nach veröffentlichtenProtokollen 14,15.
- Pflegen Sie Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS).
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2.
- Ersetzen Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage.
- Durchfluss der Zellen nach Erreichen 70%–80% Zusammenfluss mit Standard-Gewebekultur Verfahren.
2. Zellverkapselung
- Natriumalginat mit deionisiertem (DI) Wasser für eine Endkonzentration von 2% w/v mischen und durch Filtration mit einem 0,2 m sterilen Spritzenfilter reinigen.
- Bereiten Sie die Zellen, die mit der Alginatlösung gemischt werden sollen, durch Trypsinisieren, Zentrifugieren und Waschen mit 10 mM HEPES gepufferter Salinelösung (pH = 7,4) vor. Mit einem Hämozytometer die Zellen zählen und die endgültige Zellkonzentration in Alginatlösung auf 1 x 106 einstellen.
HINWEIS: Der Verkapselungsprozess sollte in einer sterilisierten Haube ausgeführt werden. - In eine 3 ml Spritze mit Alginat und Zellen gemisch mit 3 ml 300 L L eintragen und an einer Spritzenpumpe befestigen. Die Lösung wird durch eine 30 G stumpfe Spitzennadel in ein steriles Gelierbad gepumpt, das in einem sterilen 50 ml Becher unter der Spritzenspitze bei 7 mm für eine Nadel zum Bad Sprühabstand gelegt wird.
- Das Gelierbad enthält ein Volumen von 40 ml 10 mM HEPES gepufferter Saline mit 100 mM Calciumchlorid (CaCl2) und 0,5% w/v Poly-L-Ornithin (PLO). Die PLO ist eine sekundäre Polymerbeschichtung, die je nach Denkanschutz ausgelassen oder verändert werden kann.
- Stellen Sie die Spannung und die Durchflussrate ein und halten Sie beide konstant während des Verkapselungsprozesses bei 60 mm/h Durchflussrate und 6,0 kV Anfangsspannung, um Mikrokapseln mit einer Größe von 150 m zu erzeugen.
- Schließen Sie den Clip des Anodendrahtes (rot) einer Hochspannungsgenerator-Nadelspitze an die Nadel an die Nadel an und schließen Sie den Erdungsclip (schwarz) an den Kupferdraht an, der auf halbem Weg in das Gelierbad getaucht ist. Eine Charge des Alginat+ Zellgemischs (1 ml) benötigt ca. 30 min, um die gekapselten Zellen (ca. 25.000 Mikrokapseln) vorzubereiten.
- Waschen Sie die gebildeten Mikrokapseln, die Zellen enthalten, zweimal mit Waschlösung (10 mM HEPES gepufferte Saline mit 1,5 mM CaCl2, pH = 7,4). Verwenden Sie PBS nicht zum Waschen.
- Inkubieren Sie die gekapselten Zellen mit 10% FBS-ergänzten DMEM-Medien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
HINWEIS: Verkapselungsprozessinstrumente sind in Abbildung 1dargestellt.
3. Bestätigung, dass die Kapselung die Zelllebensfähigkeit nicht beeinträchtigt
- Nach der Inkubation der gekapselten Zellen für 24 h in den Medien, bereiten Sie eine kleine Probe von 500 l (30 Mikrokapseln) für die Färbung.
- Waschen Sie die Mikrokapseln 2x mit Waschlösung (10 mM HEPES gepufferte Saline mit 1,5 mM CaCl2) und färben Sie sie für die Lebensfähigkeit mit einem Lebend/Toten-Assay-Kit.
- Bereiten Sie eine Färbemischung aus Calcein AM (Acetoxymethyl) und Ethidium homodimer-1 bei Endkonzentrationen von 2 m bzw. 4 m vor.
- 2 ml der Färbemischung in die gekapselten Zellen geben und 30–45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) brüten.
- Mit sorgfältiger Aspiration die Färbelösung ansaugen und die Mikrokapseln 2x mit der Waschlösung waschen. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskopsystem, um die gekapselten Zellen zu beobachten und abzubilden.
HINWEIS: Die Dokumentation der Verkapselung ist in Abbildung 2dargestellt.
