Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von Schweinespaltenhornknöpfen vorgestellt. Da dieses organotypisch kultivierte Organkulturmodell innerhalb von 15 Tagen Zellsterblichkeitsraten zeigt, vergleichbar mit menschlichen Spenderhornhäuten, stellt es das erste Modell dar, das eine langfristige Kultivierung nichtmenschlicher Hornhäuten ohne Zugabe von giftigem Dextran ermöglicht.
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Methodenartikel
Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Experimentelle Forschung an hornhauten Endothelzellen ist mit mehreren Schwierigkeiten verbunden. Menschliche Spenderhornhäuten sind knapp und selten für experimentelle Untersuchungen verfügbar, da sie normalerweise für eine Transplantation benötigt werden. Endothelzellkulturen übersetzen sich oft nicht gut in In-vivo-Situationen. Aufgrund der biostrukturellen Eigenschaften nichtmenschlicher Hornhäuten führt eine stromale Schwellung während der Kultivierung zu einem erheblichen Korneal-Endothelzellverlust, der die Kultivierung über einen längeren Zeitraum erschwert. Entschwellende Mittel wie Dextran werden verwendet, um dieser Reaktion entgegenzuwirken. Jedoch, Sie verursachen auch signifikanteen Endothelzellverlust. Daher wurde ein Ex-vivo-Organkulturmodell ohne Entschwellende Mittel etabliert. Schweineaugen aus einem örtlichen Schlachthof wurden verwendet, um gespaltene Hornhautknöpfe zuzubereiten. Nach partieller Hornhauttrephination wurden die äußeren Schichten der Hornhaut (Epithel, Bogenmannschicht, Teile der Stroma) entfernt. Dies reduziert signifikant den verlustfreien Hornhautzellverlust, der durch massive stromale Schwellungen und Descemets Membranfaltung über längere Kultivierungsperioden verursacht wird, und verbessert die allgemeine Erhaltung der Endothelzellschicht. Auf die anschließende vollständige Hornhauttrephination folgte die Entfernung des gespaltenen Hornhautknopfes aus der verbleibenden Augenzwiebel und der Kultivierung. Die Endothelzelldichte wurde in Folgezeiten von bis zu 15 Tagen nach der Zubereitung (d. h. tage 1, 8, 15) mittels Lichtmikroskopie bewertet. Die verwendete Zubereitungstechnik ermöglicht eine bessere Konservierung der Endothelzellschicht, die durch eine geringere stromale Gewebeschwellung ermöglicht wird, was zu langsamen und linearen Abnahmeraten in gespaltenen Hornhautknöpfen führt, die mit menschlichen Spenderhornhäuten vergleichbar sind. Da dieses standardisierte organotypisch kultivierte Forschungsmodell erstmals einen stabilen Anbau für mindestens zwei Wochen ermöglicht, ist es eine wertvolle Alternative zu menschlichen Spenderhornhäuten für zukünftige Untersuchungen verschiedener externer Faktoren in Bezug auf ihre Wirkungen auf das Hornhautendothel.
Einleitung
Hornhauttransplantationsverfahren gehören zu den am häufigsten durchgeführten Transplantationen weltweit1. Da es einen schweren Mangel an menschlichen Spender Hornhäuten gibt, ist experimentelle Forschung zur Bekämpfung von Hornhautendothelzellen in menschlichen Hornhäuten schwierig,1durchzuführen. Die Einführung von Bewässerungslösungen und anderen im Auge verwendeten Substanzen, ophthalmologischen viskoelastischen Geräten sowie chirurgischen Instrumenten und Techniken (z. B. Phakoemulsifikationsinstrumente und -techniken, Ultraschallenergie) valide und umfangreiche Untersuchungen über ihre Auswirkungen auf das Hornhaut....
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Protokoll
Dieses Protokoll folgt den ethischen Richtlinien unserer Institution. Gemäß den Statuten des Ethikprüfungsausschusses unserer Institution musste vor den Experimenten keine ethische Genehmigung eingeholt werden, da alle Schweinehornhäuschen vom örtlichen Schlachthof bezogen wurden.
1. Orgelkultur
- Bereiten Sie Schweineaugen vor.
- Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie Schweineaugen, die kurz nach dem Mortem, aber vor der thermischen Behandlung entfernt wurden. Transportieren Sie die Augen zum Labor und verarbeiten Sie sie innerhalb weniger Stunden. Während des Transports die Augen vor der Verarbeitung bei Raumtemperatur (ca. ....