4. Bestätigung, dass Kapseln die geeignete Größe für die Lieferung und Lieferung der biologischen
- Intravitreale Injektionen in einem Mausauge werden in der Regel mit einer 27 G stumpfen Spitzennadel (Innendurchmesser von 210 m) durchgeführt, die an einer 2,5-L-Hamilton-Spritze befestigt ist.
- Generieren Sie Kapseln im Bereich von 100 bis 200 m, verdünnen Sie sie in serumfreien Medien und ziehen Sie sie vorsichtig in die Hamilton-Spritze. PBS ist kein geeignetes Fahrzeug, da sich Alginatkapseln in PBS auflösen.
- Ausstoßen Sie langsam 1 L Tropfen mit Kapseln auf ein Mikroskopschlitten und bestimmen ihre Integrität mit einem aufrechten Hellfeldmikroskop.
- Passen Sie die Kapselgröße (siehe Schritt 2.3) an, indem Sie Spannung und Durchfluss entsprechend anpassen. Kleinere Mikrokapseln werden nichtlinear hergestellt, indem die Spannung erhöht und die Durchflussrate leicht abnimmt8. In unseren Händen erwiesen sich Kapseln mit einem Durchmesser von 150 m als am besten geeignet. Die Anpassung der Kapselgröße hängt auch davon ab, die Alginatkonzentration konstant zu halten und gleichzeitig die anderen Parameter zu ändern.
- Bewahren Sie einen separaten Satz von Zellen in Kapseln der entsprechenden Größe in serumfreiem Medium auf, um die Sekretionsmenge des gewünschten Biologikums zu bestimmen. Verwenden Sie empfindliche ELISAs oder Western Blotting, um die Konzentration der Biologika im Überstand zu bestimmen.
- Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Kapseln, die auf der Grundlage der bekannten PK/PD (Pharmakokinetik/Pharmakodynamik) des Therapeuten injiziert werden müssen. In unseren Händen erwiesen sich 10 Kapseln pro Mausauge als am wirksamsten.
5. Kapsellieferung in Mouse Vitreous
- Führen Sie intravitreale Injektionen mit einem Sezierendes Mikroskop durch. Siehe Abbildung 3 für chirurgische Einrichtung und Materialien, die während des Eingriffs verwendet werden. Ein detailliertes Protokoll für intravitreöse Injektionen kann an anderer Stelle gefunden werden16.
- Anästhesisieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Xylazin und Ketamin (20 mg/kg und 80 mg/kg) oder anderen bevorzugten Anästhetika, die vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss der jeweiligen Institution zugelassen wurden. Stellen Sie die entsprechende Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenzange17sicher.
- Delatetiere die Maus-Pupillen mit Phenylephrin-HCL (2,5%) und Atropinsulfat (1%) um eine gute Sichtbarkeit der Glaskammer zu ermöglichen und ein Schmierauge Augengel auf die Augen aufzutragen, um sie während des Eingriffs hydratisiert zu halten.
- Punktieren Sie die Sklera am Limbus mit einer 26 G Nadel als Führungsloch, stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in einem 45°-Winkel mit Dem Auge und Tisch befindet und 2) die abgeschrägte Spitze nach oben zeigt, um eine Punktion der Linse zu vermeiden.
- Injizieren Sie die Kapseln vorsichtig mit einer 27 G stumpfen Spitzennadel, die bei sichtweiser Inspektion an einer Hamilton-Spritze in einem 45°-Winkel befestigt ist, und vermeiden Sie es, die Linse mit der Nadel zu berühren. Eine Verletzung der Linse führt zur Kataraktbildung. Die Kapseln sollten im Glaskörper mit dem Sezieren des Mikroskops sichtbar sein (Abbildung 4A).
- Nach dem Zurückziehen der Nadel, behandeln Sie die Injektionsstelle mit antibiotischen Salben Neomycin und Polymyxin B Sulfate zusätzlich zu Dexamethason ophthalmologische Antibiotika Salbe.