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Ergebnisse
Die vorgestellte Seziertechnik impliziert eine teilweise Entfernung von Stromgewebe, was zu einer dünneren Hornhautprobe und damit zu einer geringeren stromalen Schwellung führt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Weniger stromale Schwellungen induziert weniger Scher- und Prisenkräfte, die einen negativen Einfluss auf das Hornhautendothel haben, wodurch niedrigere Endothelzellverlustraten6verursacht werden. Ges.......
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Diskussion
Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Schweinesplit-Hornhautknöpfen, die ein standardisiertes und kostengünstiges ex vivo korneales endotheliales Organkulturmodell für Forschungszwecke darstellt6. Porcin Split Hornhautknöpfe zeigten eine Abnahme der Endothelzelldichte vergleichbar mit Endothelzellverlusten, die in menschlichen Spenderhornhäuten beobachtet wurden, die in Augenbänken über einen Zeitraum von zwei Wochen kultiviert wurden6,
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Erstellung des vorgestellten Forschungsmodells wurde von KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) des Bundesministeriums für Bildung und Forschung Deutschland unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Subject | |||
| Pig | eyes local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Deutschland | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fötales Kälberserum | Biochrom GmbH, Deutschland | ||
| Salzsäure (HCl)-Lösung | aus eigener Herstellung | ||
| Hypotone ausgewogene Salzlösung | aus eigener Herstellung | pro 1 L H2O: NaCl 4,9 g; KCl 0,75 g; CaCl x H2O 0,49 g; MgCl2 x H2O 0,3 g; Natriumacetat x 3 H2O 3,9 g; Natriumcitrat x 2 H2O 1,7 g | |
| Povidon-Jod 7,5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Deutschland | ||
| Natriumchlorid (NaCl) 0,9 | B. Braun Melsungen AG, Deutschland | ||
| Natriumhydroxid (NaOH)-Lösung | eigene Herstellung | ||
| Trypanblau 0,4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materialien & Materialien Instrumente | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Deutschland | ||
| Becherglas 50 mL | Schott AG, Deutschland | ||
| Blunt Kanüle inkl. Filter (5 & micro; m) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Zellkulturplatte (12 Well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri Pinzette | Geuder AG, Deutschland | ||
| Hornhautschere | Geuder AG, Deutschland | ||
| Eppendorf Pipette | Eppendorf AG, Deutschland | ||
| Augenlampenhalter | L. Klein, Deutschland | ||
| Augenschere | Geuder AG, Deutschland | ||
| Faltfilter & 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockeymesser | Geuder AG, Deutschland | ||
| Laborglasflasche mit Verschluss 100 mL | Schott AG, Deutschland | ||
| Magnetrührstab | Carl Roth GmbH & Co. KG, Deutschland | ||
| MillexGV Filter (5 & Mikro; m) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Nadelhalter | Geuder AG, Deutschland | ||
| Petrischalen | VWR International, USA | ||
| Pipettenspitzen | Sarstedt AG & Co., Deutschland | ||
| Skalpell (zum Einmalgebrauch), dreieckige Klinge | Aesculap AG & Co. KG, Deutschland | ||
| Serologische Pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Deutschland | ||
| Serologische Pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Deutschland | ||
| Sterile Becher | Greiner Bio-One, Ö sterreich | ||
| Sterile Handschuhe | Paul Hartmann AG, Deutschland | ||
| Steriles OP-Tuch | Paul Hartmann AG, Deutschland | ||
| Nahtschere | Geuder AG, Deutschland | ||
| Naht Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Spritze (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| Trepan & Oslash; 7,5 mm | eigene Fertigung | ||
| Bindezange | Geuder AG, Deutschland | ||
| Wiegepapier | neoLab Migge GmbH, Deutschland | ||
| Equipment & Equipment & Software | |||
| Binokulares Operationsmikroskop | Carl Zeiss AG, Deutschland | ||
| Kamera montiert am | Mikroskop Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (Software) | Olympus, Japan | ||
| Kaltlichtquelle | Schott AG, Deutschland | ||
| Inkubator | Heraeus GmbH, Deutschland | ||
| Inverses Phasenkontrastmikroskop | Olympus GmbH, Deutschland | ||
| Magnetrührer mit Heizfunktion | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Deutschland | ||
| pH-Meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Präzisionsmaßstab | Ohaus Europe GmbH, Schweiz |
Referenzen
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. I....
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Nachdrucke und Genehmigungen