- Anwendung goniotaire hypromellose demulcent ophthalmologische Lösung (2.5%) beiden Augen, um zu verhindern, dass die Hornhäuten während der Erholungsphase austrocknen.
- Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen bei 37°C gehalten und überwachen, bis vollständig wach.
- Eine erfolgreiche Injektion von gekapselten ARPE-19-Zellen sollte das Vorhandensein intakter Kapseln in der Glaskörperkammer der Maus mit nur geringen Mengen an Schmutz bei der Abbildung des Auges durch optische Kohärenztomographie oder andere Methoden offenbaren (Abbildung 4B).
- Das injizierte Mausauge ist nach einigen Tagen der Genesung aufgrund der Operation nun bereit für das experimentelle Paradigma.
HINWEIS: Die chirurgische Einrichtung und Dokumentation von Kapseln im Auge sind in Abbildung 3 bzw. Abbildung 4dargestellt.
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Ergebnisse
ARPE-19-Zellen sind eine spontan verewigte menschliche RPE-Zelllinie, die nachweislich bei der Implantation von Kapseln in das Auge verkapselt und langfristig überleben kann. Die Werkzeuge für die Alginatverkapselung sind in Abbildung 1dargestellt. In dieser Studie wurde gezeigt, dass bei der Verkapselung in Alginat die Zellen in Alginatkapseln durch Hellfeld-Bildgebung bestätigt wurden (Abbildung 2A). An den Zellen in den Kapseln wurden livetote Tests durchgefü...
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Diskussion
Diese Zellverkapselungstechnik ist relativ schnell und einfach durchzuführen. bestimmte Punkte müssen jedoch im Auge behalten werden, um genaue nachgelagerte Ergebnisse zu erhalten. Zellen sollten in kulturin einer Petrischale vor der Verkapselung gehalten und bei richtiger Konfluenz gehalten werden. Die Verkapselung sollte, wenn möglich, in einer richtigen Lüftungshaube mit geregeltem Luftstrom erfolgen. Zu stark von einem Luftstrom kann die Kapselbildung beeinflussen, vor allem in Langzeitexperimenten. Sterile Utensili...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Studie wurde teilweise durch Stipendien unterstützt, die B. R. von den National Institutes of Health (R01EY019320), dem Department of Veterans Affairs (RX000444 und BX003050) und dem South Carolina SmartState Endowment gewährt wurden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3 mL Spritze | BD | 309656 | |
| 30 G 1" stumpfe Nadel | SAI Infusionstechnologie | B30-100 | |
| Alginsäure Natriumsalz, aus Braunalgen | Sigma | A0682 | |
| Atropinsulfat Ophthalmolische Lösung (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | zur Pupillenerweiterung |
| BD 1 mL Spritze 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson und Das Unternehmen | DG518105 500029609 REF 309625 | zur Erzeugung des Führungslochs |
| Calciumchlorid, wasserfrei, granulat | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | zur Befeuchtung der Augen während der Anästhesie |
| Goniotaire: Hypromellose (2,5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (steril) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | zur Befeuchtung der Augen während der Anästhesie |
| Hamilton Nadel-/Spritzenspitze: 27 G, Small Hub RN NDL, Custum Länge (12 mm), Point Style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | für die intravitreale Verabreichung von Kapseln |
| Hamilton Spritze: 2,5 & Mikro; L, Modell 62 RN SYR, NDL Separat erhältlich | Hamilton | 7632-01 | für die intravitreale Verabreichung von Kapseln |
| HEPES-Puffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| Hochspannungsgenerator | ESD EMV-Technologie | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viabilitäts-/Zytotoxizitätskit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithinhydrochlorid, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin- und Polymyxin-B-Sulfate und Dexamethason-Augensalbe | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | Antibiotikum zur Vorbeugung von Infektionen nach intravitrealer |
| Injektion Phenolephrinhydrochlorid Ophthalmolische Lösung (2,5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | zur Pupillenerweiterung |
| Natriumchlorid | Sigma | S-5886 | |
| Sterile Spritze Filter, 0,2 μ m | VWR | 28143-312 | |
| Spritzenpumpe | GRASEBY | MS16A |
Referenzen
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